Article de méthode

Applications de pHluorin pour Quantitative, Kinetic et à haut débit Analyse des endocytose dans la levure bourgeonnante

DOI :

10.3791/54587

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23 octobre 2016

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1Department of Biology, The Johns Hopkins University, 2Department of Biological Sciences, Duquesne University

Dans cet article

Résumé

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La quantification précise des événements de trafic vésiculaire fournit souvent des informations clés sur les rôles de protéines spécifiques et les effets des mutations. Cet article présente des méthodes d’utilisation de la supécliptique pHluorin, une variante de la GFP sensible au pH, comme outil de quantification des événements endocytaires dans les cellules vivantes à l’aide de la microscopie à fluorescence quantitative et de la cytométrie en flux.

Résumé

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protéine fluorescente verte (GFP) et ses variantes sont des outils largement utilisés pour étudier la localisation des protéines et la dynamique des événements tels que le remodelage du cytosquelette et le trafic vésiculaire dans les cellules vivantes. méthodologies quantitatives utilisant des fusions de GFP chimériques ont été développés pour de nombreuses applications; Cependant, la GFP est quelque peu résistant à la protéolyse, donc sa fluorescence persiste dans le lysosome / vacuole, ce qui peut nuire à la quantification du trafic de fret dans la voie endocytique. Une méthode alternative pour la quantification endocytose et post-endocytose événements de trafic utilise superecliptic pHluorin, une variante sensible au pH de la GFP qui est trempé dans des environnements acides. fusion chimériques de pHluorin à la queue cytoplasmique de fret transmembranaire des protéines entraîne un amortissement de la fluorescence lors de la constitution de la cargaison dans des corps multivésiculaires (de MVBS) et la livraison à la lumière lysosome / vacuole. Ainsi, extinction de la fluorescence vacuolaire facilite quantification de l'endocytose et les événements précoces de la voie d'endocytose. Cet article décrit les méthodes utilisant des cargaisons pHluorin-marqués pour la quantification de l'endocytose par microscopie de fluorescence, ainsi que des analyses basées sur la population à l'aide de cytométrie en flux.

Introduction

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le trafic vésiculaire joue un rôle important dans le maintien de l'identité et de la fonction des organites dans les cellules eucaryotes et est un mécanisme clé pour la régulation de la composition des protéines et de la membrane des compartiments cellulaires particuliers. À la membrane plasmique, la fusion des vésicules d'exocytose fournit de nouvelles protéines et les membranes à la surface de la cellule, tandis que les vésicules produites par endocytose retirer la membrane et des protéines de la surface pour un recyclage ultérieur ou le ciblage vers le lysosome. Ainsi, l'endocytose est importante pour l'absorption des nutriments et des réponses à l'environnement extracellulaire. Exocytose et endocytose sont équilibrés pour réguler la membrane plasmique de surface, et pour permettre le chiffre d'affaires des protéines endommagées.

Des études chez la levure et les cellules de mammifères ont identifié un grand nombre de protéines impliquées dans l'endocytose, ainsi que de multiples voies d'endocytose qui favorisent l'intériorisation de cargaisons spécifiques ou qui agissent en réponse à une variété de frconditions environnemen-. La voie la plus étudiée est la clathrine endocytose (CME), dans laquelle les protéines de clathrine et accessoires cytosolique assemblent en une structure de revêtement pour stabiliser la vésicule endocytaire naissante. Les expériences de la levure Saccharomyces cerevisiae ont donné des renseignements clés sur la dynamique et l' ordre de recrutement pour de nombreuses protéines d' endocytose 1-3. En particulier, le mécanisme de FMC est hautement conservée par l'évolution de telle sorte que la majorité des protéines liées à la FMC dans la levure ont orthologues humains; ainsi, la levure bourgeonnante a été un outil important pour les mécanismes d'endocytose qui sont conservés chez les eucaryotes supérieurs comprendre. Par exemple, des études utilisant des levures en herbe ont déterminé que la formation et la maturation des structures de FMC (appelée patches d'actine comme corticales dans la levure) implique le recrutement séquentiel de nombreuses protéines, en commençant par la clathrine et des protéines adaptatrices cargaison de liaison, suivi par le recrutement d'accessoire endocytose supplémentaire les protéines,activation de la polymérisation de l' actine Arp2 / 3 médiation et le recrutement de protéines impliquées dans des vésicules de scission 1,2. Le recrutement de protéines de machines de FMC à corticale patches d'actine est un processus très ordonné et stéréotypée, et l'ordre précis de recrutement pour de nombreuses protéines a été mis en place par rapport aux autres composants de la machinerie CME. Fait important, les études récentes ont confirmé un ordre similaire de recrutement pour les protéines de FMC à puits recouverts de clathrine dans les cellules de mammifères 4.

