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In vitro Enregistrement de mésentérique Afférent activité nerveuse chez la souris jéjunale et Segments colique

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DOI :

10.3791/54576

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25 octobre 2016

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1Laboratory of Experimental Medicine and Pediatrics, Division of Gastroenterology, University of Antwerp, 2Visceral Pain Group, Discipline of Medicine, University of Adelaide, 3Department of Biomedical Sciences, University of Sheffield, 4Department of Pharmacy, Pharmacology and Postgraduate Medicine, University of Hertfordshire, 5Department of Gastroenterology and Hepatology, Antwerp University Hospital

Dans cet article

Résumé

Les nerfs afférents mésentériques transmettent des informations du tractus gastro-intestinal vers le cerveau concernant l’homéostasie normale ainsi que la physiopathologie. L’activité nerveuse afférente gastro-intestinale peut être évaluée en montant des segments intestinaux isolés avec des nerfs afférents attachés dans un bain d’organe, en isolant le nerf et en évaluant l’activité basale et stimulée.

Résumé

nerfs afférents transmettent non seulement des informations sur la physiologie normale, mais signalent également l'homéostasie perturbée et les processus physiopathologiques des différents systèmes d'organes à partir de la périphérie vers le système nerveux central. A ce titre, l'augmentation de l'activité ou de «sensibilisation» des nerfs afférents mésentériques a été alloué un rôle important dans la physiopathologie de l'hypersensibilité viscérale et les syndromes de douleur abdominale.

L' activité nerveuse afférente mésentérique peut être mesurée in vitro dans un segment intestinal isolé qui est monté dans un bain d'organe construit à cet effet , et dont le nerf splanchnique est isolé, ce qui permet aux chercheurs d'évaluer directement l' activité des nerfs adjacents au segment gastro - intestinal. L'activité peut être enregistrée au début du traitement dans des conditions normalisées pendant la distension du segment ou après l'addition de composés pharmacologiques ou serosally délivrés de manière intraluminale. Cette technique permet d'le chercheur d'étudier facilement l'effet des médicaments ciblant le système nerveux périphérique dans les échantillons de contrôle; en outre, il fournit des informations cruciales sur la façon dont l'activité neuronale est modifiée au cours de la maladie. Il convient cependant de noter que la mesure de l' activité de la décharge neuronale afférente ne constitue une station relais dans la neuronal complexe cascade de signalisation, et les chercheurs doivent garder à l' esprit de ne pas négliger l' activité neuronale à d' autres niveaux (par exemple, les ganglions de la racine dorsale, la moelle épinière ou du système nerveux central ) afin d'élucider pleinement la physiologie neuronale complexe dans la santé et la maladie.

applications couramment utilisées comprennent l'étude de l'activité neuronale en réponse à l'administration d'un lipopolysaccharide et l'étude de l'activité nerveuse afférente dans les modèles animaux du syndrome du côlon irritable. Dans une approche plus de translation, le segment de l'intestin de souris isolé peut être exposé à des surnageants provenant de patients atteints d'IBS coliques. En outre, une modificationCette technique a été récemment révélé être applicable dans les échantillons du côlon humain.

