Bacterial Affichage intérieur-membrane pour le criblage d'une bibliothèque de fragments d'anticorps

Résumé

Nous proposons une méthode permettant de cribler simultanément une bibliothèque de fragments d’anticorps pour l’affinité de liaison et la solubilité cytoplasmique en utilisant la voie de translocation jumelle-arginine d’Escherichia coli, qui a un mécanisme de contrôle de qualité inhérent pour le repliement des protéines intracellulaires, pour afficher les fragments d’anticorps sur la membrane interne.

Résumé

Les anticorps conçus pour la fonction intracellulaire doivent non seulement avoir une affinité pour leur antigène cible, mais doivent également être solubles et correctement repliés dans le cytoplasme. Les méthodes couramment utilisées pour l’affichage et le criblage des banques d’anticorps recombinants n’intègrent pas le contrôle de la qualité du repliement des protéines intracellulaires et, par conséquent, la capacité de liaison à l’antigène et le repliement cytoplasmique et la solubilité des anticorps modifiés à l’aide de ces méthodes doivent souvent être modifiés séparément. Ici, nous décrivons un protocole pour cribler une banque recombinante d’anticorps à fragment variable à chaîne unique (scFv) pour la liaison à l’antigène et le repliement cytoplasmique approprié simultanément. Le procédé exploite le mécanisme intrinsèque de contrôle de la qualité du repliement intracellulaire de la voie de translocation jumelle d’arginine (Tat) d’Escherichia coli pour afficher une banque scFv sur la membrane interne d’E. coli. La voie Tat garantit que seules les protéines solubles et bien repliées sont transportées hors du cytoplasme et affichées sur la membrane interne, éliminant ainsi les scFv mal repliés avant l’interrogation de la liaison à l’antigène. Après le retrait de la membrane externe, les scFv affichés sur la membrane interne sont placés contre un antigène cible immobilisé sur des billes magnétiques pour isoler les scFv qui se lient à l’antigène cible. Un criblage secondaire basé sur un test immuno-enzymatique (ELISA) est utilisé pour identifier les scFv les plus prometteurs pour une caractérisation supplémentaire. La liaison à l’antigène et la solubilité cytoplasmique peuvent être améliorées grâce à des cycles ultérieurs de mutagenèse et de criblage pour concevoir des anticorps à haute affinité et à haute solubilité cytoplasmique pour des applications intracellulaires.

Introduction

Des anticorps capables de se replier et de fonctionner dans l'environnement intracellulaire sont des outils prometteurs pour la recherche et des applications thérapeutiques. Ils ont la capacité de moduler l' activité des protéines en se liant à une protéine cible dans les cellules pour éviter des interactions protéine-protéine, les interactions perturber protéine-acide nucléique, ou d' empêcher l' accès du substrat aux enzymes ^1-5.

Bien que les anticorps ont un grand potentiel pour des applications intracellulaires, les ingénierie pour le pliage correct et la solubilité dans le milieu intracellulaire, tout en maintenant la capacité à se lier à un antigène cible est difficile. L'environnement cytoplasmique réduisant empêche la formation de liaisons disulfures normalement requises pour le pliage stable d'anticorps pleine longueur et des fragments d' anticorps, y compris à chaîne unique fragment variable (scFv) des anticorps ^6,7. Un certain nombre d'approches d'évolution dirigée ont été utilisées pour concevoir des anticorps avec haffinités IGH pour cible les antigènes ^8-10. Ces approches utilisent couramment phage display, l' affichage de surface de levure ou d' affichage de surface bactérienne pour cribler de grandes banques d'anticorps ^11-13. Ces méthodes sont puissantes et efficaces pour identifier des anticorps qui se lient à des cibles, mais ils dépendent de la voie sécrétoire de protéines de transport qui seront affichées ^14-16. La voie de sécrétion de protéines dépliées translocation du cytoplasme réducteur dans la lumière du réticulum endoplasmique de la levure ou dans le périplasme dans les bactéries. Les protéines se replient alors dans des conditions d'oxydation et sont affichées sur la surface des cellules ou encapsidés dans des particules de phage pour cribler une affinité de liaison ^17,18. Par conséquent, les anticorps isolés à l'aide de ces techniques ne seront pas nécessairement bien plier dans le cytoplasme, et la solubilité intracellulaire doivent souvent être conçus séparément si les anticorps sont utilisés dans des applications intracellulaires.

Améliorerl'efficacité des anticorps d'ingénierie qui sont bien pliés dans le cytoplasme, nous avons précédemment rapporté le succès de MAD-TRAP (affichage à membrane ancrée pour la reconnaissance des protéines associant à base de Tat), un procédé de criblage d' une banque d'anticorps scFv en utilisant Escherichia coli Intérieures affichage de la membrane ^19. Affichage interne de la membrane bactérienne repose sur la voie de translocation à double arginine (TAT) pour le transport d'anticorps présentés, contrairement à d'autres méthodes d'affichage commun qui utilisent la voie sécrétoire. La voie Tat contient un mécanisme de contrôle de qualité qui ne permet que des protéines solubles, correctement repliées pour être transportés à partir de E. cytoplasme coli, à travers la membrane interne et dans le périplasme ^20,21. Substrats surexprimé Tat (ie., Les protéines ciblées pour la voie Tat avec une fusion N-terminale du peptide signal de Tat ssTorA) qui sont bien plié dans le cytoplasme forment une translocation à long terme intermédiaire à l' extrémité N-terminale in cytoplasme et l' extrémité C-terminale ¹⁹ dans le périplasme. Ceci permet l' affichage des substrats de Tat correctement repliés, y compris des fragments d' anticorps, sur la face périplasmique de E. membrane interne coli. Après avoir enlevé la membrane externe par digestion enzymatique pour produire des sphéroplastes, des anticorps sont exposés à l'espace extracellulaire (figure 1). Ceci permet à des substrats de Tat affichés sur la membrane interne devant être criblés pour la liaison à une cible spécifique. Il est important, en exploitant la voie Tat pour l'affichage de la surface cellulaire garantit que seuls les anticorps dans la bibliothèque qui sont bien pliés dans le cytoplasme seront interrogés pour la liaison, ce qui permet l'ingénierie simultanée d'affinité et de pliage intracellulaire de liaison. Dans ce protocole, nous décrivons comment afficher une bibliothèque scFv sur la E. membrane interne coli, pan la bibliothèque contre un antigène cible, et d' effectuer un écran secondaire pour identifier les constituants les plus prometteurs de la bibliothèque. Alors que nous nous concentrons le protocole sur scFv, la méthode pourrait être appliquée à l'ingénierie toute protéine dont l'application nécessite le pliage de liaison et intracellulaire.

