Ici, nous présentons un protocole qui facilite la caractérisation fonctionnelle à moyen à haut débit des constructions de gènes et de promoteurs dans le tissu secondaire de la tige de l’arbre dans des délais relativement courts. Il est efficace, facile à utiliser et largement applicable à une gamme d’espèces d’arbres.
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Article de méthode
L'utilisation de la Induced somatique analyse sectorielle (AISS) pour l'étude des gènes et de promoteurs impliqués dans la formation du bois et le développement de souches secondaire
Dans cet article
Résumé
Résumé
croissance de la tige secondaire dans les arbres et la formation du bois associé sont importantes à la fois du point de vue biologique et commercial. Cependant, on sait relativement peu sur le contrôle moléculaire qui régit leur développement. Cela est dû en partie à l'intégrité physique, les ressources et les limites de temps souvent associée à l'étude des processus de croissance secondaires. Un certain nombre de techniques in vitro ont été utilisées impliquant soit une partie de plante ou d'un système de la plante entière dans les deux espèces ligneuses et de plantes non ligneuses. Cependant, des questions sur leur applicabilité pour l'étude des processus de croissance de la tige secondaire, la récalcitrante de certaines espèces et l'intensité du travail sont souvent prohibitifs pour les moyennes et les applications à haut débit. Aussi, quand on regarde le développement de souches et de bois formation secondaire, les traits spécifiques visés par l'enquête pourraient ne devenir mesurable fin du cycle de vie d'un arbre après plusieurs années de croissance. Pour relever ces défis de remplacement in vivo protocoles ont été développés, nommé Induced analyse sectorielle somatique, ce qui implique la création de secteurs de tissus somatiques transgéniques directement dans la tige secondaire de la plante. L'objectif de ce protocole est de fournir un moyen efficace, facile et relativement rapide pour créer un tissu végétal secondaire transgénique pour le gène et la caractérisation fonctionnelle du promoteur qui peut être utilisé dans une gamme d'espèces d'arbres. Les résultats présentés ici montrent que les secteurs de souches secondaires transgéniques peuvent être créés dans tous les tissus vivants et les types de cellules dans les tiges secondaires d'une variété d'espèces d'arbres et que les traits morphologiques de bois ainsi que les modes d'expression de promoteur dans le secondaire tiges peut être facilement évaluée en facilitant moyenne à élevée la caractérisation fonctionnelle de débit.
Introduction
tiges Arbre comprennent une quantité importante de la biomasse et les planètes sont d'une immense importance biologique, culturelle et commerciale. tiges secondaires créent un habitat en fournissant des ressources et un abri pour de nombreuses autres formes de vie. Ils offrent de nombreux services pour les écosystèmes où ils vivent et agissent comme une ressource renouvelable pour la production de bois, de pâte et de papier et d'autres produits ligneux et non ligneux. développement de la tige secondaire, et plus particulièrement la formation du bois est régie par un système complexe moléculaire qui régulent le développement des types de cellules spécifiques, la composition biochimique de leurs parois cellulaires et la façon dont ils sont agencés pour former des tissus et des organes. Disséquer la base moléculaire du développement de la tige secondaire et la formation du bois est confondu par de nombreux facteurs, y compris la variabilité des propriétés du bois et de souches à l'intérieur et entre les tiges, les longs délais de production, hors passage des systèmes d'accouplement, haute hétérozygotie, charge génétique élevée, dormance saisonnière, longue maturepériodes d'établissement trait et la taille physique pure d'arbres matures. En conséquence, la compréhension du développement de la tige secondaire par rapport à la connaissance détaillée de la plupart des autres aspects du contrôle moléculaire du développement des plantes, est encore à ses balbutiements.