Introduction

la signalisation sensorielle et la perception de la douleur est un processus complexe qui résulte d'une interaction complexe entre les nerfs afférents, les neurones de la colonne vertébrale, ascendants et descendants des voies facilitatrices et inhibitrices et plusieurs régions différentes du cerveau. A ce titre, des modifications à un ou plusieurs de ces niveaux peut entraîner une altération de la signalisation sensorielle et la douleur viscérale dans les états pathologiques. Pour étudier ces différents aspects de la signalisation sensorielle multiples techniques ont été développées à partir d' expériences allant de cellules individuelles (par exemple, l' imagerie calcique sur les neurones) pour les modèles entiers d'animaux (par exemple, les réponses comportementales telles que la réponse viscéromotrice). La technique décrite dans ce document permet aux chercheurs d'évaluer spécifiquement l' activité du nerf afférences in vitro à partir d' un segment isolé de l' intestin grêle ou du côlon chez les rongeurs. En bref, un segment gastro-intestinal isolé (habituellement jéjunum ou du côlon) est monté dans une chambre construite à cet effet l'enregistrement perfusé avec un K physiologiquesolution rebs. Le nerf splanchnique est disséquée et connecté à une électrode permettant l'enregistrement de l'activité neuronale dans afférences nerfs afférents splanchniques ou pelviennes. L' activité nerveuse peut être enregistrée basale ou en réponse à des pressions croissantes intraluminaux et / ou des composés pharmacologiques qui peuvent être appliqués directement dans la chambre d'enregistrement (serosally), ou via le perfusat intraluminal (mucosale) afin d' évaluer leur effet sur la décharge afférente 1-6 . À noter, les nerfs splanchniques contiennent également des fibres efférentes et afférences viscerofugal en plus des afférences sensorielles. L' un des principaux avantages de l' ex vivo enregistrement du nerf splanchnique est le fait que les chercheurs peuvent quantifier l' activité du nerf sans modulation ou de l' entrée du système nerveux central, permettant d'étudier l'effet direct des composés appliqués localement sur l' activité nerveuse. En outre, la surveillance des paramètres vitaux, comme cela est nécessaire en utilisant l'approche in vivo (voir ci - dessous), est no plus pertinente. In vitro l' enregistrement splanchnique est finalement beaucoup moins de temps que son homologue in vivo.

activité neuronale Afférent en réponse à d'autres stimuli, tels que la muqueuse caresser, de sondage en utilisant des poils de von Frey ou étirement du segment, peut être étudié dans un dispositif expérimental modifié dans lequel le tissu intestinal est coincé et ouvert longitudinalement (qui est en contraste notre configuration à l' aide d' un segment intact), comme cela a été décrit dans un précédent numéro 7,8. En outre, récemment, une technique a été décrite pour étudier colique activation nerveuse afférente dans la paroi colique lui - même via l' imagerie calcique, encore une fois en utilisant un goupillé vers le bas, ouvert longitudinalement le segment 9.

Une variante de cette technique consiste in vivo par mesure de l' activation neuronale près de l'entrée dans la moelle épinière du afférences. En bref, l'animal est placé sous sédation en position couchée, exposing la moelle épinière lombo - sacrée dans laquelle le nerf afférent des projets d'intérêt au moyen d' une laminectomie, la construction d' une paraffine remplie de puits en utilisant la peau de l'incision et le drapage de la radicule dorsale sur une électrode bipolaire de platine 10,11. Cette technique permet en outre aux chercheurs de caractériser des fibres en fonction de leur vitesse de conduction, et de distinguer les fibres C amyéliniques de Aδ fibres fines myélinisées. En outre, les radicelles dorsales contiennent exclusivement des fibres sensorielles afférentes, contrairement aux nerfs afférents et efférents splanchniques mixtes mentionnés précédemment.

Enregistrement afférences décharge nerveuse in vitro à partir isolés segments de l' intestin peut également être fait en utilisant des échantillons humains, en tant que deux groupes de recherche publiés indépendamment premiers en homme manuscrits enregistrement de l' activité du nerf afférences colique résection humaine spécimens 12,13. La mise en œuvre de cette technique pourrait entraîner une plus facilement translatisur des données murins à l'état humain, et pourrait permettre aux chercheurs d'identifier facilement des médicaments ciblant le nerf sensitif sensibilisé. L'importance clinique de caractériser l'activité nerveuse afférente, ainsi que la découverte de nouveaux réactifs thérapeutiques qui ciblent l' activité du nerf afférences exorbitant, a été minutieusement examiné par de nombreux experts dans le domaine de 14-19.

La technique in vitro ci - dessus complète le plus communément connus dans la mesure in vivo de l' activité nerveuse afférente. Lors de la mesure de l' activité neuronale in vivo, l' activité du nerf peut être mesuré directement chez l'animal sous sédation au cours de laquelle le segment d'intérêt est identifié et ensuite intubé, et une paraffine remplie de liquide et est construit en utilisant la paroi abdominale et la peau du rongeur 20. Le nerf afférences d'intérêt est alors identifié, sectionné et placé sur une électrode de platine bipolaire, ce qui permet de l'activité neuronale DE MESUREt. Cette technique permet au chercheur de moduler l'activité des nerfs afférents à vivre bien des animaux sous sédation; à ce titre, on peut étudier l'activité neuronale répond aux perturbations telles que la distension luminale ou l'administration intraveineuse d'un composé.