Figure 1. Affichage membrane interne Tat. Dans E. coli, des anticorps scFv exprimés sous la forme d' une fusion avec la séquence signal et ssTorA correctement replié dans le cytoplasme sont transportés à travers la membrane intérieure. Une translocation des formes intermédiaires, où les scFv sont ancrées dans la membrane interne de l'extrémité N-terminale dans le cytoplasme et l'extrémité C-terminale dans le périplasme. E. la membrane externe coli est digéré par voie enzymatique pour former des sphéroplastes, exposant ainsi les anticorps ancrés dans l'espace extracellulaire et leur mise à disposition pour la détection en utilisant un anticorps qui se lie au marqueur fusionné en C-terminal de l' épitope de l'anticorps présenté.charge / 54583 / 54583fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Protocole

1. Préparer la bibliothèque scFv comme Fusion à la séquence signal ssTorA

1. Obtenir une banque d'acide désoxyribonucléique (ADN) contenant des variants d'un gène scFv.
   REMARQUE: La bibliothèque peut également être construit en utilisant un mode approprié pour générer de la diversité sur le gène scFv entier ou des domaines ciblés ²² (par exemple, la troisième régions déterminant la complémentarité, CDR3.).
2. Insérer la banque d'ADN dans le plasmide pimd (figure 2) en utilisant des procédés de clonage moléculaire standard ^23.
   Remarque: Ce plasmide exprime scFv comme une fusion génétique à la séquence signal ssTorA (N-terminal scFv) et le marqueur d'epitope FLAG (C-terminale du scFv). La conception du plasmide pour l' affichage de la membrane interne a été décrit précédemment ^19. Le plasmide pimd est disponible auprès des auteurs.

Figure 2. Inner-membrane affichage plasmide (PIMD) carte (étapes 1.2 à 1.3). Ce plasmide contient un promoteur lac, l' origine ColE1 de réplication, et un gène de résistance au chloramphénicol. Le gène inséré scFv est fusionné à la séquence signal pour cibler ssTorA scFv à la voie Tat et à un marqueur d'epitope FLAG, avec toutes les trois dans le même cadre de lecture. les sites d'enzymes de restriction sont indiqués. Pour une bibliothèque insérée entre les sites d'enzymes de restriction Xbal et Notl, la taille du plasmide est 2219 pb plus la taille du scFv. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

3. Transformer l'ADN plasmidique contenant la banque dans MC4100 de E. ²³ cellules de E. coli. Récupérer et développer cette forme bactérienne de la bibliothèque. Centrifuger à 4000 xg pendant 15 min à température ambiante pour recueillir les cellules. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules recueilliesdans 25% de glycérol dans Luria-Bertani (LB) médias. aliquotes Conserver à -80 ° C jusqu'à ce que nécessaire, ou passez à l'étape 2.
   NOTE: Le protocole a été vérifié avec des cellules MC4100, bien que d' autres E. souches coli devraient également être compatibles avec le protocole. L'électroporation est la méthode préférée pour la transformation, en raison de sa grande efficacité de transformation. La bibliothèque devrait typiquement être composé d'au moins 10 ⁹ variantes scFv à ce stade, et chaque aliquote doit contenir suffisamment de cellules de telle sorte que la bibliothèque est recouverte de 100 fois.

2. Exprimer la Bibliothèque et Préparer sphéroplastes

1. Décongeler une aliquote de la banque bactérienne (étape 1.3) à la température ambiante, et à l'aliquote à un flacon contenant 100 ml de milieu LB avec 20 ug / ml de chloramphenicol (Cm). Développer pendant 3 heures à 37 ° C et à 225 tours par minute dans un agitateur incubé.
2. Après 3 heures, enlever le ballon de l'agitateur incubé 37 ° C. Permettre l'expression de la bibliothèque de scFvprocéder O / N pendant 15-22 heures à 20 ° C et à 225 tours par minute dans un agitateur incubé.
   REMARQUE: Aucun inducteur est nécessaire lors de l'utilisation du plasmide pimd, comme le promoteur est percé. Notez que les cellules MC4100 ne surexpriment le répresseur Lac (et Lad est introuvable sur le plasmide).

Figure 3. cellules de E. coli et sphéroplastes. (A) E. cellules coli sont de forme cylindrique. (B) Après sphéroplastes à l' aide de l' EDTA et du lysozyme, la membrane externe de E. cellules coli est rompu, et les sphéroplastes résultants sont de forme sphérique. Contraste interférentiel différentiel (DIC) des images de microscopie ont été obtenues en utilisant un objectif 100X sur un microscope inversé. S'il vous plaît clécher ici pour voir une version plus grande de cette figure.