Un certain nombre de techniques in vitro ont été utilisées pour étudier et comprendre le développement de la tige secondaire, notamment le bois et la formation secondaire de la paroi cellulaire. Ces protocoles impliquent l'utilisation de la plante entière ou systèmes partiels de plantes, où soit les plantes transgéniques sont créés ou des cellules ou des tissus secondaires spécifiques sont transformés pour l'étude des aspects spécifiques du bois et / ou le développement de tige secondaire 1. Les plantes transgéniques peuvent être récupérés transformation post génétique à partir d'une grande variété de tissus végétaux et types de cellules, cependant, les progrès sont lents, en particulier lors de l'analyse des traits de fibre de bois en raison de la longue régénération et endiguer les temps de maturation (dans l'ordre des années), haute technique et deman du travailds, faible débit de gènes candidats, ainsi que des difficultés à propager certaines espèces de plantes ligneuses. Des techniques similaires ont été développés dans le système de modèle non ligneuses telles que Arabidopsis qui surmontent avec succès certaines de ces limitations, mais tous les types de cellules souches non secondaire présent dans ces tiges et traits liés à la saisonnalité ou la longévité ne peuvent pas être étudiés dans ces espèces 2. Alternativement, les systèmes de partie de plantes, telles que radiata cals les cultures Pinu 3 réduisent les délais associés. Ces méthodes sont toutefois limitées à l'étude d'un type de cellule individuelle et souffrent des contraintes similaires comme indiqué pour les expériences in vitro. De même, les cultures de souches apicale 4 impliquant explants souches entières se sont révélés prometteurs , mais encore ont pas été appliquées pour l'étude des gènes ou promoteurs d'intérêt spécifiques. Plus récemment, un protocole alternatif impliquant des cultures de racines velues a été développé pour les eucalyptus et a été avec succèsappliquée 5, cependant, cette méthode nécessite encore la culture in vitro, implique des racines secondaires plutôt que des tiges et à ce jour , il est limité à une seule espèce d'arbres.
Induite analyse sectorielle somatique (AISS), comme décrit ici, a été développé pour surmonter certains de ces problèmes pour fournir un support à haut débit outil de criblage fonctionnel pour des gènes et des promoteurs avec des rôles présumés dans la formation du bois et le développement secondaire de tissu de la tige. AISS est une transformation in vivo et le dépistage du système qui a été développé pour réduire le temps nécessaire pour produire des cellules transgéniques et des tissus dans une tige secondaire intacte tout en surmontant la main - d'œuvre, les limitations techniques et de débit de couramment utilisés dans les méthodes in vitro. Les protocoles décrits ici permettent la création simultanée de centaines de secteurs et les cellules des tissus transformés de façon indépendante dans les tiges secondaires dans un court laps de temps, dans les espèces d'arbres et de tissus d'intérêt sans gvariation Enetic et / ou environnemental dans des délais relativement courts temps et le coût du travail faible. AISS techniques in vivo ont d' abord été décrit pour la tige secondaire 6 et le bourgeon 7 tissus et ont depuis été affiné dans le tissu de tige secondaire grâce à des études de gènes et / ou des promoteurs impliqués dans la différenciation cambium et comprennent: la tubuline (TUB) 8, fascicline comme arabinogalactane ( FLA) 9, la cellulose synthase (CESA) 10, domaine nac mur associé secondaire cellule (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 et vraiment protéine intéressante nouveau gène (RING) H2 13. Ces études ont été menées dans le secondaire tiges des plantes de peupliers et d'eucalyptus et fourni un aperçu de la morphologie cellulaire, la chimie de la paroi cellulaire et l'expression des gènes.
Les protocoles décrits ici sont destinés à réunir l'expérience d'unnd connaissances acquises à travers le développement et l'application de l'AISS à partir d'une série d'études publiées et non publiées au cours de la dernière décennie. Ils se concentrent sur la transformation in vivo des tissus souches secondaires 6 et se concentrent sur des études portant sur le clone 'pyramidal de Populus alba, Eucalyptus globulus, ainsi que 11 Eucalyptus globulus x clones camaldulensis. Ce document prend les chercheurs à travers le protocole de la culture des plantes et des bactéries, la transformation des tissus de la tige, la croissance et la récolte des tissus, l'identification des cellules et des tissus transgéniques, la préparation des évaluations phénotypiques et méthodes pour la collecte et l'analyse des données. Bien que les techniques ont été appliquées avec succès pour mesurer la composition de monosaccharide de la paroi cellulaire aussi 9,11, en raison du manque d'espace, ce document se concentre sur les techniques utilisées pour la cellule de mesure et la morphologie des tissus et la compréhension des profils d'expression des gènes dans st secondaireems seulement. En conséquence, le protocole tel que décrit est adapté à ceux qui cherchent à acquérir de nouvelles informations sur le rôle et / ou l'expression de gènes liés à l'utilisation secondaire des tiges un faible coût, techniquement facile, et moyen à la méthode à haut débit.
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Protocole
1. Préparation du matériel végétal
- Avant l'expérimentation, soulever de nouvelles plantules de l'espèce à partir de graines ou de coupe d'arbres préférés et faire croître l'arbre / s jusqu'à ce que le diamètre de la tige dans la zone destinée à l'expérimentation est d'environ 1 cm de diamètre.
Remarque: Le temps nécessaire peut varier en raison des taux de croissance des plantes permettent donc de trois à neuf mois pour cette étape.
2. vecteur binaire Création
- Effectuer le travail de cette section de l' article 7 dans un laboratoire ou d'une serre où Agrobacterium tumefaciens peuvent être manipulés et que l' équipement de protection individuelle approprié prescrit pour le laboratoire est utilisé.
- Préparer un vecteur binaire contenant soit un gène d'intérêt effet de choc ou d'une cassette de surexpression et une β-glucuronidase (GUS), la cassette de gène rapporteur ou un promoteur d'intérêt fusionné à un gène GUS en fonction du type d'étude.
Note: Il y a un certain nombre de vecteur binaire backbones qui peuvent provenir du commerce ou par l'intermédiaire des réseaux de recherche ainsi que de nombreuses techniques disponibles pour insérer des gènes et des promoteurs d'intérêt dans des vecteurs binaires. Dans le cadre de ce protocole est à l'expérimentateur de prendre la décision sur la façon de créer un vecteur binaire. - Transformer vecteur binaire en une souche désarmée de A. tumefaciens par électroporation ou choc thermique 14 et de stocker de manière appropriée jusqu'à ce que nécessaire pour l' expérimentation.
- Répétez l'étape 2.2 pour tous positifs et / ou des contrôles négatifs.
Remarque: Les contrôles négatifs doivent inclure un vecteur binaire contenant aucun gène d'intérêt pour un gène d'étude d'intérêt et un GUS sans promoteur pour un promoteur d'étude d'intérêt. Contrôle positif pour un promoteur d'étude d'intérêt devrait inclure une mosaïque du chou-35s Virus promoteur (CaMV35S) fusionné à un rapporteur GUS.
3. Préparation de A. tumefaciens pour Inoculation
- Au moins une semaine avant expérimentation, prendre une petite quantité (environ 1 pi) de A. tumefaciens préparé lors de l' étape 2.2 et 2.3 et la propagation finement sur du milieu LB agar séparé avec 14 plaques contenant des antibiotiques appropriés pour la sélection bactérienne. Cultivez à 28 ° C dans un incubateur pour former de petites colonies puis stocker à 4 ° C jusqu'à leur utilisation.
- 48 heures avant l'expérimentation, transférer une colonie de A. tumefaciens de chaque plaque dans séparés 50 ml vis supérieure des tubes contenant 5 ml de (28 ° C) du milieu LB préchauffées 14 contenant des antibiotiques appropriés pour la sélection bactérienne et agiter à 200 rpm sur un incubateur agitateur pendant environ 48 heures à 28 ° C jusqu'à ce que mélange est très nuageux.
- Entre 4-6 h avant l'inoculation des tiges de plantes (section 4) ajouter 1 ml de LB / A. mélange tumefaciens dans un 50 ml frais vis tube supérieur contenant 19 ml (dilution 1:20) de frais chaud (28 ° C) du milieu LB avec des antibiotiques appropriés pourla sélection bactérienne. Si la densité optique (DO) à 600 nm (DO 600, telle que mesurée par spectroscopie) est supérieur à 0,1, diluer avec LB chaud jusqu'à ce que soit atteint.
- Placez diluée LB / A. tumefaciens mélange de retour sur l'incubateur shaker et secouer dans les mêmes conditions (200 tours par minute, 28 ° C) jusqu'à ce que la DO 600 est comprise entre 0,4-0,6 et retirer.
- Centrifugeuse LB / A. mélange tumefaciens pendant 15 min à 1000 xg et 4 ° C.
- Décanter liquide et remettre immédiatement A. tumefaciens culot dans 1 ml de milieu MS refroidi 15, transfert à 2 ml microtube et de stocker sur la glace jusqu'au moment de l'inoculation (section 4). Cette solution est appelée Ensemencement Media.