La recherche translationnelle se concentre aujourd'hui principalement sur l'application des surnageants d'origine humaine (par exemple., À partir de biopsies coliques, des cellules périphériques cultivées mononucléaires du sang, etc.) sur les afférences de souris jéjunum et / ou colique 21,22. Les chercheurs peuvent appliquer directement surnageants soit dans le bain d'organe ou dans la solution intraluminal qui perfuse le segment de l'intestin, de sorte que les effets différentiels de séreuse contre l'application de la muqueuse peuvent être étudiés sur la décharge nerveuse afférente. En tant que tel, il a été montré que colique supernatans biopsie de la muqueuse de patients atteints du syndrome du côlon irritable peuvent causer des réactions allergiques chez les afférences colique de souris, Guinée porcs neurones sous-muqueux et dorsale de la souris racineneurones ganglionnaires 21,23,24.

Enfin, l'enregistrement de l'activité neuronale ne se limite pas au mésentérique et / ou des neurones du bassin innervant le tractus gastro-intestinal. D' autres ont démontré que les enregistrements nerveuses peuvent être effectuées dans les afférences fournissant l'articulation du genou 25, tandis que d' autres ont caractérisé la vessie activité nerveuse afférente et 26-28, et a démontré que les afférences du bassin de la vessie et du tractus gastro - intestinal convergent, qui peut entraîner des neurones diaphonie 29.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux décrits ci-dessous ont été approuvés par le Comité d'éthique médicale et de l'utilisation des animaux d'expérimentation à l'Université d'Anvers (numéro de dossier 2012-42).

1. Préparation des tissus de jéjunale et colique afférentes Nerfs

  1. Préparation du nerf afférences jéjunale
    1. Effectuer l' euthanasie des rongeurs du rongeur adolescent ou un adulte qui a été approuvé avant l'expérience par le comité d' éthique local (par ex., La sédation terminale suivie par ponction cardiaque, la dislocation cervicale, etc.).
      NOTE: Nous avons utilisé la dislocation cervicale à sacrifier les animaux résultant ainsi dans des expériences sans la nécessité de poursuivre l' anesthésie ou de soins post-chirurgicaux que les tissus sont transformés in vitro.
      NOTE: L' âge a été montré pour atténuer les fonctions mécanosensoriels afférentes mésentérique 30, nous vous conseillons donc aux chercheurs d'adhérer à un groupe d' âge spécifique pour la durée deune seule expérience.
    2. Placer l'animal de laboratoire sacrifié dans la position couchée sur le dos et effectuer une incision médiane abdominale à travers la couche de peau et de muscle abdominal en utilisant un scalpel, étendant à partir du processus xiphoïde jusqu'à l'os du pubis.
    3. Prendre un bain dans la cavité abdominale avec une solution de Krebs à froid, afin d'éviter les tissus intra-abdominale du dessèchement (composition de Krebs: mM de NaCl 120,03 mM , KCl 6,22, 1,57 mM de NaH 2 PO 4, 15,43 mM NaHCO 3, 1,21 mM MgSO4, 11,52 mM de D-glucose et 1,52 mM de CaCl2).
    4. Rapidement exciser l'ensemble jéjunum en utilisant des ciseaux pointus en retranchant environ 20 cm de l'intestin grêle à partir immédiatement distalement de l'angle de Treitz, en prenant soin de ne pas endommager les structures environnantes et de garder le mésentère de l'intestin, qui contient les vaisseaux sanguins jéjunum et nerfs afférents, intact.
      NOTE: Pour la simple dissection jéjunale dans la cavité abdominale, on n'a pas besoin d'utiliserun stéréomicroscope, comme cela peut être facilement visualisés à l'oeil nu.
    5. Placez le jéjunum excisée dans une solution de Krebs glacée et garder sur la glace, tout en oxygénant la solution Krebs en continu avec carbogène (95% O 2, 5% de CO 2).
    6. Couper le jéjunum avec des ciseaux pointus dans de longues boucles d'environ 3 cm. Observer le faisceau mésentérique contenant les vaisseaux et les nerfs splanchniques quelque part près du centre de la boucle respective.
    7. Rincer chaque segment avec une solution de Krebs à l' aide d' un cathéter émoussé pour retirer le contenu luminal et Chyme que ceux - ci contiennent des enzymes digestives qui permettront d' accélérer la détérioration de l'échantillon de tissu in vitro.
      REMARQUE: Prenez soin de ne pas endommager la lumière de la boucle pendant le rinçage, que la destruction des villosités se traduira par la libération de médiateurs qui peuvent altérer l'activité nerveuse afférente.
    8. Identifier le segment pour mesurer l'activité de nerf afférent (par exemple, la première SEGME jéjunalent distalement du ligament de Treitz ou l'angle de Treitz), et la prise dans une chambre d'enregistrement construit à cet effet recouvert d'une couche d'élastomère de silicone.
      NOTE: Le début du jéjunum est anatomiquement définie comme la partie de l'intestin grêle où le ligament de Treitz traverse le petit intestin, appelé aussi la flexure duodenojejunal.
      REMARQUE: couvrir le fond de la chambre d'enregistrement avec une couche mince d'élastomère de silicone à l'avance avant le début de l'expérience. La préparation de cette couche en élastomère doit être effectué conformément aux instructions du fabricant 1.
    9. Perfuser la chambre constamment avec chaud, carbogenated solution de Krebs à un débit de 10 ml / min et maintenir la température de Krebs dans la constante de chambre d'enregistrement à 34 ° C.
    10. Monter le segment de jéjunum dans le bain d'organe de sorte que l'extrémité buccale est reliée au conducteur de seringue fournir un écoulement luminale et l'extrémité aborale se connecte à la sortie. Légèrement stvomir le segment, mais prendre soin de ne pas exercer une tension excessive. Fixer les deux extrémités en utilisant fermement 4/0 ligatures de soie aux ports d'entrée et de écoulement.
    11. Attacher le conducteur de la seringue à l'extrémité buccale, et perfuser le segment de jéjunum intraluminale avec une solution de Krebs (non oxygéné, de la température ambiante) à un débit de 10 ml / h.
    12. Pin le mésentère de l'appartement de segment intestinal montée contre la couche inférieure en élastomère de silicone, en utilisant des broches d'insectes. Étirez le mésentère dans le but d'optimiser la visualisation du faisceau mésentérique; ne pas exercer de pression sur le faisceau ou le jéjunum.
    13. Effectuer une dilatation de la rampe d'essai (vide infra) , en fermant l'orifice de sortie jusqu'à ce que la pression intraluminale du segment intestinal atteint 60 mmHg, afin de vérifier qu'aucune solution intraluminal Krebs fuit du segment monté. Observer une augmentation progressive de la pression intraluminale sans interruption.
    14. Observer les petites contractions du segment (wav péristaltiquees) pendant la phase de distension initiale. Le cas échéant, bloquer l'activité péristaltique par addition de 1 uM du type L bloqueur des canaux calciques nifédipine à la solution de Krebs.
      REMARQUE: Ajout d'1 uM d'atropine à la solution de Krebs en plus de nifédipine, complètement paralyser le segment intestinal. Nous avons cependant aucune expérience personnelle avec l'utilisation et l'effet de l'atropine sur l'enregistrement des nerfs afférents.
    15. En vertu d'un stéréomicroscope, doucement commencer à décoller le tissu adipeux du mésentère en tirant doucement avec deux petites pinces, en prenant soin de ne pas endommager les vaisseaux et les nerfs afférents qui sont enterrés dans le tissu adipeux.
    16. Commencer à une distance éloignée du jéjunum et exposer les vaisseaux sanguins dans le faisceau de mésentérique.
    17. Observer le nerf jéjunale afférences entre les deux navires comme une mince fil blanc encapsulé dans le tissu adipeux. Seulement disséquer plus proximalement vers le jéjunum par pelage doucement le tissu adipeux loin en utilisant des pinces lorsque lesidentification initiale des deux navires mésentériques et / ou le nerf afférent est difficile.
    18. Disséquer le nerf mésentérique jéjunale du segment libre sur une distance de plusieurs millimètres, en retirant la adhérente du tissu adipeux au nerf.
    19. Transect le nerf avec des ciseaux de tissus tranchants. Si nécessaire, décoller le tissu adipeux et conjonctif restants, ainsi que la gaine epineuronal en tirant doucement avec les petites pinces.
    20. À l'aide d'un micromanipulateur, abaisser la pointe de l'électrode d'aspiration, relié à une seringue à piston, dans le bain d'organe; puis, en manipulant le piston, aspirer doucement une solution de Krebs dans le bain d'organe de sorte que la pointe de l'électrode est immergée dans la solution de Krebs (figure 1). Faire en sorte que la solution de Krebs recouvre l'électrode de fil à l'intérieur de l'électrode d'aspiration.
      REMARQUE: Préparation de la succion capillaire en verre au borosilicate qui contient le fil-électrode avant le début de l'expérience, nousing un extracteur de pipette.
    21. Positionner la pointe de l'électrode d'aspiration à proximité immédiate du nerf brin afférences sectionnée et d'en tirer le brin nerveuse sectionnée dans le capillaire sur toute sa longueur.
    22. Manœuvrer la pointe de l'électrode vers une partie du tissu adipeux et aspirer ce dans le capillaire de verre tout en aspirant fermement avec le piston, ce qui mécaniquement 'étanchéité du nerf dans le capillaire à partir du contenu du bain d'organe.
    23. Vérifiez l'enregistrement de l' activité du nerf afférent à l' aide du système d'acquisition de données, par exemple, en effectuant une augmentation induite par distension-rampe dans afférences tir (voir ci - dessous). Suite à l'isolement du nerf dans l'électrode d'aspiration, de stabiliser la préparation pendant 15 minutes afin d'obtenir une activité nerveuse afférente spontanée de l'état d'équilibre avant d'effectuer les expériences réelles.
    24. Pour effectuer rampe ballonnement, distendre le segment intestinal en fermant l'orifice de sortie, ce qui conduit à graduel augmentation de la pression dans le segment intestinal (jusqu'à 60 mm Hg). Seulement effectuer le protocole expérimental désiré lorsque trois distensions de rampe consécutives (avec un intervalle de 15 min) donnent une décharge multi-unité reproductible (Figure 2).
  2. Préparation de la afférences lombaire splanchnique (nerf afférent colique)
    NOTE: La dissection des nerfs afférents colique nécessite une dissection plus détaillée. Déviations de l'ancien protocole 'jéjunale' sont énumérées ci-dessous:
    1. Euthanasier l'animal au moyen d'une méthode humaine, placez-le dans la position couchée, effectuer une laparotomie médiane et excessivement verser la solution glacée Krebs dans la cavité abdominale. REMARQUE: Krebs composition: NaCl 118 mM, KCl 4,75 mM, 1 mM de NaH 2 PO 4, 22 NaHCO3, 1,2 mM MgSO4, 11 mM de D-glucose et 2,5 mM de CaCl 2, 3 pM d' indométhacine.
      NOTE: Notez la composition modifiée de la solution de Krebs; indométhacine est ajouté à la manièrerésolu- afin d'éviter des altérations de l'activité du nerf afférences par les prostaglandines.
    2. Jeter le tissu adipeux, la vessie et les organes génitaux internes et déplacer doucement l'intestin grêle, d'un côté dans la cavité abdominale. Effectuer une prelevation étendue de la partie distale du côlon avec les nerfs mésentériques intacts de l'abdomen.
      REMARQUE: points de repère importants qui peuvent être inclus dans cette dissection pour faciliter la préparation ultérieure du tissu comprennent l'aorte abdominale et la veine cave, le rein gauche et la musculature du plancher pelvien.
      NOTE: Lors de la dissection, prendre soin de ne pas exercer une traction sur le tissu de liaison entre le côlon et l'aorte abdominale, car cette région contient les nerfs splanchniques lombaires.
    3. Transférer le segment de tissu dans l'élastomère de silicone doublée chambre d'enregistrement. Utiliser l'artère rénale gauche, qui provient de l'aorte abdominale, en tant que point de départ. Suivez l'aorte abdominale dans le sens aboral, rencontrer les mesenteri supérieuresc artère avec la coeliaque et mésentérique supérieure ganglion. Enfin, arrivent au niveau du tissu de jonction entre la partie distale du côlon et de l'aorte, dans lequel le nerf d'intérêt est située.
    4. Identifier l'artère mésentérique inférieure provenant de l'aorte abdominale. Le nerf lombaire afférences splanchniques peut être identifié à la base de l'artère mésentérique inférieure; il est parallèle à l'artère (figure 3).
    5. Suite à la transection du nerf, retirez délicatement la gaine de tissu conjonctif environnant et taquiner le nerf en plusieurs fils fins. Assurez-vous de garder une distance sécuritaire du côlon.
    6. Dessiner un de ces fils individuels dans l'électrode d'aspiration, «sceau» avec le capillaire entourant le tissu adipeux, comme décrit précédemment et effectuer le protocole expérimental désiré.
    7. Se débarrasser de tout tissu superflu qui est présent dans le bain d'organe (par exemple, les reins, les vaisseaux abdominaux, le tissu musculaire), uns ils peuvent perturber le signal afférent.
      REMARQUE: La nifédipine (1 uM) peut être ajouté à la solution de Krebs dans le cas où le signal de nerf afférent est perturbé par les mouvements intestinaux spontanés dus à des contractions des cellules musculaires lisses.
      REMARQUE: Les médicaments peuvent être administrés à trois endroits différents: 1) serosally en dissolvant le composé désiré dans la Krebs qui perfuse la chambre d'enregistrement, 2) directement dans le bain d'organe lors de l'arrêt temporaire de la perfusion ou 3) intraluminale par dissolution du composé d'intérêt dans la solution de Krebs dans le lecteur de seringue. La désensibilisation du nerf afférences peut se produire lorsque des doses cumulatives d'un composé sont administrés trop vite consécutivement.

