Article de méthode

Un capteur à base de polyaniline d'acides nucléiques

DOI :

10.3791/54590

⸱

1 novembre 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern Mississippi

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les acides nucléiques sont des analytes courants pour l’évaluation des systèmes biologiques ; cependant, le biais de manipulation enzymatique peut être préoccupant. Ici, une méthode est décrite pour la détection sans marquage des acides nucléiques à l’aide de la polyaniline. Cette technologie de capteur sensible et rentable permet de distinguer les différences de nucléotides entre les molécules.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La détection des acides nucléiques est au centre des technologies de diagnostic utilisées en recherche et en clinique. Les approches standard utilisées dans ces technologies reposent sur la modification enzymatique qui peut introduire des biais et des artefacts. Un élément essentiel des plates-formes de détection de prochaine génération sera la détection moléculaire directe, évitant ainsi le besoin d’amplification ou de marquages. Les nanomatériaux avancés peuvent fournir les modalités chimiques appropriées pour réaliser des capteurs sans marquage. Les polymères conjugués sont idéaux pour la détection biologique, possédant des propriétés compatibles avec les biomolécules et présentant une grande sensibilité aux changements environnementaux localisés. Dans cet article, une méthode de détection des acides nucléiques est présentée à l’aide du polymère électroconducteur polyaniline. De simples oligonucléotides « sondes » d’ADN complémentaires aux acides nucléiques cibles sont fixés électrostatiquement au polymère, créant ainsi un système de capteurs capable de différencier les différences de nucléotides uniques dans les molécules cibles. En dehors de la nature spécifique et impartiale de cette technologie, elle est très rentable.

Introduction

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Les polymères conjugués offrent de nombreuses options pour les capteurs moléculaires. Cela inclut les réponses de fluorescence, électroniques et colorimétriques1. De nombreux efforts ont été déployés pour incorporer des polymères conjugués dans les capteurs d’acide nucléique. Cependant, la plupart des systèmes nécessitent une détection secondaire, ce qui limite les options de détection2. Récemment, nous avons signalé une plate-forme de capteurs à base de polymère conjugué construite sur de la polyaniline (PANI) qui exploite les propriétés de ce polymère, créant ainsi un système sans marquage3. Le PANI est un polymère électro-actif largement conjugué avec des propriétés telles que la fluorescence et la résistance qui conviennent à la mesure des systèmes biologiques4. Les excitons à l’intérieur de la structure ne sont pas localisés, ce qui entraîne la mobilité de la charge positive entre les sous-unités monomères. Cela fournit un échafaudage flexible de charges positives qui peuvent interagir avec le squelette chargé négativement de l’ADN5,6. Il est important de noter que l’ADN attaché électrostatiquement est orienté de telle sorte que les bases azotées peuvent participer à l’appariement des bases. L’association avec l’ADN modifie les propriétés électroniques du PANI, un effet qui peut être renforcé par l’irradiation UV (Figure 1)3. Grâce à ce système, des oligonucléotides complémentaires aux acides nucléiques cibles peuvent être immobilisés sur les PANI. De nombreuses études ont démontré qu’à l’hybridation, les oligonucléotides adsorbés électrostatiquement se dissocient des PANI ou d’autres matrices cationiques en raison des changements de conformation causés par le passage à une structure d’ADN double brin3,5,7.

Dans un système de capteurs où la fixation de la sonde module les propriétés des polymères conjugués, les événements d’hybridation peuvent être transduits sans marquage ni modification enzymatique des sondes ou des acides nucléiques cibles. