le Drosophila Imaginal Tumor Disc Modèle: Visualisation et quantification de l'expression génique et de tumeurs invasives utilisant Mosaïques génétique

Résumé

Ce protocole montre comment générer des tumeurs clonales marquée par fluorescence, génétiquement définis dans l'œil de Drosophila / disques imaginaux antennaires (EAD). Il décrit comment disséquer l'EAD et le cerveau à partir du troisième stade larvaire et comment les traiter pour visualiser et quantifier les changements d'expression des gènes et l'invasivité des tumeurs.

Résumé

Drosophila melanogaster est apparu comme un système expérimental puissant pour les études fonctionnelles et mécanistes du développement et de la progression tumorale dans le contexte d’un organisme entier. Des techniques sophistiquées pour générer des mosaïques génétiques facilitent l’induction de clones visuellement marqués, génétiquement définis, entourés de tissus normaux. Les clones peuvent être analysés par diverses approches moléculaires, cellulaires et omiques. Cette étude décrit comment générer des tumeurs clonales marquées par fluorescence de malignité variable dans l’œil/les disques imaginaux antennaires (EAD) des larves de drosophile en utilisant la technique d’analyse en mosaïque avec un marqueur cellulaire répressible (MARCM). Il décrit les procédures permettant de récupérer la mosaïque EAD et le cerveau des larves et comment les traiter pour l’imagerie simultanée de rapporteurs transgéniques fluorescents et la coloration des anticorps. Pour faciliter la caractérisation moléculaire du tissu mosaïque, nous décrivons un protocole d’isolement de l’ARN total de l’EAD. La procédure de dissection est adaptée pour récupérer l’EAD et le cerveau de n’importe quel stade larvaire. Le protocole de fixation et de coloration des disques imaginaux fonctionne avec un certain nombre de rapporteurs transgéniques et d’anticorps qui reconnaissent les protéines de la drosophile. Le protocole d’isolement de l’ARN peut être appliqué à divers organes larvaires, à des larves entières et à des mouches adultes. L’ARN total peut être utilisé pour le profilage des modifications de l’expression génique à l’aide d’approches candidates ou à l’échelle du génome. Enfin, nous détaillons une méthode de quantification du caractère invasif des tumeurs clonales. Bien que cette méthode ait une utilisation limitée, son concept sous-jacent est largement applicable à d’autres études quantitatives où les biais cognitifs doivent être évités.

Introduction

Le cancer représente l'un des groupes les plus génétiquement hétérogène de maladies, dont l'incidence et la mortalité est considérablement augmenter, en particulier chez les personnes âgées dans le monde entier. Le cancer provient clonale d'une cellule tumorale initiatrice qui échappe des mécanismes suppresseurs de tumeur inhérente et se divise hors de contrôle. L'accumulation progressive de lésions génétiques qui favorisent la collaboration la croissance, la prolifération et la motilité tout en inhibant la mort et la différenciation transforme la surcroissance bénigne initiale dans une tumeur très maligne, métastatique et mortelle. Il est devenu évident qu'en plus des altérations génétiques, la progression de la tumeur nécessite des changements dans le stroma environnant et la diaphonie entre les types de cellules tumorales et de multiples (par exemple, des fibroblastes et des cellules immunitaires endothéliales) dans son micro - environnement. Comprendre les principes moléculaires sous-jacents, y compris la transformation maligne interactions tumeur-stroma est d'une grande importance pour le développement de prévention et le dépistage précoce des stratégies, ainsi que des traitements nouveaux et efficaces pour lutter contre les métastases du cancer et de la résistance aux médicaments.

La mouche des fruits Drosophila melanogaster est devenu un système attrayant pour la recherche sur le cancer ^1-4 en raison de son temps de génération rapide, remarquable conservation des noeuds entre les mouches et les humains, la redondance génétique limitée et la richesse des outils génétiques avancées qui facilitent la manipulation de presque tout gène dans la signalisation d'une manière temporaire et dans l'espace restreint. Les tumeurs génétiquement définies de malignité variable peuvent être conçus de façon reproductible chez la drosophile en introduisant des mutations perte et intensité forte de fonction dans un sous - ensemble de progéniteurs dans un tissu de type sauvage par ailleurs en utilisant la technique de ⁵ marcm. L'outil de marcm combine FLP / FRT (FLP recombinase / FLP Reconnaissance cible) médiée recombinaison mitotique ⁶ avec FLP-out ⁷ et Gal4 / UAS (Upstream Activation Séquence) gène ⁸ cibleLes systèmes d'expression ^9. Avec cette méthode, l'expression d'un transgène à base UAS, y compris oncogène ou des ADNc de protéines fluorescentes ou répétitions d'ADN inversées pour le silençage génique ARNdb-induite, sera limitée à un clone de cellules qui ont perdu un locus génétique spécifique et un répresseur Gal4 due à la recombinaison (figure 1A). Patches clonales marqués avec fluorescente verte (GFP) ou des protéines fluorescentes rouges (par exemple, RFP, DsRed, mCherry) peut facilement être suivis tout au long du développement, isolé et analysé. Surtout, leur comportement peut être comparé directement au tissu adjacent sauvage de type. Ainsi, des questions pertinentes à la cellule des effets autonomes et non autonomes de lésions génétiques peuvent être facilement étudiées. Comme pour les mammifères, seuls clones dans lesquels de multiples lésions oncogéniques sont combinés deviennent malignes chez la drosophile et récapitulent caractéristiques clés du cancer chez les mammifères. Ils overproliferate, échapper à l'apoptose, provoquer l'inflammation, devenir immortel et Invasive, finalement tuer l'hôte ^10-17.

Ici, nous décrivons un protocole pour générer des tumeurs clonales génétiquement définies dans le tissu oculaire / antennaire et le cerveau des larves de drosophile en utilisant la technique de marcm. La méthode repose sur un testeur de stock marcm qui exprime la levure FLP recombinase sous le contrôle de l'amplificateur eyeless (eyFLP) ^18,19. De cette manière, les clones GFP marquées sont générées à la fois dans l' épithélium cylindrique peripodial et de l'EAD et le neuroépithélium du cerveau à travers les stades embryonnaire et larvaire (figure 1A, B et référence ^20). Les clones peuvent être facilement suivis jusqu'à l'âge adulte que l'EAD se développe dans l'œil adulte, l'antenne et la tête tandis que la capsule neuroepithelium donne lieu à des neuroblastes qui produisent des neurones du lobe optique différenciés.

Pour faciliter une caractérisation moléculaire, fonctionnelle et phénotypique du tissu mosaïque, nous describe un protocole pour la dissection de l'EAD et le cerveau à partir du troisième stade larvaire et décrire la façon de les traiter pour les trois applications différentes: (i) la détection des reporters fluorescents transgéniques et immunomarquage, (ii) la quantification de l'invasivité de la tumeur et (iii) l'analyse des modifie l' expression du gène en utilisant une PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) ou d' un ARNm de séquençage à haut débit (ARNm-seq) (figure 1C).

Le protocole d'immunocoloration peut être utilisé pour visualiser toute protéine d'intérêt avec un anticorps spécifique. Transgenic reporters de transcription fluorescentes fournissent des informations spatiotemporelle pratique et précise sur l'activité d'une voie de signalisation particulière. journalistes spécifiques Cell-lignage, d'autre part, tenir compte des changements qualitatifs et quantitatifs dans les populations de cellules dans le tissu mosaïque et parmi les tumeurs de génotypes distincts. Quantification de comportement invasif facilite la comparaison de malignité de la tumeur entre le génotypes. Enfin, le protocole décrivant la collecte et le traitement de l'EAD mosaïque pour l'isolement de l'ARN est adapté pour les applications en aval petite et à grande échelle tels que la transcription inverse suivie par qRT-PCR et pangénomique ARNm-seq, respectivement. Les données qualitatives et quantitatives obtenues à partir de ces essais fournissent de nouveaux aperçus sur le comportement social des tumeurs clonales. De plus, ils produisent une base solide pour des études fonctionnelles sur le rôle des gènes individuels, des réseaux génétiques et microenvironnement de la tumeur dans les différentes étapes et les aspects de la tumorigenèse.

Protocole

NOTE: Ce travail utilise le eyFLP1; acte> y ^+> Gal4, UAS-GFP; FRT82B, baignoire-GAL80 marcm 82B ligne verte testeur ^11. Traversant les marcm 82B verts testeur vierges aux mâles de souches telles que w; UAS-a; UAS-b ^ARNi, FRT82B c ^mut génotype donnera une descendance dans laquelle la recombinaison mitotique se produira entre le bras droit de la 3 ^ème chromosomes homologues. De cette manière, les clones mutants homozygotes pour le gène c situé distal par rapport au site de FRT82B sera généré au sein de la EAD et le cerveau neuroepithelium. Ces clones expriment la GFP, transgène a et ARNdb pour le gène b (figure 1A). Plusieurs lignes de testeur eyFLP-marcm pour la recombinaison sur le X, 2L, 2R, 3L et 3R ont été établis et sont disponibles au sein de la communauté à la mouche.

1. Fly Manipulation, Croix, et Staging

1. Développez le testeur de marcm mère appropriée à la température ambiante en peuplant bo multiplesttles en même temps. Retournez les adultes dans des bouteilles fraîches tous les 2-3 jours afin que suffisamment vierges peuvent être collectées pour des croisements ultérieurs.
   NOTE: Lors de la collecte des vierges, éviter une exposition prolongée au CO ₂ comme cela compromet la fécondité féminine.
2. Selon l'échelle de l'expérience, mettre en place des croix de mouche dans des flacons en utilisant au moins 10 marcm vierges testeur et 4 mâles (par exemple, pour l' imagerie des reporters fluorescents et immunocoloration) ou dans des bouteilles avec au moins 30 vierges et 10 mâles (par exemple, pour l'isolement de l'ARN et la quantification de l'invasivité).
3. Soulever une descendance à 25 ° C sous une longue journée de cycle de lumière-obscurité / 8 h 16 h. Retournez les parents dans de nouveaux flacons / bouteilles toutes les 24 heures afin de faciliter la mise en scène reproductible des larves et pour éviter le surpeuplement.
   NOTE: À partir du jour 6 après la ponte (AEL), la fin du troisième contrôle de l'alimentation larvaire d'arrêt de larves, commencer à errer et entrez nymphose. En revanche, le début de la transition des larves-pupe peut être délayed ou inexistante dans les larves avec EAD portant des tumeurs clonales hyperplasiques ou malignes.

2. Collecte troisième stade larvaire

1. Pour immunocoloration, recueillir environ 20 la fin du troisième stade larvaire (errant sur le mur et ceux d'une taille corporelle comparable de la nourriture). Utilisez une pince pour ramasser doucement les larves du flacon ou une bouteille et de les transférer dans un plat en verre d'embryon rempli de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   1. Pour l'isolement de l'ARN et la quantification de l'invasivité, recueillir au moins 80 la fin du troisième stade larvaire (errant sur le mur et ceux d'une taille corporelle comparable de la nourriture). Utilisez un vaporisateur pour faire gicler du PBS dans une bouteille de mouche contenant des larves jusqu'à ce que la surface est couverte.
   2. Ramollir les couches supérieures de la nourriture avec une spatule et versez la purée de nourriture contenant des larves dans une boîte de Pétri. En utilisant des pinces, ramasser délicatement les larves et les transférer dans un plat en verre de l'embryon rempli de PBS.
2. Laver les larves avec du PBS until tous les aliments résiduel est éliminé. Inspecter les larves sous le stéréomicroscope fluorescent avec 8 à grossissement 16X pour éliminer tous les "larves de léopard" qui portent des taches de GFP-positives au hasard dans tout le corps larvaire (Figure 2A, 2B et voir Discussion Section).
   Remarque: Pour l'isolement de l'ARN comprennent une étape de lavage avant-dernier dans EtOH à 70% pendant 1 min.
3. Placer le plat contenant des larves sélectionnées dans du PBS sur la glace jusqu'à la dissection. Les larves de processus dans les 30 min pour éviter les effets néfastes du froid et de la famine.

3. Dissection de Larves

1. Pour disséquer l'EAD sous un stéréomicroscope, utilisez une paire de pinces pour appuyer légèrement sur la partie médiane de la larve contre le fond du plat en verre. Avec la deuxième pince, saisir les crochets buccaux larvaires et les tirer loin du corps (figure 2C).
   NOTE: La force de traction est souvent suffisante pour briser les tiges optiques reliant l'EAD pair aux lobes du cerveau. Si le cerveau ou ses parties restent attachées à l'EAD et leur présence ne sont pas souhaitables pour d'autres applications, couper les tiges optiques avec une aide des deux paires de pinces. Pour les tumeurs invasives (par exemple, ^V12 Scrib ras ¹⁾ la connexion entre EAD et les lobes du cerveau devient de plus en plus avec le temps obscurcies par mytiliculture et la migration des cellules clonales.
   1. Pour préparer le complexe EAD / cerveau avec un intact nerf ventral cordon (VNC) (figure 2D), utiliser une pince pour couper une larve dans le milieu du corps. Jeter la moitié postérieure.
   2. Maintenez la moitié antérieure du corps larvaire entre les pointes une pince, retournez la larve à l'intérieur-out en poussant dans la bouche des crochets avec la pointe de la deuxième pince et en roulant la cuticule dessus avec la première paire de pinces.
2. En utilisant des pinces enlever soigneusement tous les tissus étrangers (par exemple, les glandes salivaires, la graisse corporelle, et l' intestin) , tout en laissant la paire d'EAD oule complexe EAD / cerveau reliée à la bouche des crochets. Démêler la bouche des crochets de la cuticule sus-jacente. Libérer le VNC en sectionnant les projections axonales étendant aux muscles du corps et de l' épiderme (figures 1B, 2C, 2D).
   REMARQUE: Les crochets buccaux permettent une manipulation sûre des tissus avec une pince et faciliter naufrage plus efficace et faciliter la reconnaissance des tissus pendant le lavage. Dissected EAD changement morphologie relativement rapide, lorsqu'il est conservé dans du PBS non fixée. Limiter le temps de dissection à 20-30 min.
3. Pour transférer le tissu, manteau une pointe de micropipette P20 par pipetage le corps restant carcasses à plusieurs reprises de haut en bas. Pour transférer les grands complexes EAD / cerveau, couper la pointe de micropipette P20 avec des ciseaux.
   REMARQUE: La procédure de revêtement est essentiel pour empêcher le collage et la perte de tissu disséqué pendant le transfert. Utilisation d'un micropipette P20 minimise le transfert de PBS en solution fixateur, limitant la dilution indésirable.
   1. Pour immunocoloration, transférerla disséqué EAD dans un tube de 0,5 ml rempli avec 400 ul de paraformaldehyde à 4% (PFA) fixatif. Utiliser 1,5 ml tube avec 1 ml de PFA pour agrandir l'EAD / complexes du cerveau destinés à marquer d'invasivité.
      ATTENTION: PFA est très toxique. Porter des gants et des vêtements. Éviter tout contact avec la peau, les yeux ou les muqueuses.
   2. Pour l'isolement d'ARN transférer l'EAD disséquée dans un nouveau plat de verre rempli de PBS froid. Utilisez une pince pour nettoyer EAD de l'anneau et les ganglions lymphatiques, afin de minimiser les contaminations de l'échantillon.
   3. Détachez l'EAD à partir de la bouche des crochets en coupant la connexion entre les disques d'antenne et la bouche des crochets à l' aide de pinces (Figure 2E). Afin d'éviter la dégradation de l'ARN et des artefacts d'expression génique, limiter le temps de dissection à 30 min. Passez à l'étape 7.
      NOTE: Un chercheur expérimenté peut disséquer environ 60 larves en 30 minutes sans compter le temps nécessaire pour la collecte et le lavage des larves. Les rendements totaux d'ARN dépendent de la taille de l'EAD qui varient entre les génotypes et developmentÃl étage. Dissection de 80-100 contrôle EAD paires de la fin du troisième stade larvaire devrait donner 5-8 pg d'ARN total.

4. Fixation, immunocoloration et montage

1. Fixer des échantillons en PFA fixateur pendant 25 min tout en nutation à la température ambiante. Le temps de fixation peut être prolongée jusqu'à 60 min sans altérer la morphologie des tissus et l'antigénicité de protéines.
2. Enlever le fixateur et de lavage des échantillons avec du PBST (PBS avec 0,1% de Triton X-100) à trois reprises pendant 10 min à l'aide d'un nutator. En utilisant un volume suffisant de PBST pour chaque étape de lavage (400 ul / tube 0,5 ml).
   NOTE: fixe EAD complexes / cerveau destinés à marquer d'invasivité ne nécessitent pas immunocoloration. signal GFP reste bien visible après fixation. Passez à l'étape 4.4 pour la dissection finale.
   1. Pour une immunocoloration, des tissus de bloc dans 200 ul d'une solution de blocage (PBST avec 0,3% de SAB) pendant 20 minutes avec agitation douce à température ambiante.
      1. Incuber avec primary anticorps dilués dans 100 ul d'une solution de blocage pendant une nuit à 4 ° C tout en agitant doucement. Se reporter à la première fiche d'anticorps ou de la littérature publiée pour recommandé dilution d'anticorps.
         NOTE: La dilution d'anticorps primaire pourrait avoir besoin d'être optimisé.
      2. Après cinq lavages de 10 min dans PBST, tissu tache avec les anticorps secondaires fluorescents dilué dans une solution de blocage en agitant doucement pendant 2 heures à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C dans l'obscurité.
      3. échantillons Laver trois fois 10 min dans du PBST.
3. Remplacer PBST avec 500 pi de solution DAPI-coloration. Pour étiqueter F-actine, ajouter phalloïdine conjuguée à un colorant fluorescent à la solution DAPI-coloration. Après 15 min nutation dans l'obscurité, se laver les tissus une fois pendant 10 minutes avec du PBST.
   REMARQUE: l'étiquetage actine F peut être réalisée indépendamment de la coloration DAPI.
4. Pour l'étape de dissection finale, transférer le tissu de nouveau dans un plat en verre PBS rempli en utilisant un 1 ml pipette. En utilisant les deux paires de pinces clipser hors de la bouche des crochets.
   1. Séparer les cerveaux qui seront utilisés pour la quantification de l'invasivité de l'EAD en coupant la tige optique comme EAD envahi pourrait entraver l'analyse.
5. Placer une goutte de milieu de montage (15 ul d'une 22 mm x 22 mm lamelle couvre-objet) sur un coulisseau objectif. Avec l'aide de forceps conseils, distribuer le milieu dans une couche mince. Transfert EAD, le cerveau ou les complexes EAD / cerveau dans le milieu de montage avec une micropipette P20.
6. Utilisez les conseils de forceps ou d'une tige de tungstène pour distribuer des tissus et de redresser la VNC sur la diapositive.
7. Pour éviter la formation de bulles lors du montage, d'abord toucher un bord d'une lamelle au milieu de montage, puis abaissez lentement sur le support de montage à l'aide d'une pince. Utilisez de petits morceaux de papier ou de tissu filtrant essuyez pour absorber moyen de montage en excès sur les bords de lamelle.
   REMARQUE: DABCO / poly (alcool vinylique) de montage de 4-88 durcisse moyenneà 4 ° C en l'espace d'une heure. Les diapositives peuvent être stockées pendant des mois à 4 ° C.

