Applications de pHluorin pour Quantitative, Kinetic et à haut débit Analyse des endocytose dans la levure bourgeonnante

Résumé

La quantification précise des événements de trafic vésiculaire fournit souvent des informations clés sur les rôles de protéines spécifiques et les effets des mutations. Cet article présente des méthodes d’utilisation de la supécliptique pHluorin, une variante de la GFP sensible au pH, comme outil de quantification des événements endocytaires dans les cellules vivantes à l’aide de la microscopie à fluorescence quantitative et de la cytométrie en flux.

Résumé

protéine fluorescente verte (GFP) et ses variantes sont des outils largement utilisés pour étudier la localisation des protéines et la dynamique des événements tels que le remodelage du cytosquelette et le trafic vésiculaire dans les cellules vivantes. méthodologies quantitatives utilisant des fusions de GFP chimériques ont été développés pour de nombreuses applications; Cependant, la GFP est quelque peu résistant à la protéolyse, donc sa fluorescence persiste dans le lysosome / vacuole, ce qui peut nuire à la quantification du trafic de fret dans la voie endocytique. Une méthode alternative pour la quantification endocytose et post-endocytose événements de trafic utilise superecliptic pHluorin, une variante sensible au pH de la GFP qui est trempé dans des environnements acides. fusion chimériques de pHluorin à la queue cytoplasmique de fret transmembranaire des protéines entraîne un amortissement de la fluorescence lors de la constitution de la cargaison dans des corps multivésiculaires (de MVBS) et la livraison à la lumière lysosome / vacuole. Ainsi, extinction de la fluorescence vacuolaire facilite quantification de l'endocytose et les événements précoces de la voie d'endocytose. Cet article décrit les méthodes utilisant des cargaisons pHluorin-marqués pour la quantification de l'endocytose par microscopie de fluorescence, ainsi que des analyses basées sur la population à l'aide de cytométrie en flux.

Introduction

le trafic vésiculaire joue un rôle important dans le maintien de l'identité et de la fonction des organites dans les cellules eucaryotes et est un mécanisme clé pour la régulation de la composition des protéines et de la membrane des compartiments cellulaires particuliers. À la membrane plasmique, la fusion des vésicules d'exocytose fournit de nouvelles protéines et les membranes à la surface de la cellule, tandis que les vésicules produites par endocytose retirer la membrane et des protéines de la surface pour un recyclage ultérieur ou le ciblage vers le lysosome. Ainsi, l'endocytose est importante pour l'absorption des nutriments et des réponses à l....

Protocole

1. Solutions et médias

1. Préparer les stocks suivants, des médias et des plaques:
   1. Pour préparer 10x YNB, dissoudre 67 g de base azotée de levure dont les acides aminés dans 1 litre d'eau. Stériliser par filtration à travers un filtre de 0,22 um de nitrocellulose.
   2. Préparer le milieu YNB utilisant 1x YNB (de 10x stock) avec 2% de dextrose (à partir d'un stérile à 50% p / v stock) et le mélange 1x acide aminé / nutritif (de 100x actions, voir étape 1.1.4). Pour la sélection de plasmide, omettre des acides aminés ou des nutriments individuels selon les besoins. Pour l'induction de l'expression Mup1, omettre en outre la méthioni....

Résultats

Localisation état d' équilibre et la quantification de la protéine cargo endocytose constitutivement intériorisé Ste3

Afin de démontrer que les cargaisons pHluorin étiquetées peuvent être utilisées pour la quantification de l'endocytose dans des cellules vivantes, la localisation de la GFP chimère et des fusions pHluorin avec la queue cytoplasmique C-terminale de Ste3,.......

Discussion

Des applications de pHluorin pour la quantification des événements endocytose dans des cellules de levure fait usage de cargaisons transmembranaires , dans lequel le marqueur fluorescent est fusionnée à la queue cytoplasmique de la protéine (figure 1A). Pour les essais décrits ici, sont fluorescentes vives cargaisons lorsque la balise pHluorin est exposé à des environnements neutres, mais devenir éteint lorsque la balise pHluorin rencontre des conditions acides. Ainsi, une cargaison d'endocytose pHl.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Adénine	Sigma	A8626-25G	Utilisation pour la préparation d’un mélange d’acides aminés et d’une solution mère
Bacto-agar	Fisher	BP1423-2	Utilisation pour la préparation de milieux sur plaque
BD Difco Yeast Nitrogen Base (sans acides aminés)	BD	291920	Utilisation pour la préparation de milieux liquides et sur plaques
Concanavalin A	Sigma	C5275-5MG	Utilisation pour l’enrobage d’une chambre
Dextrose	Fisher	BP350-1	Utilisation pour la préparation de milieux liquides et sur plaques
L-Histidine	Fisher	BP382-100	Utilisation pour la préparation d’un mélange d’acides aminés et d’une solution mère
L-Leucine	Acros	125121000	Utilisation pour la préparation d’un mélange d’acides aminés et d’une solution mère
L-Lysine	Fisher	BP386-100	Utilisation pour la préparation d’un mélange d’acides aminés et d’une solution mère
L-Méthionine	Fisher	BP388-100	Utilisation pour la préparation d’un mélange d’acides aminés et d’une solution mère
L-Tryptophane		Fisher BP395-100	Utilisation pour la préparation d’un mélange d’acides aminés et d’une solution mère
L-Tyrosine	Acros	140641000	Utilisation pour la préparation d’un mélange d’acides aminés
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass ( 8 puits)	Thermo Scientific	155411	Utilisation pour les dosages cinétiques et finaux de l’internalisation de Mup1-pHluorin
Uracil	Sigma	U0750-100G	Utilisation pour la préparation d’un mélange d’acides aminés et d’une solution mère
Microscope inversé Axiovert 200 Objectif	Carl Zeiss	Custom Build
100X/1.4 Plan-Apochromat Objectif	Zeiss		Doit être de 100X, 1,4 NA ou supérieur
La caméra Sensicam	Cooke Corporation		doit avoir une plage dynamique de 12 bits ou plus
X-Cite 120PC Q Source d’éclairage	Excelitas Technologies
Slidebook 5	logiciel Intelligent Imaging Innovations
Logiciel ImageJ	Institutes of Health		http://imagej.nih.gov/ij/

à immersion dans l’huile Carl National