3. Préparer les sphéroplastes de la bibliothèque.
   REMARQUE: Les sphéroplastes sont formés par la rupture de la membrane externe de E. coli et sont de forme sphérique (Figure 3).
   1. Préparer les tampons nécessaires.
      REMARQUE: Tous les tampons doivent être stériles.
      1. Préparer 1 x tampon phosphate salin (PBS; pH 7,4) en dissolvant 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na ₂ HPO ₄ et 0,24 g de KH ₂ PO ₄ dans _H2O distillée jusqu'à un volume final de 1000 ml. Gardez sur la glace.
      2. Préparer PBS avec 0,1% (p / v) de sérum-albumine bovine (BSA) en dissolvant 0,2 g de BSA dans 200 ml de 1 x PBS. Gardez sur la glace.
      3. Préparer le tampon de fractionnement (FB) en mélangeant 7,5 ml d' eau filtrée stérilement 1 M de saccharose, 1 ml de tampon Tris 1 M (pH 8,0) et 1,5 ml d' eau distillée ₂ O. Gardez sur la glace.
      4. Préparer 1 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) en ajoutant 30 ul of EDTA 0,5 M à 14,97 ml d'eau distillée H ₂ O.
      5. Préparer 0,5 M _MgCl2 par dissolution de 4,76 g de MgCl ₂ dans 100 ml de H ₂ O distillée Gardez sur la glace.
   2. Enlever le ballon de l'agitateur, et à mesurer la densité optique (DO) à 600 nm en utilisant un spectrophotomètre pour déterminer la densité cellulaire. Calculer le volume de la culture induite nécessaire de telle sorte que chaque échantillon de sphéroplastes a 1 × 10 ¹⁰ cellules.
      NOTE: L'approximation d'une _DO600 de 1 indique une concentration de 10 ⁹ cellules / ml pour E. coli ²⁴ peut être utilisée.
   3. Centrifugeuse le volume calculé de la culture induite dans un tube de 1,5 ml à 12000 × g à température ambiante pendant 5 min. Préparer au moins deux échantillons dans le cas où un problème se pose dans la préparation des échantillons.
   4. Retirer le surnageant de la culture centrifugée et remise en suspension chaque culot de cellules dans 100 ul de FB glacée. Centrifugeuse à 12.000 ×g à température ambiante pendant 1 min, puis éliminer le surnageant par pipetage. Remettre en suspension chaque culot dans 350 ul de FB glacé supplémenté avec 3,5 ul de 10 mg / ml de lysozyme.
   5. Chaque tube vortex lentement tout en ajoutant goutte à goutte 700 pi d'EDTA 1 mM, et ensuite incuber les tubes à température ambiante pendant 20 minutes tout en faisant tourner lentement sur un dispositif de rotation de tube pour mélanger les échantillons. Enlever les tubes du dispositif de rotation, ajouter 50 ul de glace froid 0,5 M _MgCl2 à chaque tube, et on incube sur la glace pendant 10 minutes. Centrifuger les tubes à 11 000 x g à 4 ° C pendant 10 min.
   6. Isoler le culot de sphéroplastes.
      1. Utilisez un micropipette avec une pointe de 1 ml pour tirer lentement partie du culot. Tout en maintenant le tube à un angle avec l'ouverture directement au-dessus d'un nouveau tube de 1,5 ml, soulevez lentement la pointe de la pipette sur le surnageant et faites glisser la pastille dans le nouveau tube.
      2. Si un volume important de surnageant est transféré dans le nouveau tube, retirez-le par pipetage. Si le culot est pas ferme enough pour transférer, re-centrifuger à 11000 × g pendant 2 min et tentative d'isolement de granulés à nouveau.
   7. Remettre en suspension le culot de sphéroplastes dans chaque tube 1 ml de glace froid 1 x PBS. Alternez entre pipetage et tourbillonner lentement sur un support de vortex jusqu'à ce que le culot est totalement remis en suspension. Ne pas conserver les échantillons hors de la glace pendant plus de 2 minutes à la fois, et revenir à la glace pendant au moins 5 minutes avant de retirer de la glace à nouveau. Gardez les sphéroplastes à 4 ° C (jusqu'à 2 jours) jusqu'à son utilisation pour le panoramique à l'étape 4.

3. Immobiliser l'antigène cible sur des billes magnétiques

1. Biotinyler l'antigène cible in vivo au cours de la production recombinante dans E. cellules de E. coli. Vous pouvez également utiliser la conjugaison chimique ²⁵ ou antigène cible d'achat qui a déjà été biotinylé et passez à l' étape 3.2.
   1. Ajouter 816 g bicine à 50 ml d'eau pour faire 10 × bicine tampon. Diluer le buffer à 1 x H ₂ O distillée et de la chaleur à 50 ° C. Ajouter 14,7 mg de biotine pour 12 ml de tampon 1 x bicine chauffé pour former une solution de biotine qui est la biotine 5 mM dans 10 mM de tampon bicine. Conserver à -20 ° C jusqu'à leur utilisation.
   2. Et exprimer biotinyler la protéine cible en utilisant le plasmide pAK400cb-BCCP ^26, ce qui permet la production de l'antigène cible en tant que fusion de la protéine porteuse de biotine carboxyle (BCCP).
      NOTE: E. cellules de E. coli natif biotinyler BCCP, ce qui élimine la nécessité de purifier et chimiquement biotinyler la protéine cible avant immobilisation sur des billes revêtues de streptavidine. Le natif E. coli , la biotine - ligase BirA est suffisante pour biotinyler la protéine de fusion.
      1. Cultivez E. coli contenant le plasmide de biotinylation (avec l'antigène cible inséré en tant que fusion à l' extrémité N-terminale de la BCCP) O / N pendant 15 à 18 heures dans 5 ml de milieu LB additionné de 20 pg / ml de Cm à 37 ° C tout en agitant à 225 tours par minute.
      2. Mesurer la DO à 600 nm en utilisant un spectrophotomètre et calculer le volume de la culture nécessaire (V _add) à la sous - culture à une DO de départ de 0,05 à 25 ml de milieu LB frais avec 20 pg / ml cm en utilisant l'équation: V _ajouter = (0,05 × 25 ml) / (DO _{600 à 0,05),} où OD ₆₀₀ est la densité optique de la culture O / N et V _add est le volume de la culture O / N à ajouter à la LB. frais La sous-culture et de croître jusqu'à une DO de 0,5 à 0,8 dans un agitateur mis à incuber à 37 ° C et à 225 tours par minute.
      3. Ajouter β-D-thiogalactopyranoside d'isopropyle 1 à une concentration finale de 100 pM et de la biotine à une concentration finale de 5 uM. Induire l'expression dans un agitateur à incuber pendant 15-22 heures à 20 ° C et à 225 tours par minute.
   3. Récolte des bactéries par centrifugation à 4000 x g à 4 ° C pendant 10 min. Retirer le surnageant. Conserver le culot à -20 ° C jusqu'à utilisation.
   4. Ajouter1 ml d'un détergent de lyse cellulaire par 0,2 g de culot cellulaire. Remettre en suspension par pipetage et faire tourner doucement pendant 20 minutes pour lyser les cellules. Après la lyse, centrifuger à 16 000 x g et 4 ° C pendant 20 min. Pipeter le lysat soluble (surnageant) dans un nouveau tube de 1,5 ml.
   5. Utilisez une colonne de poids moléculaire de coupure de 3 kDa pour éliminer la biotine non liée. Pipeter le lysat dans la colonne, et centrifuger à 20 ° C selon les instructions du fabricant. Laver avec du PBS 1 x jusqu'à ce que la biotine dans le lysat a été dilué 100 fois, et le volume du lysat lavé est égal au volume initial du lysat. Transférer le lysat dans un nouveau tube.
2. Immobiliser l'antigène cible biotinylé sur des billes magnétiques revêtues de streptavidine.
   1. Préparer de 1 x PBS et 1 x PBS avec 0,1% (p / v) de BSA comme décrit dans l'étape 2.3.1.
   2. Préparer les billes magnétiques.
      REMARQUE: Ceci nécessite l'utilisation d'une grille de séparation magnétique.
      1. Resuspendre streptavidin revêtu des billes magnétiques dans leur flacon d'origine. Soit vortex pendant au moins 30 secondes ou tourner pendant 5 min.
      2. Transférer 7 à 10 × 10 ⁹ billes dans un tube de 1,5 ml.
         REMARQUE: le volume requis dépendra de la concentration de billes fourni par le fabricant.
      3. Placer le tube contenant les perles sur le porte-aimant pendant 2 minutes pour collecter les perles sur le côté du tube. Avec le tube toujours sur l'aimant, retirez délicatement le surnageant par pipetage sans perturber les perles.
      4. Pour laver, retirer le tube de l'aimant, et remettre en suspension les billes dans 1 ml de 1 x PBS par pipetage sans générer des bulles. Retour le tube à l'aimant pendant 2 minutes pour recueillir les perles, et retirer délicatement le surnageant par pipetage. Répétez le processus deux fois de plus pour un total de trois lavages. Veiller à ce qu'aucun liquide est laissé dans le tube après le lavage final.
   3. Ajouter le lysat contenant l'antigène biotinylé au bea magnétiqueds.
      1. Retirer le tube de l'aimant et remettre en suspension les billes dans 1 ml de lysat (étape 3.1.5). Incuber à température ambiante pendant 30 minutes tout en faisant tourner doucement.
      2. Placer le tube sur l'aimant pendant 3 min pour recueillir les billes revêtues d'antigène. Laver les billes revêtues cinq fois avec 1 x PBS avec 0,1% de BSA de la même manière que celle décrite dans les étapes 3.2.2.3 à 3.2.2.4. Après le lavage final, la remise en suspension des billes dans 1 x PBS avec 0,1% de BSA au même volume utilisé dans l'étape 3.2.2.2.
      3. Si l'antigène cible immobilisé est stable à 4 ° C, de stocker les billes revêtues à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire pour un balayage panoramique. Sinon, passez à l'étape 4.

4. Écran de la Bibliothèque scFv par Panning contre l'antigène cible (Figure 4)

Figure 4. Panning (étape 4). Antigen-billes magnétiques recouvertes are incubée avec des sphéroplastes exprimant des variants de la bibliothèque d'anticorps. L'ADN plasmidique de sphéroplastes liées aux billes est récupérée et utilisée pour générer une sous-banque qui est criblée en utilisant l'écran secondaire à base d'ELISA. Correspondantes étapes de protocole sont notées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

1. Incuber les billes revêtues avec sphéroplastes.
   1. Utiliser un sphéroplastes à perler rapport d'environ 5: 1. Ajouter 4 × 10 ⁹ sphéroplastes et 8 × 10 ⁸ perles dans un tube de 15 ml stérile.
      NOTE: Supposons que pas de cellules ont été perdus au cours du processus de sphéroplastes, de sorte que la concentration est encore 1 × 10 ¹⁰ sphéroplastes / ml.
   2. Ajouter 1 x PBS avec 0,1% de SAB pour porter le volume total à 4 ml. Aliquoter en quatre tubes de 1,5 ml avec 1 ml chacun. Incuber les réactions à 4 ° C pendant 5 heures tout en tournant doucement.
2. Prepare sphéroplastes liées aux billes pour une réaction en chaîne par polymérase (PCR).
   1. Placer les tubes de réaction panning sur l'aimant pendant 3 min. Retirer le surnageant par pipetage, et laver les sphéroplastes liées aux billes quatre fois avec de la glace froide 1 × PBS avec 0,1% de BSA de la même manière que celle décrite dans les étapes 3.2.2.3 à 3.2.2.4. Resuspendre les sphéroplastes liées aux billes dans chaque tube dans 25 pi d'eau distillée ₂ O. Stocker les perles à -20 ° C ou passez à l'étape 4.3.
3. Effectuer l'ensemble du plasmide PCR sur sphéroplastes liées aux billes pour amplifier les plasmides contenant les gènes de scFv liées aux billes.
   1. Obtenir des amorces avec les séquences suivantes: 5'CCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTG3 '(amorce directe) et 5'TAGCTCTTGATCCGGCAAACAAA3' (amorce inverse).
      NOTE: Ce sera lier bout à bout sur des brins opposés du plasmide pimd (figure 2) et sont conçus pour recuire à une caractéristique commune de pimd, donc l' amplification se produit quel que soit levariante séquence scFv.
   2. Phosphoryler les amorces.
      Remarque: l'absence de phosphorylation, re-ligature ne se produit. Les amorces peuvent également être commandés avec 5'-phosphorylation, plutôt que d'utiliser cette méthode de phosphorylation dans ce protocole.
      1. Dans un tube de 0,5 ml, mettre en place une réaction de phosphorylation pour l'amorce de PCR vers l' avant décrite dans le tableau 1. Répétez ce processus pour l'amorce inverse.
      2. Incuber les réactions à 37 ° C pendant 1 heure. Puis incuber à 65 ° C pendant 20 minutes pour désactiver le polynucleotide T4 kinase (PNK). Stocker les amorces phosphorylées à -20 ° C.
   3. Effectuer PCR.
      1. Dans un tube de PCR, préparer la réaction de PCR telle que décrite dans le tableau 2.
         NOTE: Les réactions multiples peuvent être préparés pour un rendement plus élevé. Les sphéroplastes liées aux billes non utilisés peuvent être conservés à -20 ° C.
      2. Chauffer les réactions de PCR à 98 ° C pendant 15 minutes dans un cycleur thermique pour assurer la pleine lyse des sphéroplastes. Retirer les tubes du cycleur thermique, et d'ajouter 0,5 ul d'une polymerase haute fidélité à chacun. Tubes Retour au cycleur thermique et exécuter en utilisant le programme détaillé dans le tableau 3.
      3. Réunir les produits de PCR, le cas échéant. Conserver à -20 ° C ou passez à l'étape 4.4.

Tableau 1. PNK réaction de phosphorylation (étape 4.3.2.1).

Réactif	Volume (ul)
H2O distillée	15
un tampon de réaction de ligase T4 ADN 10x	2
100 pM amorce	2
T4 Polynucleotide kinase (PNK)	1

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "fo: keep-with-next.within page =" always "> Tableau 2. réaction PCR entier plasmide (étape 4.3.3.1).

Réactif	Volume (ul)
H2O distillée	28,5
tampon 5x haute fidélité de la polymérase	dix
amorce sens 10 uM phosphorylée	2.5
amorce antisens 10 uM phosphorylée	2.5
40 mM dNTP mix (10 mM de chaque dNTP)	1
sphéroplastes de perles assorties	5

Programme Tableau 3. PCR (étape 4.3.3.2).