5. imagerie confocale

1. Acquérir des sections et des piles confocales uniques à l'aide d'un microscope confocal équipé de 20X, 40X et 60X objectifs pétroliers.
2. Empêcher la saturation du pixel. Utiliser les mêmes paramètres d'acquisition d'image , y compris la résolution de l' image, la puissance d'entrée de laser, gain, offset, trame moyenne, une taille de pas dans un z-series et de maintenir ces paramètres pour tous les génotypes pour permettre des comparaisons d'intensités de pixels entre les différents génotypes ^21,22.
   NOTE: Pour la visualisation du complexe / du cerveau EAD, générer des projections maximales et coudre, des images voisines respectives. Pour la préparation de l'image finale, utiliser un logiciel de traitement d'image de poste pour l'assemblage du panneau et pour régler la luminosité et le contraste.

6. Quantification des tumeurs invasives

1. Définir un système de notation qui va caractériser les différents niveaux de invasivenes tumoraless compte tenu de la répartition spatiale de l'invasion et de la quantité de cellules GFP-positives d'étalement dans le cerveau et VNC. Préparer des fiches d'évaluation pour la documentation (figure 3A).
2. Mont au moins 80 fixe les cerveaux intacts pour chaque génotype sur une lame en utilisant 40 ul du milieu de montage par 24 mm x 50 mm lamelle.
   1. Pour permettre la notation impartiale, poser une partie neutre pour anonymiser les diapositives, de sorte que la procédure de notation est impartiale. Évaluer diapositives anonymisés par deux membres laboratoire indépendamment. Divulguer génotypes seulement après que le comptage est terminé.
3. Évaluer le degré de malignité par une notation aveugle des cerveaux montés sous un stéréomicroscope fluorescent équipé d'un jeu de filtres de GFP. Utilisez un marqueur pour marquer les cerveaux qui ont déjà été vus pour éviter le double comptage (figure 3B).
4. Calculer le pourcentage de cerveaux qui tombent dans chacune des catégories invasives définies par génotype. Déterminer les s statistiquesignificance en utilisant un test de chi-carré (figure 3C).

7. Isolement de l'ARN, traitement DNase et Contrôle de la qualité

REMARQUE: Tous les réactifs (solutions, plasticware) utilisé dans les étapes suivantes devraient être libres de l'activité RNase. Toujours porter des gants et utiliser une hotte chimique pour le travail avec des solvants organiques.