4. Inoculation de Tige avec A. tumefaciens
- Lancer l'expérimentation pendant la fin du printemps ou début de l'été en utilisant des plantes créées à l'article 1 qui ont un cambium actif et en croissance rapide. Un bon diagnostic pour uncambium actif et en croissance rapide est que le phloème peut être facilement détaché du xylème.
- Trouver une section droite claire de la tige près de la base de la plante et retirez les feuilles et les branches.
- L' utilisation d' un scalpel ( de préférence de n ° 11) ou une lame de rasoir, créer un 1 cm 'fenêtre cambium' 2 dans une section précise de la tige en introduisant deux incision verticale parallèle à travers le phloème de 20 mm de longueur et 5 mm de distance puis un coupe horizontale qui relie les deux coupes verticales à leur extrémité de base.
- Retirez la bande phloème créée par l'incision vers le haut exposant le tissu xylème développer et ajouter suffisamment Ensemencement des médias de l'étape 3.6 pour mouiller la surface du xylème en développement exposés à l'aide d'une pipette (typiquement 5-10 pi). réinsérez immédiatement la bande phloème.
- Rabattre la bande phloème à la tige étroitement avec Parafilm.
- Répéter les étapes 04.02 à 04.05 pour toutes les fenêtres cambiales supplémentaires pour le gène (s) ou promoteur (s) d'intérêt à créer unny fenêtres nouvelle cambiales moins 1 cm au-dessus ou au-dessous d'autres fenêtres du cambium et à un décalage de 90 °.
- Suivez les étapes 4.2 à 4.5 pour les vecteurs de contrôle positif et négatif (étape 2.4) veillant à ce que chaque vecteur est ajouté à la même tige de chaque plante utilisée dans l'expérience.
- Surveiller la croissance de la tige de diamètre périodiquement et la récolte pour le dosage GUS (section 5), lorsque la croissance radiale d'au moins 5 mm a été observé dans les tiges.
Note: La quantité de croissance radiale nécessaire dépend de la quantité de tissu utilisé pour l'analyse en aval.
5. récolte pour GUS histologiques Assay
- Accise la «fenêtre cambium 'de la tige enlever tout tissu ne fait pas partie de la nouvelle croissance dans la fenêtre de cambium.
- Pour les études relatives à la maturité xylème et le phloème morphologie cellulaire / tissu, peler le phloème du xylème.
- Pour les études où la zone de cambium est tenu de rester profils d'expression intactes ou promoteurs doivent être évaluered, tranche la fenêtre cambium transversalement en utilisant une lame de rasoir ou d'une autre lame tranchante en disques de entre 0,5 et 1 mm d'épaisseur.
- Placer les tissus de la fenêtre cambiales traitées dans 14 ml tubes ronds de fond et rincer deux fois dans 0,1 M de tampon phosphate à pH 7 14. Assurez -vous que le tissu est complètement immergée, reste en solution pendant au moins cinq minutes , et tout excès de solution est éliminé à la fin de le deuxième rinçage.
- Ajouter 5 ml de réactif GUS (mM X-gluc 0,5 (acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronique), 10 mM d'EDTA, 0,5% de Triton X-100 v / v, 0,5 mM de potassium ferricyanure (III), de 0,05 mM de ferrocyanure de potassium (II), complétée au volume final avec 0,1 mM de tampon phosphate pH 7; voir. Hawkins et al 16) à chaque tube. Si le tissu est pas complètement immergé, ajouter plus réactif de GUS.
- Incuber les tubes pendant 10 minutes à 55 ° C dans l'obscurité.
- Incuber les tubes pour un autre 12-16 h sur un incubateur agitateur à 37 ° C dans l'obscuritéen utilisant une agitation modérée (entre 30 et 60 tours par minute) pour permettre le mélange.
- Lors du retrait de secoueur incubateur vérifier de manière aléatoire le pH du réactif GUS dans un petit sous-ensemble de tubes en utilisant du papier de tournesol avec une gamme de pH 0-7.
- Si l'un des tubes ont un pH inférieur à 6, puis les étiqueter. Continuez à vérifier le reste des tubes pour confirmer le pH et l'étiquette si le pH est de 6 ou ci-dessous.
Remarque: Les échantillons ayant un pH inférieur à 6 peut ne pas être adapté à l'analyse. Ces échantillons doivent être exclues de l'analyse.