Étape	Température (° C)	Temps (min: sec)	Nombre de cycles
denature initiale	98	00h30	1
Dénaturer	98	00h10	35
recuit	69	00h30
Extension	72	0:30 par kb
L'extension finale	72	06h00	1
Tenir	12	Infini	1

4. Re-circulariser les produits entiers plasmidique PCR, et utiliser le produit ligaturé pour transformer MC4100 E. cellules de E. coli.
   1. On purifie le produit PCR en exécutant la réaction de PCR sur un gel d'agarose à ^23, la coloration de l'ADN dans le gel ^23, et en utilisant unkit de nettoyage de gel pour purifier le plasmide linéarisé en suivant les instructions fournies par le fabricant. Mesurer la concentration à l'aide d'un spectrophotomètre à 260 nm. Stocker le fragment purifié à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire, ou passez à l'étape 4.4.2.
   2. Re-circulariser le plasmide à partir du produit de PCR.
      1. Pour empêcher la ligature intermoléculaire du produit de PCR, effectuer la réaction de ligature avec une faible concentration ²⁷ de 1 ng / pl de produit PCR. Calculer le volume nécessaire pour la préparation d'une réaction de ligature 800 ul à cette concentration.
      2. Préparer la réaction de ligature sur la glace. Dans un tube, ajouter le volume calculé à l' étape 4.4.2.1 du produit de PCR, 80 ul de tampon de ligase 10X de l' ADN et _H2O distillée jusqu'à 800 ul. Ajouter 4 ul d'ADN ligase de T4, et placer immédiatement les tubes à 16 ° C dans un bain d'eau ou thermocycleur. Incuber à 16 ° CO / N pour 14 à 18 ans h. Stocker les réactions de ligature terminé à -20 ° Cjusqu'à ce que nécessaire, ou passer à l'étape 4.4.3.
   3. Placer la réaction de ligature sur un bloc chauffant à 65 ° C pendant 15 min à la chaleur inactiver l'ADN ligase. Ensuite, utilisez un kit de membrane de microdialyse ou de l'ADN de nettoyage pour dessaler l'ADN ligaturé. Conserver à 20 ° C ou passez à l'étape 4.4.4.
   4. Utilisez le, produit toute inactivé à la chaleur de-salé ligature pour transformer MC4100 E. ²³ cellules de E. coli. Préparer les stocks de glycérol, tel que décrit à l'étape 1.3, des cellules contenant le sous-banque batée résultant, et aliquotes stocker à -80 ° C.
5. Répétez l'étape 4 dans son intégralité à l'aide d'une aliquote de l'étape 4.4.4 pour faire une deuxième panoramique sur la sous-banque.
   REMARQUE: Un deuxième panoramique permet d' enrichir pour les constituants de bibliothèque qui se lient bien à l'antigène cible ^19.

5. Effectuer un écran secondaire à l'aide d'un dosage immunoenzymatique Méthode enzymatique liée à l'identification des clones prometteurs pour une caractérisation (Figure 5)

Dépistage ELISA de Figure 5. secondaire (étape 5). Variantes (A) de la bibliothèque de la sous - bibliothèque enrichie pendant le panoramique sont inoculées dans des puits individuels d'une plaque de culture pour la croissance et l' expression. (B) Une plaque ELISA revêtue d' un antigène cible. (C) Les variantes de la bibliothèque sont criblées en utilisant l'écran secondaire à base d'ELISA décrit dans le protocole. Lors de l'analyse des données obtenues à partir de l'écran secondaire, des variantes d'intérêt sont sélectionnés et caractérisés davantage. Correspondantes étapes de protocole sont notées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