1. Transfert de l'EAD propre avec une pointe P20 micropipette revêtu dans 1,5 ml tube.
2. Laissez un évier de tissu au fond du tube, retirez soigneusement PBS et le remplacer par 100 ul de réactif ARN de lyse (suffisant pour un maximum de 140 EAD).
3. Lyse tissu par tourbillonnement. A ce stade, les échantillons peuvent être congelés dans de l'azote liquide et stockés à -80 ° C ou directement traitées par un protocole d'isolement d'ARN standard.
   NOTE: Des échantillons de génotypes similaires provenant de plusieurs tours de dissection peuvent être regroupés une fois dans l'ARN réactif de lyse.
4. Remplir le volume d'échantillon à 0,9 ml avec de l'ARN réactif de lyse. Ajouter 0,2 ml de chloroforme et mélanger des échantillons Vigoroisa nt pendant 15 à 20 secondes.
5. À la suite de 2 à 3 min d'incubation à température ambiante, centrifuger les échantillons à 10 000 g pendant 15 min à 4 ° C.
6. Transfert contenant de l'ARN supérieure incolore en phase aqueuse dans un nouveau tube sans déranger l'interphase. Restez à l'écart de l'interphase, car il contient des protéines et de l'ADN génomique.
   REMARQUE: Le volume récupéré doit être d'environ 60% du volume de réactif de lyse de l'ARN utilisé pour l'homogénéisation.
7. Précipiter l'ARN par addition de 0,5 ml d'alcool isopropylique. Vortexer et incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 min.
8. Centrifuger les échantillons à 10000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
9. Jeter le surnageant et laver le culot d'ARN une fois avec 600 ul d'éthanol à 75%. Après un court vortex et centrifugation (10 000 xg pendant 7 min à 4 ° C) jeter tout l'éthanol et laisser le culot d'ARN sécher à l'air pendant 5-10 min placer le tube ouvert sur un tissu propre essuyer.
   NOTE: Le culot d'ARN peut être visible comme un petit blanc opaque st /mûr au fond du tube ou invisible. Les gouttes d'éthanol restantes peuvent être soigneusement enlevés avec embout P10 micropipette.
10. Dissoudre l'ARN dans 50 pi d'eau traitée au DEPC par tourbillonnement ou d'une solution passant quelques fois à travers une pointe de pipette.
11. Pour réduire au minimum la contamination par l'ADN génomique, l'ARN total de traiter avec de la DNase en ajoutant 50 ul d'un mélange contenant 1 ul de désoxyribonucléase (2 U / ul) et 10 ul de 10 x tampon de DNase dans l'eau traitée au DEPC. Vortex et centrifuger.
12. Incuber les échantillons à 37 ° C dans un bain-marie ou un bloc chauffant pendant 30 à 40 min. Après incubation, on ajoute 100 ul d'eau traitée au DEPC dans chaque échantillon.
13. Pour inactiver l'activité enzymatique et de l'ARN propre à partir de la DNase, ajouter 200 pi de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (25: 24: 1) solution, vortex pendant 1 minute et centrifuger les échantillons à 10 000 x g pendant 7 minutes à 4 ° C.
14. transférer avec précaution la phase aqueuse supérieure contenant de l'ARN dans un nouveau tube. Ajouter un volume égal (200 pi)de chloroforme, mélanger et répéter l'étape de centrifugation d'en haut.
15. Recueillir soigneusement la phase supérieure et à précipiter l' ARN par addition de 1/10 de volume de 3 M d' acétate de sodium, pH 5,2 préparée dans DEPC H ₂ O et de 2,5 volumes d'éthanol à 100%. Mélanger soigneusement par tourbillonnement.
    REMARQUE: l'ajout de 0,5 ul de glycogène (20 ug / ul) à un mélange de précipitation permet de visualiser le culot d'ARN. Pour minimiser les pertes d'ARN, utiliser, tubes à faible liaison 1,5 ml microtubes siliconés.
16. Précipiter l'ARN à -20 ° C pendant au moins 1 h.
    NOTE: L'incubation peut être réalisée pendant une nuit. Les échantillons peuvent être placés à -80 ° C également.
17. Pellet ARN par centrifugation à 10.000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Laver et culot sec suivant la description 7.9.
18. Dissoudre l'ARN dans 10-15 pi d'eau traitée au DEPC. ARN de magasin à -80 ° C.
19. Déterminer la quantité et la pureté de l'ARN en mesurant la DO à 230 nm, 260 nm et 280 nm en utilisant un spectrophotomètre. Calculer ARN concentration en appliquant la convention que 1 DO à 260 nm est égale à 40 pg / ml d'ARN.
    NOTE: Le rapport A _260/280 de l' ARN «pur» est égal à 2,0 tandis qu'un rapport A _260/230 devrait être dans la gamme de 2,0-2,2. Des échantillons d'ARN avec un rapport A _260/280 compris entre 1,7 et 2,0 conviennent pour des applications en aval telles que la synthèse d'ADNc. Pour la préparation de bibliothèques d'ARNm-seq la qualité et la quantité d'ARN doivent être vérifiées en utilisant un système d'électrophorèse automatisé. Le rapport 28S / 18S doit être supérieure à 1,8.

Résultats

Pour démontrer le potentiel de la technique eyFLP-marcm pour générer des correctifs de GFP marquée de génotypes définis dans la drosophile EAD, trois types de clones ont été induits: (1) le contrôle GFP exprimant seulement, (2) les tumeurs malignes exprimant une forme oncogénique de la petite G-protéine Ras (Ras ^V12) dans un contexte de perte homozygote d'un gribouillis de gène suppresseur de tumeur (Scrib ^1), et (3) surcroissance mais non...