En plus de la FMC, de nombreux types de cellules possèdent un ou plusieurs endocytique (CIE) , les voies de clathrine indépendantes qui reposent sur des mécanismes alternatifs pour favoriser la formation de vésicules et l' intériorisation de la membrane plasmique 5-7. Chez la levure, nous avons récemment identifié une voie de CIE qui utilise la petite GTPase Rho1 et son guanine facteur d' activation d'échange nucléotidique (FEM), Rom1 8,9. Rho1 active le Formin Bni1 pour favoriser la polymérisation de l' actine 10,11, qui est requis pour cette forme de clathrine endocytose indépendante dans la levure 12. En outre, la famille des protéines α-arrestine recruter l'ubiquitine ligase Rsp5 pour promouvoir l' ubiquitination de la cargaison et intériorisation ultérieure par CME 13-17, ainsi que la promotion du fret intériorisation par la voie de la CIE, éventuellement par interaction directe avec les protéines impliquées dans la CIE 18. Une variété de voies CIE existent également dans les cellules de mammifères, y compris les voies de clathrine indépendant et phagocytaires qui comptent sur l'orthologue Rho1, RhoA 9,19. Le rôle de RhoA chez les mammifères CIE est mal comprise; ainsi, les études dans la levure en herbe peuvent fournir des indications mécanistes supplémentaires qui sont applicables à la CIE de mammifères.

Une quantification exacte des événements endocytose peut fournir des informations importantes sur les rôles des protéines spécifiques dans la régulation de l'endocytose, et peut révéler les effets des mutations sur l'intériorisation de la cargaison ou progression par la voie endocytique. A cet effet, les méthodes biochimiques peuvent être utilisées pour contrôler l'absorption du ligand ou de mesurer le taux de dégradation des protéines cargo endocytose. Dans les cellules vivantes, la fusion de la protéine fluorescente verte (GFP) et ses variantes à cargaisons d'intérêt permet la visualisation directe de transport de fret. Toutefois, les cargaisons de GFP-tagged sont d'une utilité limitée pour la quantification de l'endocytose parce GFP est résistant à la dégradation dans le lysosome (ou vacuole dans la levure). Par ailleurs, la fluorescence de la GFP est seulement partiellement sensible aux variations du pH, et reste détectable au sein de la vacuole lumière 20,21. Par conséquent, la fluorescence de la balise GFP persiste dans la vacuole longtemps après le reste de la cargaison a été dégradée, et la quantification à base de cellules entières de l'intensité de la cargaison peuvent être inexacts en raison de long terme GFP fluorescence dans la vacuole.

Afin de pallier les inconvénients de la fluorescence vacuolaire de la GFP, nous avons précédemment fait usage de pH supereclipticluorin, une variante sensible au pH de la GFP qui émet une fluorescence vive à pH neutre, mais il perd la fluorescence dans des environnements acides tels que la lumière de la vacuole / lysosome 20,22,23. Placer une balise pHluorin sur la queue cytoplasmique de cargaisons endocytose permet la visualisation des cargaisons à la membrane plasmique et sur endosomes précoces, où l'étiquette pHluorin reste exposée au cytoplasme (figure 1A). Comme endosomes précoces arrivent à maturité, le complexe de tri endosomal requis pour les paquets de transport (ESCRT) de machines cargos de surface localisée dans des vésicules qui bourgeonnent dans la lumière de l'endosome, générant corps multivésiculaires (MVBS) 24. Pour les cargaisons qui ont été incorporés dans les vésicules MVB internes, la balise pHluorin tournée vers la lumière de la vésicule. vésicules MVB internes sont acidifiés; ainsi, cargos pHluorin-taggés perdent la fluorescence sur endosomes précoces comme ils mûrissent dans MVBS 20. fusion subséquente du MVB avec la vacuole fournit le contenu MVB luminalpour la dégradation, les étiquettes et pHluorin restent éteintes dans l'environnement acide de la lumière de vacuoles.