- Si l'un des tubes ont un pH inférieur à 6, puis les étiqueter. Continuez à vérifier le reste des tubes pour confirmer le pH et l'étiquette si le pH est de 6 ou ci-dessous.
- Décanter réactif GUS et le remplacer avec suffisamment de 70% d'éthanol pour couvrir les tissus.
- Conserver à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
6. Identification de Transgenic Tissue
- En utilisant des pinces, prendre toutes les fenêtres cambium d'un tube et placer dans un petit plateau ou boîte de Pétri pour permettre la visualisation microscopique.
- En utilisant un microscope de dissection entre 1X et 4X grossissement, identifier et compter le nombre de cellules ou de tissusqui ont une coloration bleu vif. des cellules ou des tissus colorés bleus sont appelés un secteur à partir de ce moment-là. Tally dans les voies suivantes.
- Pour les échantillons où le phloème a été éliminé (étape 5.1.1), compter le nombre de secteurs dans le tissu cambial trouvé sur la surface du xylème en développement (secteur cambium, figure 1a).
- Pour les échantillons qui ont été coupés en disques (étape 5.1.2), compter les secteurs de nombres trouvés dans les différents types de cellules ou de tissus (figure 1b, 1c, 1d). Les secteurs peuvent être trouvés dans les types de tissus suivants: le périderme (périderme secteur, Figure 1e), le phloème (phloème secteur, figure 1f), cambium Secteur parenchyme (secteur cambial, Figure 1g, 1h, 1I), parenchyme des plaies (plaies, Figure 1j) et thylles (secteur Tylose, figure 1k).
- Au cours d'un microscopeVALUATION veiller à ce que les deux côtés d'un disque ont été consultés et que les secteurs qui se produisent à travers deux disques sont appariés de sorte que les chiffres ne sont pas surestimées.
- Placez les secteurs seulement le tissu contenant dans le tube contenant 70% d'éthanol et de stocker jusqu'à ce que nécessaire.
- Répétez l'étape 6.1 à 6.3 pour toutes les fenêtres supplémentaires cambiales y compris le contrôle positif et / ou négatif.
- Calculer l'efficacité de transformation moyenne pour chaque type de secteur pour chaque gène ou promoteur d'intérêt et les commandes séparément en divisant le nombre total de secteurs par le nombre total de 1 cm 2 fenêtres cambiales pour obtenir un nombre moyen de événements de transformation par cm 2 de Cambium inoculée (ATScm -2).
- Passez à l'étape 7.2 et 8 pour l'analyse des profils d'expression de promoteur et de l'étape 7.1, 7.2 ou 7.3 pour des techniques pour évaluer la cellule et la morphologie des tissus dans les tissus du cambium.
7. AnalyseCellulaire et tissulaire Morphologie dans cambium
Remarque: Voici une sélection de techniques qui ont été utilisées avec succès pour l'analyse de l'AISS dérivée des échantillons.
- Analyse de la zone de xylème cellulaire surface de la lumière, l'épaisseur de la paroi cellulaire et la zone de la paroi cellulaire en utilisant la microscopie électronique à balayage (MEB).
Remarque: Ce protocole nécessite une préparation minimale de l'échantillon et permet de relativement haut débit d'analyse sectorielle concernant les caractères morphologiques décrits.- A partir de cette étape en avant s'il vous plaît assurer une blouse de laboratoire, des lunettes de protection et des gants sont utilisés chaque fois que le tissu ligneux est traitée et traitée.
- Identifier un secteur cambium pour l' analyse et faire une incision d' environ 0,5 mm de chaque côté de celui - ci en utilisant une seule lame de rasoir bord pour créer un disque (Figure 2a).
- Coupez le tissu xylème excès laissant environ 1 mm de tissu xylème sur le côté tangentielle du secteur (Figure 2b).
- Prudently coupée transversalement à travers le centre du secteur au moyen d' un double tranchant lame de rasoir fraîche (figure 2c).
- Faire deux incisions supplémentaires radiales peu profondes sur le plan transversal de chaque côté du secteur pour délimiter le tissu transgénique (figure 2d). Comme coloration GUS ne pénètre pas profondément dans le tissu suivre les fichiers radiales des cellules de chaque côté du tissu teinté trouvé à la surface du cambium.