Discussion

Les techniques pour générer des mosaïques génétiques chez la drosophile sont parmi les outils les plus sophistiqués pour l' analyse et la manipulation de la fonction des gènes ^33. Le système eyFLP-marcm a prouvé puissant et robuste , car elle permet l'induction de marqués visuellement, clones génétiquement définis d'une manière spatialement restreinte, à savoir, dans les tissus où l'activateur eyeless est actif ^9,18. Ceci est particulièrement important lor...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agar	Gewü ; rzmü ; hle Brecht, Eggenstein, Allemagne	00262-0500 Recette de	nourriture pour mouches : Préparez 20 L de nourriture pour mouches avec 160 g d’agar, 360 g de levure, 200 g de farine de soja, 1,6 kg de semoule de maïs jaune, 1,2 L d’extrait de malt, 300 ml de sirop de maïs léger, 130 ml d’acide propionique et 200 ml de nipagin à 15 %. La nourriture pour mouches doit être cuite pendant 1 heure à 85  ; ° ;C.
Sirop de maïs	Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Allemagne	01939
Acide propionique	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Allemagne	6026.1
Semoule de maïs	ReformKontor GmbH, Zarrentin, Allemagne	4010155063948
Extrait de malt	CSM Deutschland GmbH, Brême, Allemagne	728985
Farine de soja	Stockmeier Food GmbH, Herford, Allemagne	1000246441010
Levure	Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Allemagne	210099K
Methyl-4-benzoate/ Nipagin	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Allemagne	H5501	Préparer une solution mère à 15 % avec 70 %
d’EtOH Flacons de nourriture pour mouches de drosophile	Kisker Biotech, Steinfurt, Allemagne	789008
Bouchons de flacons	K-TK e.K., Retzstadt, Allemagne	1002
Bouteilles alimentaires pour mouches drosophiles	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Allemagne	960177
Bouchons de bouteilles	K-TK e.K., Retzstadt, Allemagne	1002 S
Poly(alcool vinylique) 4-88/[-CH2CHOH-]n	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Allemagne	81381	Recette du support de montage : Dissoudre 6 g de poly(alcool vinylique) 4-88 dans 39  ; ml de Millipore H2O, 6 ml de 1 M Tris (pH 8,5) et 12,5 ml de glycérol. Remuer toute la nuit à 50  ; ° ; C et centrifugeuse 20  ; min à 5 000 tr/min. Ajouter DABCO au surnageant pour obtenir une concentration finale de 2,5 %. Stocker les aliquotes à -20  ; ° ;C.
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]indice d’octane/ DABCO  ;	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Allemagne	D2522
Triton X-100	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Allemagne	9002-93-1
Saline tamponnée au phosphate/ PBS			137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 et 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 dans Millipore H2O
PBST			0,1 % Triton X-100 dans PBS
Paraformaldéhyde/PFA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Allemagne	158127	4 % PFA Recette fixatrice : Dissoudre 4 g de PFA dans 80 ml de Millipore H2O sur une plaque d’agitation magnétique chauffée à 55 °C ° ;C. Ajouter 1 M de NaOH goutte à goutte jusqu’à ce que toutes les particules de PFA soient dissoutes. Ajouter 10 ml de PBS 10x et ajuster le pH à 7,4 avec 1 M HCl. Mélanger en 100 & micro ; l Triton X-100 et remplir de Millipore H2O à 100 ml. Stocker les aliquotes à -20 °C. Évitez les décongélations répétées. (ATTENTION : Le PFA est très toxique. Préparez le fixateur PFA dans une hotte. Portez un appareil respiratoire autonome, des gants et des vêtements. Évitez tout contact avec la peau, les yeux ou les muqueuses.)
Albumine sérique bovine/ BSA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Allemagne	A3059	Recette de solution bloquante : Dissoudre 0,3 % BSA dans PBST
Phalloïdine invitrogen marquée par fluorescence	, Karlsruhe, Allemagne, Sondes moléculaires	A12379, A22283, A22284	Solution mère de phalloïdine : Dissoudre la poudre (300 U) dans 1,5 ml de méthanol. Conserver à -20 ° ;C. Pour la coloration, utiliser en dilution 1:250 (A12379, A22283) et 1:100 (A22284) dans PBST.
4',6-Diamidino-2-phénylindol Dihydrochlorid/ DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Allemagne	6335	Solution de coloration DAPI : Préparer une solution mère de 5 mg/ml dans Millipore H2O et stocker les aliquotes à 4 ° ;C. Utilisé en dilution 1:1 000 dans PBST.
Anticorps anti-H2 de souris	Kurucz et al., 2003		Utilisé en dilution 1:500 dans la solution bloquante
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK	715-175-151	Utilisé en dilution 1:500 dans la solution bloquante
Pince Dumont #5 Fine	Science Tools, Heidelberg, Allemagne	11295-10
Boîte d’embryon en verre (30  ; mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Allemagne	E90