Ce document fournit des descriptions détaillées des analyses quantitatives en utilisant endocytose des cargaisons avec des étiquettes de pHluorin cytoplasmiques dans la levure. Souches exprimant pHluorin-cargos marqués peuvent être utilisés dans des essais cinétiques et / ou finaux, selon les propriétés et le trafic comportement de la cargaison spécifique. En outre, certains cargos pHluorin-marqués se prêtent à des méthodes d'analyse à haut débit, y compris de cytométrie de flux. Fait important, la balise pHluorin est un outil polyvalent pour l'étude des événements endocytose dans les cellules vivantes, permettant la quantification de l'endocytose et la comparaison de la fonction d'endocytose dans de type sauvage et des souches mutantes.

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Protocole

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1. Solutions et médias

  1. Préparer les stocks suivants, des médias et des plaques:
    1. Pour préparer 10x YNB, dissoudre 67 g de base azotée de levure dont les acides aminés dans 1 litre d'eau. Stériliser par filtration à travers un filtre de 0,22 um de nitrocellulose.
    2. Préparer le milieu YNB utilisant 1x YNB (de 10x stock) avec 2% de dextrose (à partir d'un stérile à 50% p / v stock) et le mélange 1x acide aminé / nutritif (de 100x actions, voir étape 1.1.4). Pour la sélection de plasmide, omettre des acides aminés ou des nutriments individuels selon les besoins. Pour l'induction de l'expression Mup1, omettre en outre la méthionine à partir du mélange d'acide aminé / des éléments nutritifs.
    3. Préparer des plaques YNB utilisant 1x YNB (de 10x stock), 2% de dextrose (à partir d'un stérile à 50% p / v stock), mélange acide / nutriment 0,7 g / L aminé (voir étape 1.1.5) et 2,5% d'agar. Préparer le milieu de la plaque à l'autoclave 25 g d'agar-agar et de 0,7 g d'amino mélange acide / nutritif par 860 ml d'eau. Laisser refroidir le mélange à 55 ° C, puis ajouter 100 ml de 10x YNB et 40 ml of 50% de glucose. Verser plaques (environ 30 ml de milieu par boîte de 10 cm), laissez le moyen de se solidifier à la température ambiante, et des plaques de magasin à 4 ° C.
    4. Préparer la solution 100x acide aminé / nutriment stock (pour un milieu liquide) en dissolvant le suivant dans 100 ml d'eau déminéralisée: 0,1 g L-Méthionine, 0,3 g chacun de L-leucine et la L-lysine, et 0,2 g chacun de L-histidine L-tryptophane, d'adénine et d'uracile (d'autres acides aminés et des substances nutritives peuvent être inclus selon les besoins spécifiques pour les souches). Utiliser la chaleur douce si nécessaire pour dissoudre, et stériliser à travers un filtre de 0,45 um de nitrocellulose. Stocker à température ambiante à l'abri de la lumière. Pour la sélection de plasmide, de préparer des solutions mères dépourvues de composants spécifiques selon les besoins.
    5. Préparer l'acide aminé / mélange nutritif (pour les tôles) en combinant ce qui suit: 0,5 g d'adénine, 4 g de L-leucine et 2 g chacun de L-histidine, la L-lysine, la L-méthionine, L-tryptophane, la L- la tyrosine et l'uracile. Broyer avec un mortier et un pilon, et stocker avec proprotection de la lumière. Pour la sélection de plasmide, préparer des mélanges dépourvus de composants spécifiques, selon les besoins, et d'utiliser 0,7 g d'un mélange d'acide aminé par litre de milieu de la plaque (voir étape 1.1.3).
  2. Préparer huit puits des lames à chambres pour la microscopie en revêtant la surface de la lame avec de la concanavaline A (ConA). A chaque puits de la glissière de chambre, ajouter 25 ul de 2 mg / ml de ConA dissous dans l'eau. En utilisant une pointe de pipette, répartir la ConA à travers la surface inférieure du puits, puis laisser la lame sécher à l'air à la température ambiante pendant au moins 4-8 heures. Idéalement, utilisez les diapositives de chambre dans les 24 heures de revêtement ConA.
  3. Générer des souches de levure avec des fusions en cadre de la GFP ou de la cargaison pHluorin endocytique d'intérêt en utilisant la réaction en chaîne par polymérase (PCR) , la méthode d'intégration à base décrite dans Longtine et al. et Goldstein et McCusker 25,26.
    NOTE: Les plasmides contenant pHluorin marquage des cassettes avec des gènes de résistance pour la kanamycine (KANMX6) et nourseothricine ( NATMX4) ont été 20 précédemment décrit.
    1. Amplifier cassettes GFP ou pHluorin contenant des marqueurs sélectionnables avec des amorces contenant des séquences supplémentaires spécifiques au site d'intégration génomique 20,25.
    2. Transformer le produit de PCR résultant dans la souche de levure désirée en utilisant la méthode à l'acétate de lithium 27.
    3. Sélectionnez pour l'intégration de la cassette par des cellules de plus en plus sur des plaques YPD contenant le médicament approprié. Pour préparer des plaques, l'autoclave 10 g d'extrait de levure, 20 g de peptone, 0,1 g de tryptophane et 25 g d'agar-agar dans 960 ml d'eau. Avant de couler des plaques, laisser le mélange refroidir à 55 ° C, puis on ajoute 40 ml de glucose à 50% et soit G418 à une concentration finale de 200 ug / ml pour la sélection KANMX6 ou nourseothricine à une concentration finale de 100 ug / ml sélection NATMX4.
    4. Confirmer l'intégration de la GFP ou pHluorin balise dans des colonies individuelles par PCR et / ou transfert de Western en utilisant des anticorps anti-GFP,ainsi que par la détection de la protéine marquée par microscopie à fluorescence 20.
      REMARQUE: Les souches et plasmides utilisés dans cette étude levures spécifiques sont indiquées dans les tableaux 1 et 2, respectivement.