- Attachez préparé le visage du secteur de cambium jusqu'au stade d'une broche MEB de montage en utilisant du ruban conducteur SEM (figure 2e) et de garder à dessiccateur jusqu'à ce que nécessaire pour la visualisation SEM.
- Répétez les étapes 7.1.2 à 7.1.6 pour tous les autres secteurs, y compris ceux du contrôle négatif.
- L' utilisation d' un SEM dans un mode de faible vide (énergie 5 kV, spot 3,0 nm), de visualiser et de prendre des photos de cellules / tissus dans le secteur ainsi que les cellules / tissus directement à côté du secteur (figure 2f). La quantité de grossissementest fonction des caractéristiques d'intérêt. Pour les fibres de xylème, 2,000X convient (Figure 2g).
- Une fois qu'un secteur de cambium a été visualisé et des photographies prises à un grossissement approprié, mesurer xylème cellules / tissus traits morphologiques d'intérêt en utilisant un logiciel de mesure d'image.
- Pour l'analyse statistique, entreprendre pairwise multiples analyses à l'aide des tests t appariés pour comparer la différence entre morphologique mesurée dans le secteur transgénique et non transgénique cellules de contrôle / tissus adjacents (mesurée à moins de 0,5 mm du bord du secteur) pour chaque secteur afin de déterminer un p -valeur.
- Répétez l'étape 7.1.10 pour le contrôle négatif.
- Dans les cas où le contrôle positif montre une valeur p faible (α <0,05), calculer la différence entre les transgéniques et les cellules non-transgéniques / tissu adjacent pour un trait morphologique. Utilisez cette «valeur de différence» dans un test t apparié pour comparer l'effet du gène d'intérêt avec le negative commande pour déterminer une valeur de p.
- analyse histochimique des modèles cellulaires cambium / morphologie de tissu ou d'expression de promoteur dans souches cellules / tissus en utilisant la microscopie optique.
Remarque: Bien que plus de temps, cette méthode permet de plus d' options d'analyse , y compris les aspects de la dynamique du cambium, par exemple, la largeur du cambium ainsi que les modes d'expression de promoteur. En outre, en cas d'impossibilité d'accéder à un SEM, ce protocole peut être utilisé comme une alternative à l'étape 7.1.- Secteur d'accise d'intérêt en utilisant une lame de rasoir et certains tissus environnants sous forme de petits blocs (pas plus de 1 mm 3) et placer directement dans 1-3 ml d'éthanol 100% dans un flacon d' échantillon avec bouchon à vis pendant au moins 2 jours à 4 ° C sur un agitateur. Préparer le petit bloc d'une manière qui permettra la surface d'intérêt à être accessible par un microtome.
- Répétez l'opération pour tous les autres secteurs, y compris ceux du contrôle négatif.
- Retirer le liquide et le remplacer par 25% d'éthanol: 75% LR mélange blanc pendant 2 jours le maintien de conditions.
- Répétez l'étape 7.2.3 avec 50% d'éthanol: 50% de blancs LR, 25% d'éthanol: 75% LR blanc et finalement deux fois avec 100% LR blanc.
- Placez petit bloc dans Incorporation Mold avec la surface d'intérêt aligné à la fin à court et à couvrir soigneusement avec LR blanc frais et polymériser selon les instructions du fabricant.
- Couper 5 um sections de la surface d'intérêt sur un microtome rotatif et monter sur une lame de verre. Utiliser la safranine O (0,01%) pour visualiser la coloration de la paroi cellulaire et / ou d'autres caractéristiques.
- Ajouter un milieu de montage, placer une lamelle et laisser reposer pendant une nuit.
- Vue sous un microscope optique entre 100X et 600X grossissement et de capture d'image.
- Capturez traits morphologiques à partir d'images en utilisant le logiciel d'image de mesure.
- Pour une analyse statistique des caractères quantitatifs morphologiques, suivre sur l'étape 7.1.10.
- Pour l'analyse qualitative des traits morphologiques,comparer et décrire les tendances observées pour le gène ou promoteur d'intérêt et le négatif et / ou contrôle positif.
- Analyse des microfibrilles Angle (MFA) en fibres macérés en utilisant la lumière Microscopy.
- Transgénique d'accise xylème tissus directement à partir d' un secteur, ainsi que du tissu non-transgénique adjacente ( à moins de 0,5 mm, la figure 2h) et dans 1,5 ml tubes séparés. Répétez l'opération pour tous les autres secteurs, y compris ceux du contrôle négatif.