1. Décongeler un tube de la sous-banque batée (de l'étape 4.4.4) et de la plaque sur des plaques d'agar LB. Plate plusieurs dilutionsà des concentrations suffisamment faibles pour assurer des colonies individuelles (par exemple, 10 ² - 10 ⁶ dilutions -fold). Incuber les plaques pendant 15 à 18 heures à 37 ° C. Stocker les plaques à 4 ° C ou passez à l'étape 5.2.
2. Culture et induire des colonies de la sous-banque batée. Effectuer toutes les étapes dans des conditions stériles. Utilisez une pipette multicanaux pour les étapes impliquant des plaques à 96 puits.
   1. Ajouter 200 pi de LB avec 20 ug / ml cm dans chaque puits d'une plaque à 96 puits de culture à fond rond.
   2. Choisissez une colonie individuelle de la plaque de gélose avec une pointe de pipette, placer la pointe dans le premier puits de la plaque de 96 puits, et remuer doucement pour inoculer. Utiliser un nouvel embout pour chaque puits. Inoculer une colonie dans chaque puits. En tant que témoin, comprennent au moins un contrôle de stérilité bien avec aucune colonie inoculées.
   3. Répétez les étapes 5.2.1 et 5.2.2 pour inoculer plusieurs plaques à 96 puits.
   4. Placer les plaques à 96 puits sur un agitateur de microplaque à 310 tours par minute. Incuber à 376; C pendant 20 à 24 heures pour exprimer les scFv.
3. Pour chaque plaque de culture préparé à l'étape 5.2, manteau une plaque à 96 puits ELISA avec l'antigène cible.
   1. Diluer l' antigène cible purifié à une concentration appropriée (par exemple, 1 pg / ml à 4 mg / ml) dans 1 x PBS pour rendre la solution de revêtement. Faire 5 ml d'une solution de revêtement pour chaque plaque à 96 puits.
      NOTE: La concentration appropriée dépend de l'antigène spécifique utilisé et peut être nécessaire d'ajuster.
   2. Ajouter 50 ul de la solution de revêtement pour chaque puits d'une plaque de polystyrène clair 96 puits à haute liaison ELISA. Tapoter doucement la plaque sur la surface de la paillasse pour assurer que toute la surface de chaque puits est revêtue. Répétez l'opération pour chaque plaque. Incuber les plaques à 4 ° CO / N.
4. Répliquer les colonies provenant des plaques de culture à 96 puits sur des plaques d'agar-agar.
   1. Placez un polystyrène réplicateur stérile dans les puits d'une plaque de culture pour recueillir une petite quantité de savon mouid. Soulevez avec précaution le réplicateur et le transfert à une plaque de gélose LB 15 cm de telle sorte que tous les conseils sont en contact avec la plaque. Une fois que le liquide a transféré, soulevez le réplicateur directement vers le haut. Répétez l'opération pour chaque plaque de culture.
   2. Étiquette de la plaque de gélose avec l'orientation correcte de sorte que les résultats de l'écran secondaire dans la plaque de 96 puits peuvent être jumelés à la colonie répliquée correcte sur la plaque, si une caractérisation plus poussée est souhaitée. Cultivez à 37 ° C pendant 15 à 18 heures, puis stocker à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
5. Effectuer l'écran secondaire ELISA.
   1. Préparer la solution de blocage en faisant 2% (p / v) de lait en poudre dans 1 x PBS. Vider la solution de revêtement des plaques ELISA. Ajouter 100 ul de la solution de blocage dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant au moins 2 heures, ou le bloc O / N à 4 ° C.
   2. Préparer le tampon de lavage en ajoutant le polysorbate 20 à une concentration finale de 0,05% dans 1 x PBS. Faire 250 ml par plaque ELISA.
   3. Ajouter 20 ul d'uneconcentré détergent lyse cellulaire à chaque puits de la plaque de culture à fond rond et incuber la plaque de culture sur un agitateur de microplaque à température ambiante pendant 15 à 20 min. Commencer la lyse en même temps que le blocage des plaques ELISA est terminée de sorte que la lyse et le lavage à l'étape 5.5.4 peuvent être effectuées simultanément.
   4. Vider la solution de blocage des plaques ELISA. Laver les plaques ELISA bloqués quatre fois avec 200 pi de tampon de lavage par puits par lavage. Vider le tampon de lavage dans les puits.
   5. Transfert de 50 pi de chaque puits de la plaque de lyse cellulaire au puits correspondant de la plaque ELISA, en utilisant une nouvelle astuce pour chaque puits. Incuber la plaque ELISA à température ambiante pendant 1 ou 2 heures.
   6. Préparer la solution d'anticorps pour détecter les scFv liés.
      1. Utiliser une peroxydase de raifort (HRP) conjugué à un anticorps primaire qui se lie au marqueur épitopique FLAG fusionné au scFv de la bibliothèque.
      2. Diluer l'anticorps à la dilution appropriée à utiliser dans un test ELISA (voir le fournisseur & #39; s recommandations) à 2% (p / v) de lait sec dans 0,05% de polysorbate 20 dans 1 x PBS. Préparer 5 ml pour chaque plaque.
   7. Laver les plaques ELISA quatre fois avec le tampon de lavage tel que décrit à l'étape 5.5.4.
   8. Ajouter 50 ul de la solution d'anticorps dans chaque puits de la plaque ELISA. Incuber pendant 2 heures à 1 à la température ambiante.
   9. Préparer le substrat HRP en dissolvant o phénylènediamine dichlorhydrate (OPD) comprimés dans H ₂ O distillée selon le protocole du fabricant tout en évitant la lumière. Préparer 20 ml par plaque ELISA.
   10. Préparer 3 MH ₂ SO ₄ par dilution de H ₂ SO ₄ concentré avec _H2O distillée, si nécessaire. Préparer 5 ml par plaque ELISA.
       Attention: H ₂ SO ₄ est un acide fort. Assurez-vous de porter un équipement de protection individuelle approprié.
   11. Laver les plaques ELISA à quatre reprises avec du tampon de lavage, comme décrit dans l'étape 5.5.4.
   12. Incuber les plaques ELISA avec le SUBSTRA HRPte.
       1. Ajouter 200 pi de substrat de HRP dans chaque puits. Pour réduire au minimum l'exposition lumineuse, ajouter le substrat à une plaque ELISA à la fois, et l'envelopper de papier d'aluminium avant de passer à la plaque suivante. Incuber les plaques pendant 30 à 60 min à température ambiante dans l'obscurité.
       2. Après les 30 premières minutes, vérifier les plaques d'assombrissement du substrat, et incuber plus si nécessaire pour visualiser le développement de la couleur.
   13. Ajouter 50 ul de 3 MH ₂ SO ₄ à chaque puits pour arrêter la réaction. En utilisant une pointe différente pour chaque puits, mélanger la solution dans les puits par pipetage de haut en bas, sans faire mousser. Par souci de cohérence et d'éviter la saturation, ajouter le H ₂ SO ₄ rapidement et soigneusement à l' ensemble des plaques ELISA avant de mélanger la solution pour chaque plaque.
   14. Mesurer l'absorbance de la solution dans les puits de chaque plaque à 492 nm en utilisant un lecteur de plaque.
   15. Analyser les données d'absorbance pour identifier scFv variantes que exhibil promet des signaux de liaison et de caractériser ces scFv prometteurs. Sélectionnez scFv qui présentent des signaux d'absorbance plus élevées que le signal de fond et plus élevé que le signal moyen sur chaque plaque.
       NOTE: Le niveau d'absorption dépendra des propriétés de l'antigène et de l'anticorps anti-FLAG utilisés, ainsi que la force des variantes scFv qui ont été isolées dans le criblage.

Résultats

Le pliage de la protéine mécanisme de contrôle de la qualité intracellulaire de la voie Tat chez E. coli limite le transport à travers la membrane cellulaire interne à des protéines qui sont bien pliées dans l'environnement cytoplasmique réducteur. En surexprimant une fusion d'un scFv à la séquence de signal ssTorA (la séquence signal de la protéine TorA, qui est naturellement transportées par la voie Tat ^20), la translocation est bloqué, ce qui entraîne l' affichage de scFv sur la membrane interne ^19. Après rupture enzymatique de la membrane externe, les anticorps affichés sont mis à disposition pour le criblage pour l'activité de liaison à l'antigène. La capacité à tirer parti de la voie Tat pour l' affichage scFv a été montré par Karlsson et al. ¹⁹ (Figure 6). Les anticorps scFv scFv13 et scFv13.R4 ont été fusionnés soit la séquence ssTorA native ou un ssTorA modifié qui n'a pas la paire de résidus arginine-arginine reconnu parla voie Tat. scFv13.R4 a été conçu par Martineau et al. de scFv13 grâce à quatre tours de l' évolution dirigée et est connu pour bien plier dans le cytoplasme ^9. Ce scFv a été affiché sur la membrane intérieure, mais seulement lorsqu'il est exprimé en tant que fusion à la séquence native de signal ssTorA (figure 6). Au contraire, scFv13 est pas bien plié cytoplasme ^9, donc il est pas bien affiché sur la membrane interne, quelle que soit la séquence de signal auquel il est fusionné. En outre, si les scFv ont été exprimés dans des cellules qui ne disposaient pas de la protéine TATC, une composante essentielle de la machine Tat ^20,28, l' affichage n'a pas été observée, montrant le lien important entre l' affichage membrane interne et la voie Tat. Ces résultats montrent que seules les protéines qui contiennent le peptide signal Tat et qui sont correctement repliées dans le cytoplasme sont affichés sur la membrane intérieure, ce qui permet le transport à travers la voie Tat pour fonctionner comme un écran pour fol intracellulaireding.