2. Endpoint Essai pour l'état d'équilibre Fluorescence de constitutivement internalisés endocytique Cargo

  1. Inoculer des cellules (~ 3 petites colonies) dans 5 ml de milieu YNB manquant des acides aminés ou des éléments nutritifs nécessaires à la maintenance du plasmide (le cas échéant). Cultiver les cellules pour 16-24 h dans un incubateur à agitation orbitale à 30 ° C, avec 250 rpm agitation. Alternativement, une série ~ 1-2 mm colonie de cellules sur une plaque YNB dont les acides aminés ou de nutriments pour la sélection plasmidique, et cultiver des cellules pendant la nuit à 30 ° C.
  2. Mesurer la densité (DO 600) de chaque culture d'une nuit en utilisant un spectrophotomètre. Préparer une dilution de 5 ml à 0.35-0.4 OD 600 / ml dans un milieu YNB dont les acides aminés ou d' éléments nutritifs pour les plaentretien smid et croître pendant environ 3 heures à 30 ° C avec agitation. Si en utilisant des cellules striées sur une plaque, ignorez cette étape et passez à l'étape 2.4 (voir ci-dessous).
  3. Mesurer la densité (OD 600) de cellules, qui doit maintenant être comprise entre 0,6-1,0 DO 600 / ml. Transférer 1,5 ml de la culture à un tube de micro, et un culot de cellules à 8000 rpm (6800 xg) pendant 2 min. Retirer 1.475 pi de surnageant.
  4. Amener les cellules à un microscope à fluorescence. Avant imagerie chaque échantillon, préparer une lame en remettant en suspension les cellules dans le milieu restant, et monter 3 pl de suspension cellulaire sous une lamelle. Vous pouvez également préparer des lames de chambre 8 ainsi que décrit ci-dessous dans le protocole 3, en utilisant un milieu YNB comme approprié pour la sélection de plasmide. Idéalement, les cellules d'image avec un 100X, 1,4 ou supérieur ouverture numérique (NA) immersion dans l'huile lentille d'objectif, une caméra 12 ou 16 bits, et des filtres d'excitation / d'émission optimisés pour la fluorescence de GFP.
    NOTE: Si en utilisant des cellules cultivées en striant oplaque na, préparer la diapositive en plaçant 3 pi de milieu YNB frais sur une lamelle. En utilisant une pointe de pipette, recueillir une petite colonie de cellules de la plaque, disperser les cellules dans le milieu YNB, et monter immédiatement la suspension résultante sur une lame de verre avant l'imagerie.
  5. Image 4-6 champs aléatoires de cellules pour chaque condition, en utilisant les mêmes paramètres d'acquisition (c. -à- ensembles de filtres et temps d'exposition) pour toutes les images dans une expérience.
    NOTE: La collecte d'une image DIC ou fond clair pour chaque champ peut être utile pour les cellules où le signal pHluorin est trempé dans MVB et compartiments vacuolaires.
  6. Quantifier l'intensité de fluorescence d'au moins 30-50 cellules pour chaque condition (voir le protocole 5).