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Figure 1: Vue d' ensemble schématique du Erigé Chambre d' enregistrement et d' aspiration Electrode Vue d' ensemble détaillée de l'techni. configuration cal avec l'électrode d'aspiration et la chambre d'enregistrement en place. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2: Tracing Représentant de l'inscription in vitro de jéjunale Afférent Activité Nerve enregistrement typique de multi-activité nerveuse afférente jéjunale (imp.sec -1) (panneau supérieur) au départ et en réponse à 2 distensions de rampe jusqu'à 60 mmHg. (panneau inférieur), et l'identification subséquente (analyse de wavemark) de différentes mono-unités dans le signal nerveux (troisième panneau). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3:. Neuroanatomy du Colon A) L' information sensorielle du côlon est transmis par les nerfs colique lombaires (LCN) vers le système nerveux central, avec le LCN fonctionnant à proximité de l'artère mésentérique inférieure (IMA). Une partie des fibres de ce nerf colique lombaire bien sûr le long du nerf intermesenteric (IMN) pour former les nerfs splanchniques lombaires (LSN). Le ganglion mésentérique inférieure (IMG) se trouve à l'origine de l'IMA de l'aorte abdominale. Enregistrement distalement de l'IMG est obligatoire devrait chercheurs souhaitent étudier l' activité nerveuse afférente viscerofugal. B) Une vue d'ensemble schématique du dispositif expérimental. enregistrement Afférent du LCN est effectué dans un organe à la fois par l'intermédiaire d'une électrode d'aspiration relié au système d'acquisition de données. Rampe de distension peut être effectuée lors de la fermeture de l'orifice de sortie, tout en continuant l'afflux deSolution de Krebs. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. Acquisition de données