Aiguilles en tungstène	Fine Science Tools, Heidelberg, Allemagne	10130-20
Porte-goupille nickelée	Fine Science Tools, Heidelberg, Allemagne	26018-17
Lames de microscope	VWR, Darmstadt, Allemagne	631-1553
Lamelles 22 x 22 mm (#1 Menzel-Glä ; ser)	VWR, Darmstadt, Allemagne	631-1336
Lamelles 24 x 50 mm (0.13-0.16  ; mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Allemagne	1076371
Kimtech Science Precision Wipes	Thermo Scientific, Schwerte, Allemagne	06-677-70
Stéréomicroscope de dissection	Olympus, Hambourg, Allemagne	SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japon)
Stéréomicroscope fluorescent	Olympus, Hambourg, Allemagne	SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japon) avec caméra	CCD DP72Équipé du jeu de filtres passe-bande bleue étroit pour l’excitation de GFP d’autres fluorochromes excitables bleus (filtre d’excitation BP460-480 nm, filtre barrière BA495-540 nm) et d’un filtre d’excitation vert étroit et d’un filtre barrière passe-long pour RFP et d’autres fluorochromes excitables verts (filtre d’excitation BP530-550, filtre barrière BA575IF). Logiciel : Olympus cellSens Standard 1.11.
Microscope confocal	Olympus, Hambourg, Allemagne	FV1000	Équipé d’un microscope IX81 inversé. Objectifs : 20&fois ; UPlan S-Apo (NA 0,85), 40& fois ; UPlanFL (NA 1.30) et 60× ; UPlanApo (NA 1,35). Lasers : Diode laser UV LD405 (50  ; mW), laser à argon, multiligne 457/(476)/ 488/515 (40  ; mW), diode laser jaune/verte LD560 (15  ; mW) et la diode laser rouge 635 (20  ; mW). Logiciel : Logiciel Fluoview 2.1c Incubateur
réfrigéré par la drosophile	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Allemagne	. Sanyo MIR553
Bouteille à jet d’eau	VWR, Darmstadt, Allemagne	215-8105
BD Clay Adams Nutator Mixer	VWR, Darmstadt, Allemagne	15172-203
ELMI Digital Rocking Shaker	VWR, Darmstadt, Allemagne	DRS-12
5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent	VWR, Darmstadt, Allemagne	2302700	Le protocole est compatible avec d’autres réactifs à base de TRIzol, par exemple , TRIréactif de Sigma (Cat. Nr.T9424), réactif TRIzol de Thermofisher (N° de catalogue 15596).
Pyrocarbonate de diéthyle/ DEPC	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Allemagne	D5758	Diluer DEPC 1:1 000 dans Millipore H2O, agiter toute la nuit et autoclave.
Phénol ultrapur :Chloroforme :Alcool isoamylique (25:24:1)	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Allemagne	15593-031
Chloroforme	Merck, Darmstadt, Allemagne	102445
TURBO DNase (2 U/µ ; l)	Thermo Scientific, Schwerte, Allemagne	AM2238
Invitrogen UltraPure Glycogen	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Allemagne	10-814-010
Acétate de sodium trihydraté	VWR, Darmstadt, Allemagne	27652.232	Préparez une solution d’acétate de sodium 3 M avec DEPC-H2O et ajustez le pH à 5,2
2-Propanol	Merck, Darmstadt, Allemagne
Ethanol	Merck, Darmstadt, Allemagne	100983	Préparer une dilution à 75 % d’EtOH avec du DEPC-H2O.
Spectrophotomètre UV/Vis NanoDrop ND-8000	Thermo Scientific, Schwerte, Allemagne	ND-8000
Microcentrifugeuse Eppendorf (réfrigérée)	Thermo Scientific, Schwerte, Allemagne	5417R
Experion RNA StdSens Analysis Kit	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü ; nchen, Allemagne	7007103
Experion Automated Electrophoresis	Station Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü ; nchen, Allemagne	7007010
SuperScript III Reverse Transcriptase	Thermo Scientific, Schwerte, Allemagne	18080044
Oligo d(T) Primer	Integrated DNA Technologies, Louvain, Belgique		Prepare 100 µ ; M solutions mères dans DEPC-H2O et stocker à -20 ° ; C
dNTP Mixture	Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France	4030	Aliquotes du magasin de 25 µ ; l à -20° ; C
CFX96 Touch Système de détection PCR en temps réel	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü ; nchen, Allemagne	1855195
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü ; nchen, Allemagne	170-8882
Plaques PCR à coque dure 96 puits, paroi mince	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü ; nchen, Allemagne	HSP9601
Microseal 'B' Film	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü ; nchen, Allemagne	MSB1001
rp49 Amorce avant	Integrated DNA Technologies, Louvain, Belgique		5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'
rp49 Amorce inverse	Integrated DNA Technologies, Louvain, Belgique		5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'
mmp1 Amorce directe	Integrated DNA Technologies, Louvain, Belgique		5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'
mmp1 Amorce inverse	Integrated DNA Technologies, Louvain, Belgique		5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3'