3. Kinetic Assay pour la quantification de l'endocytose de Cargos que Subir endocytose Réglementé

  1. Inoculer 2-3 colonies de cellules de levure (environ 2 mm de diamètre) par colonie dans 5 ml de milieu YNB sans methionine et ajoutezdes acides aminés ou des nutriments itional pour maintenir la sélection du plasmide. Cultivez cultures pour 16-24 heures à 30 ° C avec agitation.
    NOTE: Dans cet article, les protocoles pour l'étude des protéines cargo endocytose réglementés feront usage de la perméase méthionine, Mup1. D'autres cargaisons qui subissent une endocytose régulée sont également adaptés pour le marquage avec pHluorin (par exemple, l'uracile perméase FUR4, qui accumule à la membrane du plasma en l'absence d'uracile et uracile internalise en réponse à appliqué depuis l'extérieur); pour ces cargaisons, les conditions des médias doivent être modifiés pour refléter l'expression, l'induction et l'internalisation des conditions spécifiques pour que la cargaison.
  2. Mesurer la densité (OD 600) de chaque culture d'une nuit à environ 3 heures avant l' imagerie. Préparer une dilution de 5 ml à DO 600 0.35-0.4 / ml dans du milieu YNB sans methionine et des acides aminés supplémentaires ou des nutriments pour le maintien du plasmide et de croître à 30 ° C sous agitation.
  3. Pré-équilibrer les microsface de la chambre de l'environnement ou le stade chauffé (si disponible) à 30 ° C pendant l'incubation de 3 heures de l'étape 3.2.
  4. Transférer 1 ml de culture cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse, et un culot de cellules à 8000 tours par minute (6800 x g) pendant 2 min. Retirer 975 ul de surnageant.
  5. Préparer, une lame de chambre 8 puits à fond de verre ConA traité pour l'imagerie (protocole 1.2).
  6. Ajouter 200 ul de milieu YNB sans methionine et des acides aminés supplémentaires ou des nutriments pour la sélection du plasmide pour chaque puits. Reprendre le culot cellulaire de l'étape 3.4 dans le surnageant restant, et déposer 2,5 pi de suspension cellulaire dans le centre de chaque puits. Disperser les cellules à travers la surface du puits par pipetage de haut en bas, et permettent aux cellules de se déposer pendant 5-10 min.
  7. Placer la lame de la chambre sur un microscope à fluorescence inversé équilibré à 30 ° C (voir étape 3.3). Repérez un champ de cellules en utilisant un éclairage en fond clair.
  8. Ajouter 50 ul de milieu YNB contenant 100 pg / ml de methionine(Préchauffée à 30 ° C) à 200 ul de milieu dans le puits pour obtenir une concentration finale de methionine de 20 pg / ml. Éviter de perturber le milieu dans le puits afin d'empêcher les cellules de flotter à partir du bas.
  9. Laisser les cellules se stabiliser pendant 2 minutes avant de commencer l'imagerie. Immédiatement avant de capturer la première image, réglez le microscope au plan focal désiré (typiquement, un plan focal équatorial fonctionne le mieux).
  10. Acquérir GFP et fond clair (ou DIC) des images à intervalles de 5 min pendant 45-60 min, en utilisant des paramètres d'acquisition identiques pour toutes les images dans une série chronologique (par exemple, 100X 1.4 NA objectif à immersion d'huile et 500 msec temps d'acquisition en utilisant un filtre de GFP, 100 temps d'acquisition msec en utilisant un filtre DIC).
    NOTE: Si la scène du microscope et un logiciel d'imagerie ne permettent pas de correction automatique de la dérive du plan focal, il peut être nécessaire de réajuster manuellement la mise au point avant chaque point de temps d'imagerie. De plus, les temps d'acquisitionvarient entre les microscopes en raison des différences d'illumination et les filtres et les conditions optimales doivent être déterminées manuellement avant de commencer l'expérience. Si une cargaison endocytose autre que Mup1 est utilisé, il peut être nécessaire de modifier les intervalles de temps d'acquisition et d'imagerie, ainsi que la durée de l'expérience, pour tenir compte de la cinétique de l'intériorisation de cette cargaison.
  11. Quantifier intensité de fluorescence des cellules individuelles à chaque point de temps (voir le protocole 5), et exprimer des valeurs en pourcentage de l'intensité initiale de la première image.