- Suivez les étapes 7.3.3 à 7.3.5 dans une hotte.
- Ajouter 250 ul de peroxyde d'hydrogène et de 250 ul d'acide acétique glacial à chaque tube.
- Placer le tube dans le bloc thermique à 90 ° C pendant 2 heures dans une hotte.
- Retirer le tissu de tubes et rincer soigneusement avec de l'eau distillée au moins deux fois.
- L'utilisation d'un milieu de montage soluble dans l'eau, monter le tissu sur une lame de verre et démêler avec des pinces pointues avant l'apposition d'une lamelle.
- Vuesous une lumière des images de microscope et de capture de fibres individuelles à un grossissement supérieur à 400X.
- Pour déterminer l' angle de microfibrilles de fibres, mesurer l'angle entre les ouvertures de puits et / ou des stries de la paroi cellulaire et l'axe long de la fibre (figure 2i) en utilisant le logiciel de mesure de l' image.
- Pour l'analyse statistique, suivre sur l'étape 7.1.10.
8. Analyse de promoteur Patterns d'expression
- Analyse des promoteurs Patterns d'expression dans les tissus de la tige secondaire.
- Tally la fréquence de chaque type de secteur pour le promoteur d'intérêt ainsi que les contrôles positifs et négatifs comme indiqué à l'étape 6.2.2.
- Comparer la fréquence des différents types de secteur pour le promoteur d'intérêt avec le contrôle positif à l'aide des tests du chi carré pour établir les valeurs p. Une analyse plus poussée de la spécificité cellulaire / tissulaire peut être entreprise en utilisant l'étape 7.2 selon les besoins.
- Si plus d'un promoteurd'intérêt est étudié puis répétez cette comparaison analyse de décision entre tous les promoteurs d'intérêt et le contrôle positif.
- Si les secteurs ou la coloration au bleu sont observées dans le contrôle négatif , puis l' ajouter à l'analyse ou abandonner en fonction de l' étendue ou si la coloration endogène est suspectée (voir Discussion).
- Analyse des promoteurs profils d'expression Pendant cambial Développement Derivative and Differentiation.
- En utilisant un microscope de dissection, de visualiser tous les secteurs du cambium (Figure 1g, 1h, 1i) identifiés à l' étape 6.2 et déterminer la présence / absence de coloration au bleu en trois types dérivés du cambium de tissus; le phloème (P), le développement de xylème (X1) ou le xylème mis au point (X2) (voir figure 3a).
- Comme à l'étape 8.1.2, comparer la fréquence de la présence / absence de coloration GUS dans les régions P, X1 et X2 de promoteur d'intEREST avec le contrôle positif à l'aide des tests du chi carré pour établir les valeurs p. Une analyse plus poussée de la spécificité cellulaire / tissulaire peut être entreprise en utilisant l'étape 7.2 selon les besoins.
- Voir les étapes 8.1.2.1 et 8.1.2.2 pour des considérations supplémentaires.
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Résultats
En utilisant ce protocole tous les types de cellules souches et de tissus vivants secondaires se sont avérés être sensibles à A. tumefaciens et les transformations ont été définies dans les types de secteur en fonction du type de cellule initialement transformée et ce modèle de croissance du développement ultérieur. Types sectoriels comprennent périderme, phloème, cambium, parenchyme plaie et tylose (figure 1b, 1c, 1d) et peuven...
