Préparation des cellules CD4<sup&gt; +</sup&gt; Cellules T pour l&#39;analyse de GD3 et GD2 ganglioside Membrane Expression par Microscopie

Résumé

Nous décrivons un protocole anticorps coloration standard pour une utilisation en microscopie pour déterminer l'expression de la membrane et la localisation des gangliosides dans repos et les cellules T CD4 ⁺ activés humains naïfs. On décrit également des expériences de PCR en temps réel en utilisant <40.000 cellules qui ne nécessitent pas de kits supplémentaires d'ARN d'entrée faible.

Résumé

Les procédés décrits ici pour l' activation de cellules T CD4 ⁺ naïves en suspension et leur adhérence à lamelles pour une analyse par microscopie confocale permettent la localisation spatiale et la visualisation des gangliosides impliqués dans l' activation des lymphocytes T CD4 ⁺ que l' expression du complément de profilage des expériences telles que la cytométrie de flux, occidental buvard ou PCR en temps réel. La quantification de l'expression des gangliosides par cytométrie de flux et de leur localisation cellulaire par microscopie peut être obtenue par l'utilisation d'anticorps anti-ganglioside avec une haute affinité et spécificité. Néanmoins, un traitement adéquat des cellules en suspension implique le traitement des plaques de culture pour promouvoir l'adhérence nécessaire requis pour la fluorescence ou l'acquisition de la microscopie confocale. Dans ce travail, nous décrivons un protocole pour déterminer GD3 et GD2 expression de ganglioside et colocalisation avec le TCR lors de l' activation naïve de lymphocytes T CD4 ^+. Aussi, real-texpériences ime PCR en utilisant <40.000 cellules sont décrites pour la détermination de la GD3 et des gènes de synthase GM2 / GD2, ce qui démontre que les expériences d'analyse de gène peut être réalisé avec un faible nombre de cellules, et sans qu'il soit nécessaire de kits supplémentaires d'ARN d'entrée bas.

Introduction

Les cellules T CD4 ⁺ orchestrer la réponse immunitaire par l' intermédiaire de leurs fonctions effectrices après activation par les cellules présentant l' antigène ^1. L'étude des mécanismes cellulaires qui sont modulés lors de l'activation permet un aperçu d'un processus de base de la fonction immunitaire. Cependant, l'étude des cellules T CD4 ⁺ naïfs peut être compliqué , car ils représentent une très petite population de cellules dans la périphérie de sang ^2.

Grâce à la microscopie par fluorescence à plusieurs rapports ont étudié la localisation de différentes molécules....

Protocole

Le sang périphérique provenant de donneurs sains de sexe masculin a été obtenu avec le consentement éclairé et à l'approbation du Comité de bioéthique du Centro de Investigación en Dinámica Celular- Universidad Autónoma del Estado de Morelos.

1. Isolement et activation de Human Naïf cellules T CD4 ⁺

1. Recueillir 2 ml de sang périphérique provenant de donneurs humains sains grâce à un consentement éclairé et diluer avec 2 ml de solution stérile PBS-EDTA (1x tampon phosphate salin (PBS), 2 mM EDTA, pH 7,4). Ajouter le sang dilué lentement au - dessus de 3 ml d' une solution de saccharose avec une densité de 1,077....

Résultats

Le protocole décrit dans ce manuscrit rend une bonne qualité de culture et de repos adhéré et les cellules T CD4 ⁺ activés humains naïfs (figure 1). Les cellules T CD4 ⁺ activés présentent le profil proliférative caractéristique (figure 1B) par rapport à l'état de repos (figure 1A). Le marqueur de fin d'activation CD25 est utile pour évaluer l'activation efficace à 72 h observé par microscopie confocale .......

Discussion

Le protocole décrit peut être utilisé pour localiser les gangliosides ou de protéines dans des suspensions cellulaires de lymphocytes T CD4 ⁺ ou d' autres cellules du système immunitaire (par exemple, PBMC, figure 5) à partir d'un petit nombre de cellules. En raison de la petite taille des cellules T et les propriétés non-adhérentes, l'acquisition de fluorescence images microscopiques résultats dans une mauvaise information ou de faible qualité si les cellules ne sont pas.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RPMI 1640 avancé  ;	Thermo Fisher Scientific	12633-012	Complété avec 3
anticorps anti-CD3 humain	eBioscience	16-0037-81	OKT3 souris clone
anti humain Anticorps CD28	ebioscience	16-0288-81	CD28.6 souris clone
anti humain GD3  ; anticorps	Abcam	ab11779	R24 souris clone
anti humain GD2 anticorps	Santa Cruz Biotechnology	sc-53831	Clone 14G2a
FITC-conjugué anti-souris IgG3 anticorps	Abcam	ab97259
Alexa Fluor 488 anti-souris conjugué	Thermo Fisher Scieni¡ ; tific	A-21131
IgG2a anticorps anti-souris
conjugué Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scieni¡ ; tific	A-21241
IgG2a Anticorps
Hoechst 333258	Sigma-Aldrich	861405
; Ficoll Paque-Plus	GE	17-1440-02  ;
Réactif Trizol	Invitrogen	15596-026
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, humain	MACS Miltenyi Biotec	130-094-131
BD FACSAria II	BD Biosciences		Tri  ;
Nunc Lab-tek système de lames de chambre	Sigma-Aldrich	C7182
Olympus FV 1000 Microscope confocal laser (Olympus)  ;	Olympus		Upright BX61WI et IX81  ;
Amorce de séquence directe GD3 synthase	5´ ;-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ ;		Réf. 7
Amorce à séquence inverse GD3 synthase	5´ ;-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ ;		Réf. 7
Amorce de séquence directe GM2/GD2 synthase	5´ ;-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ ;		Réf. 7
Amorce à séquence inverse GM2/GD2 synthase	5´ ;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ ;		Réf. 7

 % de souris FBS