4. Endpoint Assay pour Quantification de endocytique Cargos que Subir endocytose Réglementé

  1. Préparer les cellules pour l'imagerie comme décrit dans le protocole 3 (étapes 3.1 à 3.6).
  2. Image 4-5 champs aléatoires de cellules pour chaque condition immédiatement avant d'ajouter la méthionine, en utilisant clair et filtres de GFP ensembles.
  3. Ajouter 50 ul de milieu YNB contenant 100 ug / ml de méthionine (avant-guerreMed à 30 ° C) à 200 ul de milieu dans le puits pour obtenir une concentration finale de methionine de 20 pg / ml. Éviter de perturber le milieu dans le puits afin d'empêcher les cellules de flotter à partir du bas.
  4. 4-5 images des champs aléatoires de cellules 30 minutes après l'addition de la methionine, en utilisant les mêmes paramètres d'acquisition que pour le point temporel 0 min (étape 4.2).
  5. Quantifier l'intensité de fluorescence d'au moins 30-50 cellules pour chaque point de temps (voir le protocole 5). valeurs express que le pourcentage de Mup1-pHluorin intériorisé après 30 minutes en utilisant la formule: [intensité moyenne à 0 min - intensité moyenne à 30 min] / [intensité moyenne à 0 min] x 100%.
    NOTE:. Il est possible d'effectuer simultanément jusqu'à huit points d' extrémité des essais en décalant l'heure de début de chaque essai Le tableau 3 donne un exemple de flux pour huit essais simultanés.

5. Postes acquisition Analyse

  1. Exporter des images à partir du logiciel d'acquisition en tant que 16-bit format de fichier-image étiqueté (.tif ou .tiff).
    NOTE: D'autres formats de fichiers peuvent également convenir, et devrait idéalement utiliser des algorithmes de compression sans perte. images 8 bits ne conviennent généralement pas à des fins de quantification.
  2. Ouvrir les fichiers en utilisant le logiciel ImageJ (disponible gratuitement option 'Ouvrir' à dans le menu "Fichier". Utilisez l'image de fluorescence pour la quantification, et l'image de fond clair / DIC comme référence pour identifier l'emplacement des cellules et à exclure les cellules mortes (si présent ), qui apparaissent plus sombres que les cellules vivantes quand vu par les DIC et sont autofluorescents vus avec des filtres GFP excitation / émission.
  3. Effectuer une soustraction d'arrière-plan sur l'image de fluorescence. Pour les images avec un signal de fond inégal, utiliser l'algorithme «Contexte Soustraction 'trouvé dans le menu' Process '. Utilisez le réglage par défaut (rayon de roulement de boule de 50 pixels), ce qui est généralement suffisant à des fins de quantification.
    NOTE: Une solution de rechange backgroprocédé de soustraction und pour les images avec un fond uniforme est décrit à l'étape 5.3.1.-5.3.2; Cependant, le procédé ci-dessus fonctionne également pour le fond uniforme.
    1. Pour les images avec uniforme de fond (c. -à- intensité de fond est à peu près constante à tous les bords et dans le centre de l'image), effectuer un fond manuel soustraction. Cliquez sur le bouton «sélections» freehand trouvé dans la fenêtre de ImageJ principale, et sélectionnez 3-5 régions aléatoires dans l'image qui ne contiennent pas de cellules.
    2. Ouvrez la fonction «Set mesures» situé dans le menu "Analyse", sélectionnez le paramètre 'Mean Gris Value', et de mesurer des valeurs d'intensité en utilisant la fonction "Mesure" (également trouvé dans le menu «Analyser»). Calculer la valeur moyenne des régions mesurées 3-5, et soustraire de toutes les mesures ultérieures dans cette image.
  4. Pour la quantification des essais cinétiques (protocole 3), générer une image unique, empilés pour le timsérie e. Ouvrez les images de fluorescence de chaque point de temps dans l'ordre chronologique, et de générer une pile en utilisant les «Images à Stack 'fonction (qui se trouve dans le menu' Image ', dans le cadre du sous-menu Stacks).
  5. Décrire une cellule en utilisant l'outil de sélection à main levée, en veillant à inclure la cellule entière, mais aussi peu zone à l'extérieur de la cellule que possible.
  6. Mesurer les paramètres suivants: ', densité intégrée »et« Mean Gris Value'. Sélectionnez les paramètres à l'aide de la fonction «Set mesures», situé dans le menu 'Analyse'.
    REMARQUE: La densité intégrée correspond à la somme des intensités de pixels dans la région sélectionnée, et la valeur moyenne gris correspond à [Densité intégrée / Zone], qui corrige des valeurs d'intensité pour la taille des cellules.
  7. Ouvrez le "Gestionnaire de retour sur investissement» situé dans le menu "Analyse", dans le sous-menu 'Outils. Dans la fenêtre du gestionnaire de ROI, cliquez sur le bouton "Ajouter" pour entrer dans la regio soulignén comme une nouvelle région d'intérêt (ROI).
  8. Répéter les étapes 5.4 à 5.6 pour les cellules restantes de l'image. Exclure les cellules mortes tel qu'évalué par fond clair / DIC et fluorescence (cellules mortes apparaissent plus sombres dans les images DIC, et ont le signal cytoplasmique autofluorescents lorsqu'ils sont considérés avec GFP excitation / émission; voir la figure 2F), et toutes les cellules qui touchent le bord de l'image. Enregistrer les ROIs sélectionnés dans un fichier .zip en cliquant sur le bouton «Plus» dans la fenêtre «Gestionnaire de retour sur investissement», et d'exporter toutes les mesures vers un tableur ou d'un logiciel d'analyse statistique.
  9. Pour la quantification des essais cinétiques (protocole 3), définir et mesurer une cellule à partir du point de temps initial comme décrit dans les étapes 5.4 et 5.5. Utilisez le même retour sur investissement pour la mesure de tous les points de temps ultérieurs dans l'expérience.
  10. Pour les tests finaux (protocoles 2 et 4), mesurer un minimum de 30-50 cellules pour chaque condition. Effectuer la quantification pendant au moins 2-3 images, et comprennent toutes les cellules dans chaqueimage qui répondent aux critères énoncés à l'étape 5.8 dans l'analyse.
  11. Évaluer la signification statistique entre les échantillons à l' aide d' une ANOVA, suivie par un test de comparaison multiple de Tukey pour une analyse post hoc.