  1. Enregistrer l'activité du nerf par l'intermédiaire d'une électrode d'aspiration reliée à un headstage. Amplifier (gain 10k) et filtrer le signal (bande passante 500 - 5000 Hz) 20.
    NOTE: A 50/60 Hz Bruit Eliminator devrait être inclus dans le dispositif expérimental afin d'éliminer le bruit des signaux d'interférence électrique 50/60 Hz. Le signal est automatiquement numérisé et échantillonné à 20 kHz pour l'analyse.

3. Analyse 5,20

  1. Signaler la décharge nerveuse afférente que le nombre total d'impulsions / seconde pour l'ensemble du nerf ou d'utiliser un logiciel spécialisé pour effectuer une analyse plus approfondie, que des enregistrements multi-unités de l'activité globale du nerf contiennent des potentiels d'action de forme différente, l'amplitude et la largeur, correspondant à nerf différent unitésdans chaque fibre afférente (figure 2).
  2. Associez wavemarks individuels à des modèles prédéfinis, permettant la discrimination entre les simples unités. Avant l'attribution d'un pic à une certaine onde marque, un rapport signal-bruit de> 2: 1 devrait être appliquée.
    NOTE: Lors de l'analyse de wavemark, nous construisons un nouveau modèle quand au moins 10 pics similaires sont identifiés par le logiciel d'analyse. Aucun modèle est construit pour des formes plus rares de 1 à 50 pointes. Une pointe est adaptée à un modèle en utilisant l'analyse en composantes principales quand au moins 80% de ses points sont identiques à la pointe de modèle. appariement modèle est dépendante de l'opérateur, et doit toujours être effectuée par le même chercheur en aveugle.
  3. Calculer les réponses potentielles d'action en soustrayant l'activité spontanée au départ (pression intraluminale de 0 mmHg) de la réponse lors de la distension à des points de temps fixes (5 mmHg de minimum de 0 à 20 mmHg la pression intraluminale, par incréments de 10mmHg de 20 mmHg et suivantes). Mesurer décharge afférente base en utilisant une taille bin de 10 sec.
  4. Utilisez l'analyse d'un seul appareil pour classer les fibres en fonction de leur profil de décharge pendant rampe distension (Figure 4). En outre, l'analyse seule unité peut être utilisée pour étudier le profil chimiosensibilité des différents types d'unités, car tous les types d'unités affichent la même activité de tir altérée en réponse à un médicament ou composé.
  5. Classez fibres que les fibres à faible seuil ( 'de LT', typiquement exercent une augmentation des pertes au niveau des pressions de distension inférieurs), des fibres seuil haut ( «HT», exercent une augmentation des pertes au niveau des pressions de distension les plus élevées), des fibres de large plage dynamique ( «WDR», démontrer augmentation de tir pendant toute la distension de rampe) ou afférences mécaniquement insensible ( «MIA», les fibres nerveuses qui , généralement , ne répondent pas à la rampe distensions) 5; 20.
  6. Exprimez la réponse nerveuse de tir à 20 mmHg comme le pourcentage de la réponse de tir maximale pendant distension (LT%), car elle reflète l'étendue de la cuisson à la pression de distension faible.
    NOTE: En conséquence, les fibres LT se caractérisent par une LT%> 55%, alors HT sont définies par une valeur de <15%. Les valeurs des unités WDR se situent entre 15 et 55% (20). Un MIA affiche tir afférences spontanée qui est affectée par distensions.

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Figure 4:. Représentation schématique des différentes unités Afférent fibre fonction de leur profil mécanosensible Les unités sont classées en fonction du pourcentage (LT%) de son taux de tir à 20 pression de distension mmHg par rapport à la réponse de tir maximale pendant distension. fibres à seuil bas (de panneau supérieur gauche) présentent principalement une activité accrue du nerf à des pressions de distension faibles, entraînant une LT% de plus de 55%. unités seuil haut (en haut à droitepanneau), au contraire, afficher uniquement une augmentation de la cadence de tir à des pressions nocives (% LT <15). fibres de large plage dynamique (panneau inférieur gauche) affichent une augmentation progressive de l'activité nerveuse pendant toute la distension (% LT comprise entre 15 et 55), tandis que les fibres mécaniquement insensibles (panneau inférieur droit) ne répondent pas aux pressions croissantes de distension. LT%: (afférences tir à 20 mmHg / maximale afférences tir) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Résultats

l'activité du nerf afférences jéjunale a été mesurée à la ligne de base et en réponse à la rampe distension 9 vieille de huit semaines mâle de 1 souris. Les animaux ont été logés dans des groupes dans des conditions normalisées (6 animaux par cage, 20 - 22 ° C, humidité 40 - 50%, 12 cycle de lumière-obscurité h) avec un accès illimité à l'eau du robinet et de chow régulière. segments jéjunales de souris affichées irrégulière décharge nerveuse afférences spontanée au départ à une ...