Figure 6. Détection de scFv affichés sur la membrane interne. Cytométrie de flux analyse a été effectuée pour détecter l'affichage de mal plié scFv13 et bien plié scFv13.R4 sur la membrane interne. scFv ont été fusionnés à ssTorA native ou ssTorA (KK), où la paire Arg-Arg dans la séquence a été modifiée pour ssTorA Lys-Lys. Les balises C-terminal épitope FLAG sur les scFv ont été détectés avec un isothiocyanate de fluorescéine (FITC) anticorps anti-FLAG. Les cellules sans la protéine TATC (ΔtatC) et ssTorA-scFv13 sans l'étiquette FLAG ont été testés comme témoins. M indique la valeur médiane de la fluorescence. Reproduit de référence ¹⁹ avec la permission. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

19. Pour le démontrer, une bibliothèque PCR sujette aux erreurs sur la base de scFv13, qui a un niveau d'affinité de liaison pour les β-galactosidase faible, a été éreinté contre l'antigène cible β-galactosidase en utilisant l'affichage et de panoramique méthode décrite dans le protocole. scFv 1-4 a été isolé après un tour de mutagenèse et de panoramique, et présentait une affinité de liaison supérieure à la ß-galactosidase que scFv13 (figure 7A) et un niveau plus élevé de solubilité cytoplasmique (figure 7B).

Une nouvelle bibliothèque, sur la base de scFv 1-4, a été faite par PCR sujette à l'erreur, et le panoramique de cette bibliothèque de deuxième génération contreβ-galactosidase a été effectuée en utilisant une modification du protocole décrit. Le panoramique contre β-galactosidase pour le second tour de l'évolution a été faite en présence de purifiée, soluble scFv 14 comme un concurrent pour améliorer la probabilité d'isoler des clones avec une affinité supérieure scFv 1-4. Après ce deuxième cycle de mutagenèse et de panoramique, scFv 2-1 et 2-3 scFv ont été isolés en utilisant le criblage secondaire à base d'ELISA. Ces scFv non seulement présentent une affinité de liaison plus élevée pour les β-galactosidase que scFv13, mais aussi présenté une meilleure liaison que le clone de première ronde scFv 1-4. scFv 01/02 présentait β-galactosidase de liaison comparable à celle de scFv13.R4 (figure 7A). scFv 2-3 montre également une nouvelle augmentation de la solubilité cytoplasmique par rapport à scFv 14, mettant en évidence l'ingénierie simultanée de solubilité et de liaison d'antigène. Etant donné que l'affinité et l'expression soluble des scFv sont criblés pour en même temps, il est possible qu'un scFv sélectionné a modnérer solubilité, mais haute versa liaison ou vice. Par exemple, scFv 01/02 a l'expression soluble inférieure à celle scFv 2-3, mais il présente une affinité de liaison supérieure à la ß-galactosidase.

Figure 7. Cible de liaison et d' expression cytoplasmique de scFv variants isolés en utilisant l' affichage membrane interne. (A) scFv ont été exprimées dans le cytoplasme de E. coli (par exemple des cellules., sans la séquence signal ssTorA) avec une hexahistidine (6 × -Son) tag et purifiée en utilisant l' acide spin-colonnes de nickel-nitrilotriacétique. La liaison du scFv purifiées à la ß-galactosidase a été mesurée par un test ELISA. scFv purifiées ont été chargés sur des plaques ELISA β-galactosidase revêtues et les scFv liés ont été détectés avec un anticorps anti-6 x His. Les données sont une moyenne de six répétitions, et la barre d'erreur indique l'erreur standard de la moyenne.(B) Les fractions solubles et insolubles des lysats cellulaires provenant de cellules exprimant scFv cytoplasmique ont été analysés par Western blot sondé avec un anticorps anti-6 x His. La concentration totale des protéines a été utilisée pour normaliser le chargement des échantillons. Reproduit (A) et adapté (B) de référence ¹⁹ avec la permission. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Ingénierie des anticorps pour l' activité cytoplasmique est une tâche difficile en raison du milieu réducteur du cytoplasme, ce qui empêche la formation de liaisons disulfure stabilisant à ^6,7. Cela provoque la plupart des anticorps pour être inactif dans le cytoplasme, sauf si elles sont conçues pour assurer la stabilité et la solubilité dans le cytoplasme, en plus d'être conçu pour une affinité de liaison. Les méthodes de phage display, affichage de la surface bactérienne, et les méthodes d'affichage de surface de levure existantes tout utiliser la voie sécrétoire ^14-16 pour l'affichage des anticorps génétiquement modifiés , mais ces méthodes ont aucun moyen de pliage ingénieur intracellulaire. Anticorps modifiés génétiquement en utilisant l'affichage membrane interne ont permis d'améliorer la stabilité et la solubilité dans cytoplasmique parce que le contrôle de la qualité du repliement de la voie Tat empêche la translocation des anticorps qui sont mal repliées et instables dans le cytoplasme. Cette méthode simplifie le processus itératif d'anticorps intracellulaires d'ingénierie pour l'affinité d'unnd solubilité, comme les deux propriétés sont conçues en une seule étape. Bien que ce procédé a été conçu pour l'ingénierie des anticorps ayant une solubilité dans l'environnement intracellulaire réducteur, il pourrait également être appliquée à des anticorps d'ingénierie pour fonctionner dans des conditions non réductrices, étant donné que les protéines conçues en utilisant cette méthode conservent leur pliage dans l'environnement oxydant du périplasme.

Bien que cette technique simplifie le processus d'ingénierie des anticorps avec une affinité élevée et une haute solubilité cytoplasmique, plusieurs limitations sont importants à considérer lors de l'utilisation de ce protocole. Lors de l'analyse des signaux ELISA écran secondaire pour identifier des variants prometteurs scFv, le seuil pour discerner entre les variantes potentiellement intéressantes et celles qui ne peuvent pas exposer adéquate liaison à l'antigène ne sont pas susceptibles d'être apparent qu'après plusieurs clones ont été caractérisés davantage. Il est important de rechercher une liaison améliorée sur l'anticorps parent; cependant,un signal anormalement élevé pourrait être le signe de l' avidité ²⁹ ou des effets d'agrégation ^30, un défi qui est pas unique à l'approche de criblage d'affichage membrane interne. Une limitation clé à retenir lors de l'utilisation de ce protocole est l'incapacité de récupérer sphéroplastes après le panoramique, car ils sont non-viables (données non publiées). Cela nécessite l'amplification de l'ADN et de transformation des mesures pour récupérer les plasmides codant pour les anticorps.