6. Analyse de la population de Mup1-pHluorin endocytose par cytométrie de flux

  1. Inoculer 2-3 colonies de cellules de levure (environ 2 mm de diamètre par colonie) dans 0,5 ml de milieu YNB sans methionine et des acides aminés ou des nutriments supplémentaires pour maintenir la sélection du plasmide. Cultiver les cellules dans 5 ml tubes à fond rond pour 16-24 heures à 30 ° C sur un rouleau tambour.
  2. Ajouter 1,5 ml de milieu YNB sans methionine et des acides aminés supplémentaires ou des nutriments pour le maintien du plasmide et de croître à 30 ° C pendant 3 heures supplémentaires sur un rouleau tambour.
  3. Transfert 1 ml de cellules dans chacune des deux 5 ml tubes à fond rond. Ajouter 0,25 ml de milieu YNB -Met au premier tube (condition -Met) et 0,25 ml de milieu YNB contenant 100 pg/ Ml de methionine au second tube pour obtenir une concentration en methionine finale de 20 pg / ml (état + Met). Incuber les cellules à 30 ° C pendant 45 min sur un rouleau tambour.
  4. Analyser les cellules par cytométrie en flux, avec diffusion vers l'avant (FS) en tant que mesure de la taille des cellules et Mup1-pHluorin intensité de fluorescence à partir d'un isothiocyanate de fluorescéine (FITC), le filtre en tant que mesure de la cargaison intériorisation.
  5. Utilisez les touches de curseur pour régler la tension des FS et des canaux FITC pour optimiser la détection de la gamme de taille et l'intensité de fluorescence des cellules de levure utilisée (pour ces expériences, les paramètres utilisés étaient 50 V pour FS et 400 V pour FITC).
    NB: La tension des deux canaux varie en fonction du cytomètre de flux utilisé. Cette étape doit être effectuée avant ou pendant le traitement de 45 minutes avec de la methionine (étape 6.3).
  6. Mesure FS et de l'intensité de fluorescence pour 10.000 cellules de chaque état, en utilisant le réglage de débit élevé. Générer un diagramme de dispersion des FS contre Fluorescence intensité: cliquez sur 'ajouter graphique', sélectionnez FITC (axe-x) et FS (axe y), et le graphique 1.000 points (le logiciel affichera des valeurs pour 1000 cellules, même si 10.000 cellules ont été mesurés).
    NOTE: Pour la cohérence maximale, analyser des cellules 45-50 minutes après l'addition de méthionine; pour des expériences impliquant un grand nombre d'échantillons, échelonner addition de méthionine pour recevoir le temps nécessaire à l'analyse de cytométrie en flux.
  7. Inclure -MET et + Met conditions de type sauvage (WT) cellules en tant que témoin. Utilisation de la fonction de porte, attribuer une porte verticale en utilisant la condition WT + Met, de telle sorte que 5% environ des cellules brillantes tombent à droite de la porte. Utilisez cette gating pour toutes les autres conditions de l'expérience.