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Discussion
Le protocole de l'AISS est une méthode relativement simple et efficace pour la création de tissus souches transgéniques dans les espèces d'arbres en l'espace de quelques mois pour l'analyse des gènes et des promoteurs d'intérêt impliqués dans le bois et la tige formation. Peu d' efforts, au - delà de plantes garder en vie, est nécessaire pour cultiver des tissus souches transgéniques après l' inoculation , qui contraste avec les méthodes in vitro , où une vaste culture est nécessaire...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Les auteurs tiennent à souligner le soutien financier pour certains aspects du travail par le biais des subventions de liaison LP0776563 (GB, AS) et LP0211919 (GB) et des partenaires industriels Sappi et Mondi, ainsi que de l’Australian Postgraduate Award (EM) de l’Australian Research Council et du Young Innovators and Scientist Award du ministère australien de l’Agriculture (LT). Nous tenons également à remercier Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan et Simon Southerton pour les nombreuses discussions et idées qu’ils ont mises de l’avant lors de l’élaboration de ce protocole, ainsi que Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel et Noémie Defaix pour leur aide dans les travaux de laboratoire.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plantes | NA | NA Veuillez | consulter les fournisseurs de pépinières locaux pour les plantes au besoin |
| Souche Agrobacterium | NA | NA | Il existe de nombreuses façons d’obtenir des souches Agrobactrium. Nous vous suggérons de faire un suivi au sein de votre communauté de recherche locale, car il peut y avoir des restrictions dans l’obtention de la bactérie dans votre pays et votre région. |
| Vecteur binaire (gène et promoteur) | NA | NA | Nous avons développé une gamme de vecteurs pour s’adapter au protocole ISSA en utilisant un système de recombinase de passerelle. Cela inclut la surexpression, les knock-outs d’ARNi et les vecteurs de fusion de promoteurs basés sur des vecteurs pCAMBIA modifiés et heureux de fournir si nécessaire. De plus, il existe de nombreux vecteurs disponibles pour la communauté des chercheurs. |
| LB media | Sigma | L3022 | Le même produit peut provenir d’une autre société |
| LB media avec gélose | Sigma | L2897 | Un produit similaire peut provenir d’une autre société |
| Antibiotiques | Sigma | NA | Le numéro de catalogue dépendra de l’antibiotique dont vous avez besoin, car une gamme d’antibiotiques est utilisée pour la sélection bactérienne dans les vecteurs binaires. Ce produit pourrait provenir d’a ; gamme de sociétés |
| 50 ml Tubes à vis | Fisher Scientific | 14-432-22 | Le même produit peut provenir d’une autre société |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | Le même produit peut provenir d’une autre société |
| MS Media | Sigma | M9274 | Le même produit peut provenir d’une autre société |
| Lame de scalpel n° 11 | Sigma | S2771 | Le même produit pourrait provenir d’une autre société |
| Parafilm « M" | Bemis | PM996 | C’est le meilleur produit à utiliser pour lier la création de poteaux de fenêtre cambiale ; |
| Tubes à fond rond de 14 ml | Thermo Scientific | 150268 | Le même produit peut provenir d’une autre société |
| EDTA | Sigma | E6758 | Le même produit peut provenir d’une autre société |
| Triton | Sigma | X100 | Le même produit peut provenir d’une autre société |
| X-Gluc | X-GLUC direct | Vous devrez vous rendre sur le site Web pour commander - http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Ferricyanure de potassium (III) | Sigma | 244023 | Le même produit pourrait provenir d’une autre société |
| Ferrocyanure de potassium (II) | Sigma | P9387 | Le même produit pourrait provenir d’une autre société |
| Papier | Tournesol Sigma | WHA10360300 | Le même produit pourrait provenir d’une autre société |
| Lame de rasoir à simple tranchant | ProSciTech | L055 | Le même produit pourrait provenir d’une autre entreprise |
| Lame de rasoir à double tranchant | ProSciTech | L056 | Le même produit pourrait provenir d’une autre société |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | Le même produit pourrait provenir d’une autre entreprise |
| Flacon d’échantillon avec bouchon à vis | ProSciTech | L6204 | Le même produit peut provenir d’une autre société |
| Ethanol | sigma | E7023 | Le même produit peut provenir d’une autre société |
| LR white | ProSciTech | C025 | Le même produit peut provenir d’une autre société |
| Moule d’encastrement | ProSciTech | RL090 | Nous recommandons cette variété, mais il existe de nombreuses options disponibles Supports de |
| montage Water Soulable | ProSciTech | IA019 | Un exemple de support de montage qui pourrait être utilisé, mais d’autres options existent et pourraient être explorées. |
| Peroxyde d’hydrogène | Sigma | 216763 | Un produit similaire pourrait provenir d’une autre société |
| Acide acétique glacial | Sigma | A9967 | Un produit similaire pourrait provenir d’une autre société |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | Un produit similaire pourrait provenir d’une autre société |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | Il s’agit de l’instrument utilisé dans le cadre de cette étude, mais tout autre MEB doté d’un mode de vide faible peut être utilisé. | |
| logiciel | d’imagerie ImageJ peut provenir de l’URL suivante http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
Références
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- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
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- Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
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