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Discussion

Le protocole dans le présent document décrit une technique de laboratoire reproductible pour étudier l' activité du nerf afférences mésentérique chez les rongeurs utilisé par notre groupe et d' autres 3,4,7,8,12,20,21,31. Les étapes critiques au sein du protocole comprennent l'isolement rapide du tissu, l'aspiration du brin du nerf dans l'électrode d'aspiration et la «fermeture» appropriée du capillaire de verre à partir du bain d'organe par aspiration entourant le tissu adipeux da...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

SN a réalisé les expériences décrites ci-dessus, effectué l’analyse des données et rédigé le manuscrit. AD et JDM ont mis en œuvre la technique dans nos installations de recherche et ont aidé à l’analyse des données. HC a aidé à réaliser les expériences. WJ, CK et DG ont aidé à la mise en œuvre de la technique de mesure afférente dans notre laboratoire, à l’analyse des données et à l’interprétation des résultats. SF, JDM et BDW ont conçu l’étude. Tous les auteurs ont lu de manière critique et approuvé le manuscrit final. SN est un candidat au Fonds pour la recherche scientifique (FWO), Flandre (11G7415N). Ce travail a été soutenu financièrement par le FWO (G028615N et G034113N).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
chlorure de sodium (NaCl)VWR Chemicals27 810 295composé Krebs solution
chlorure de potassium (KCl)Acros organics196770010composé Krebs solution
dihydrogénophosphate de sodium (NaH2PO4)VWRChemicals1 063 461 000composé Krebs solution
bicarbonate de sodium (NaHCO3)Merck1 063 291 000composé Krebs solution
magnésium (MgSO4)Merck1 058 861 000composé Krebs solution
chlorure de calcium (CaCl2)Merck23 811 000composé Krebs solution
D-glucoseVWR Chemicals1011175Pcomposé Krebs solution
Composé d’eauSolution de Krebs
Tube en PVCFournituresLe segment intestinal doit être monté sur un tube
PVC Tube en silicone Fournitureslaboratoire scientifiqueLe reste du tube, idéalement à base de silicone - déloger plus facilement les débris dans le tube
Fil de soiePearsall Limited10B15S220Fixation du segment sur le tube en PVC
Tourne-seringueHarvard Apparatus55-2222Perfusion intraluminale de jumelles Krebs
- y compris grossissement 10X dans l’oculairZeiss STEMI 2000Visualisation optimale pour la dissection du nerf afférent
Unité de commande de couverture homéothermeAppareil de Harvard507214Chauffage de la chambre
de l’organeBain d’orgue sur mesure avec fond
LogicielEnregistrement et analyse des données
Épingles à insectes, 500 pièces, acier inoxydable, diamètre 0,2 mmÉpingles à insectes Austerlitz minutiensDissection du nerf afférent
Pince à épiler Dumont #5 inox 11 cmWorld Precision Instrument500341Dissection du nerf
afférentCiseaux, ressort, 14 cmWorld Precision Instrument15905Dissection du nerf afférent
DB digitimer  ;Transducteur de pressionNL 108T2/10
MicromanipulateurNarishigeM-3333Manipulation 3D de l’électrode d’aspiration
MicromanipulateurX-4 BlocManipulation 3D de l’électrode d’aspiration
MicromanipulateurGJ-8 SupportManipulation 3D de l’électrode d’aspiration
LightSourceEuromex Microscopes Hollande EK-1Visualisation optimale pour la dissection du nerf afférent
CED 1401 AppareilEnregistrement de l’activité du nerf afférent
Humbug 50/60 Hz Éliminateur de bruitQuest Scientific InstrumentsÉlimination du bruit de fond
Pompe à perfusionGibson Minipuls 2Perfusion de la chambre d’organe dans laquelle le segment est monté
Porte-microélectrode Demi-cellules 1,5 mmWorld Precision InstrumentMEH2SWÉlectrode d’aspiration pour l’isolation de la fibre afférente
Capillaires en verre borosilicaté, 300 pièces ; 1,5/0,84 OD/IDWorld Precision Instrument1B150-4Capillaire pour l’isolement du nerf afférent
sulfate de distillée de laboratoire scientifique en de recouvert Sylgard Spike2 rotatif magnétique d’enregistrement

Références

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Mots-clés

Segments j junaux et coliquesisolation du nerf splanchniquetechnique du bain organeprotocole de distension ramp equantification de l activit nerveusetude de l hypersensibilit visc ralemod le du syndrome de l intestin irritableanalyse des ganglions de la racine dorsale

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