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Résultats

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Localisation état d' équilibre et la quantification de la protéine cargo endocytose constitutivement intériorisé Ste3

Afin de démontrer que les cargaisons pHluorin étiquetées peuvent être utilisées pour la quantification de l'endocytose dans des cellules vivantes, la localisation de la GFP chimère et des fusions pHluorin avec la queue cytoplasmique C-terminale de Ste3, le réce...

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Discussion

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Des applications de pHluorin pour la quantification des événements endocytose dans des cellules de levure fait usage de cargaisons transmembranaires , dans lequel le marqueur fluorescent est fusionnée à la queue cytoplasmique de la protéine (figure 1A). Pour les essais décrits ici, sont fluorescentes vives cargaisons lorsque la balise pHluorin est exposé à des environnements neutres, mais devenir éteint lorsque la balise pHluorin rencontre des conditions acides. Ainsi, une cargaison d'endocytose pHl...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

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Nous tenons à remercier Gero Miesenböck et Tim Ryan pour le partage de l’ADNc pHluorin utilisé pour générer des réactifs dans cette étude, Nathan Wright, Joanna Poprawski et Lydia Nyasae pour leur excellente assistance technique, les membres du laboratoire Wendland pour leurs discussions utiles, et Michael McCaffery et Erin Pryce du Centre d’imagerie intégrée (Johns Hopkins) pour leurs conseils et leur aide en matière de microscopie et de cytométrie en flux. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (à B.W., GM60979) et de la National Science Foundation (à B.W., MCB 1024818). K.W. a été soutenu en partie par une bourse de formation des National Institutes of Health (T32-GM007231). A.F.O. a été soutenu par des fonds de développement du Département des sciences biologiques de l’Université Duquesne et une subvention CAREER de la National Science Foundation 553143.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AdénineSigmaA8626-25GUtilisation pour la préparation d’un mélange d’acides aminés et d’une solution mère
Bacto-agarFisherBP1423-2Utilisation pour la préparation de milieux sur plaque
BD Difco Yeast Nitrogen Base (sans acides aminés)BD291920Utilisation pour la préparation de milieux liquides et sur plaques
Concanavalin ASigmaC5275-5MGUtilisation pour l’enrobage d’une chambre
DextroseFisherBP350-1Utilisation pour la préparation de milieux liquides et sur plaques
L-HistidineFisherBP382-100Utilisation pour la préparation d’un mélange d’acides aminés et d’une solution mère
L-LeucineAcros125121000Utilisation pour la préparation d’un mélange d’acides aminés et d’une solution mère
L-LysineFisherBP386-100Utilisation pour la préparation d’un mélange d’acides aminés et d’une solution mère
L-MéthionineFisherBP388-100Utilisation pour la préparation d’un mélange d’acides aminés et d’une solution mère
L-TryptophaneFisher BP395-100Utilisation pour la préparation d’un mélange d’acides aminés et d’une solution mère
L-TyrosineAcros140641000Utilisation pour la préparation d’un mélange d’acides aminés
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass ( 8 puits)Thermo Scientific155411Utilisation pour les dosages cinétiques et finaux de l’internalisation de Mup1-pHluorin
UracilSigmaU0750-100GUtilisation pour la préparation d’un mélange d’acides aminés et d’une solution mère
Microscope inversé Axiovert 200 ObjectifCarl ZeissCustom Build
100X/1.4 Plan-Apochromat ObjectifZeissDoit être de 100X, 1,4 NA ou supérieur
La caméra SensicamCooke Corporationdoit avoir une plage dynamique de 12 bits ou plus
X-Cite 120PC Q Source d’éclairageExcelitas Technologies
Slidebook 5logiciel Intelligent Imaging Innovations
Logiciel ImageJInstitutes of Healthhttp://imagej.nih.gov/ij/
à immersion dans l’huile Carl National

Références

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