Plusieurs étapes critiques du protocole permettent l'ingénierie simultanée de pliage et de liaison des anticorps. Pour le dépistage, pour réussir, la bibliothèque scFv projeté doit être exprimé comme une fusion au signal peptide ssTorA. Sans cette séquence, les anticorps ne seront pas dirigés vers la voie Tat et ne seront donc pas translocation vers le périplasme ^19. En outre, il est impératif qu'un marqueur d'épitope C-terminale est fusionnée à des anticorps pour permettre la détection des anticorps présentés dans le bacdosages ding. Il est clair que E. coli utilisé pour exprimer les scFv doit également avoir la machinerie de la voie Tat nécessaire, mais cela est vrai du E. couramment utilisé souches de E. coli.

Les modifications apportées à ce protocole sont possibles pour améliorer son potentiel pour isoler des anticorps avec les caractéristiques souhaitées. Une étape de balayage panoramique soustractive peut être complété avant lavage contre l'antigène cible pour épuiser la bibliothèque scFv des constituants non désirés. Les sphéroplastes de la bibliothèque peuvent être incubées avec des billes magnétiques revêtues d'BCCP seul ou enduit d'une protéine non désirée et les sphéroplastes qui se lient à ces billes peuvent être éliminés avant le criblage des sphéroplastes non liés restants pour se lier à la cible souhaitée. Comme indiqué dans les résultats représentatifs, un procédé pour améliorer l'affinité d'un scFv isolé est d'inclure un concurrent soluble dans la réaction de panning pour rivaliser avec les scFv affichées sur les sphéroplastes. Parce que l'échantillon solubleetitor est une protéine purifiée, aucun ADN est amplifié à partir d'elle, de sorte que seules des séquences de scFv présentées sur les sphéroplastes seront récupérés dans la réaction PCR. En outre, cette méthode pourrait être étendue à d'autres types d'ingénierie d'anticorps ou de protéines de liaison non-anticorps.

E. affichage membrane interne coli est une plate - forme puissante pour les anticorps d'ingénierie avec une affinité élevée et des niveaux élevés de solubilité intracellulaire. Cette méthode est particulièrement adaptée pour l'ingénierie efficace des anticorps conçus pour fonctionner dans l'environnement intracellulaire. Ces anticorps intracellulaires sont déjà explorés en tant qu'agents thérapeutiques potentiels dans un certain nombre de domaines, y compris les maladies neurodégénératives, le cancer et les infections virales ^31. Cette technique permettra une utilisation plus répandue des anticorps intracellulaires comme outils de recherche et de la médecine dans ces domaines et dans tout autre domaine où l' étude d' une protéine cible in situ est souhaitée.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
	bibliothèque scFv appropriée doit être obtenue auprès d’une source commerciale ou universitaire.
MC4100 Cellules E. coli	Centre de stock génétique Coli	6152	Les cellules doivent être chimiquement compétentes ou électrocompétentes, selon la méthode de transformation choisie.
Glycérol	Fisher Scientific	BP229-4
Milieux de culture déshydratés Difco LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	BD	244610
Chloramphénicol (Cm)	Fisher Scientific	BP904-100
Chlorure de sodium (NaCl)	Fisher Scientific	BP358-1
Chlorure de potassium (KCl)	Fisher Scientific	BP366-500
Phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4)	Fisher Scientific	BP332-500
Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)	Fisher Scientific	BP362-500
Albumine sérique bovine (BSA)	Fisher Scientific	BP9706-100
Saccharose	Fisher Scientific	BP220-1
Base Tris	Fisher Scientific	BP1521
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 0,5 M	Fisher Scientific	BP2482-500
Chlorure de magnésium (MgCl2)	Fisher Scientific	BP214-500
Lysozyme	Sigma Aldrich	L3790-10X1ML
Mélangeur vortex	VWR	97043-564
Bicine	Fisher Scientific	BP2646100
D-Biotine	Fisher Scientific	BP232-1
Isopropyl &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside	Fisher Scientific	BP1755-1
BugBuster Master Mix (détergent à lyse cellulaire)	EMD Millipore	71456
Vivaspin 2 MWCO, 3 000  ; daltons	GE Healthcare Sciences	28932240
Antigène cible	Varie	N/A	L’antigène cible purifié peut être acheté ou produit/purifié.
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Invitrogen	65601
Aimant Dynamag-2	Invitrogen	12321D
Rotateur de tube	VWR	13916-822
Amorces PCR	IDT	N/A	Les séquences d’amorces sont décrites dans le protocole.
10x tampon de réaction de ligase d’ADN T4	New England BioLabs	B0202S
T4 Polynucelotide kinase (PNK)	New England BioLabs	M0201S	Assurez-vous que le tampon de ligase T4 utilisé dans la réaction de phosphorylation de l’amorce contient 1 mM d’ATP.
5x Phusion HF buffer pack	New England BioLabs	B0518S
Mélange de solution de désoxynucléotide (dNTP), 10 mM chacun dNTP	New England BioLabs	N0447L
Phusion DNA polymérase	New England BioLabs	M0530S	D’autres polymérases haute fidélité peuvent être utilisées comme alternative, mais la température de recuit en Tableau 3 doit être ajustée.
Thermocycleur C1000 Touch avec double module de réaction rapide 48/48	Bio-Rad	185-1148
Agarose	Promega	V3121
SYBR Coloration sûre du gel d’ADN	Invitrogen	S33102
Wizard SV système de nettoyage et PCR	Promega	A9281
T4 ADN ligase	New England BioLabs	M0202S
Microdialyse filtre à membrane	EMD Millipore	VSWP04700
Agar	BD	214030
Plaques de culture cellulaire à fond rond en polystyrène à 96 puits	VWR	10062-902
Costar Couvercles de plaques de test en polystyrène général	Corning	3931
Agitateur de plaques de microtitrage	VWR	12620-926
Costar 96 puits EIA/RIA Easy Wash transparent à fond plat polystyrène à liaison élevée Microplaque	Corning	3369
Bel-buvard polycarbonate 96 puits outil de réplication	Bel-Art Produits	378760002
Lait écrémé instantané en poudre	Qualité Biologique	A614-1000
Tween 20 (polysorbate 20)	Fisher Scientific	BP337-500
Réactif PopCulture (détergent concentré à lyse cellulaire)	EMD Millipore	71092-3
Anticorps monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxydase(HRP) produit chez la souris	Sigma Aldrich	A8592
SigmaFast OPD	Sigma Aldrich	P9187-50SET
Acide sulfurique (H2SO4), 10  ; N solution	Fisher Scientific	SA200-1
Reynolds Wrap feuille d’aluminium	VWR	89079-075
Spectrophotomètre de microplaques BioTek Epoch	Fisher Scientific	11120570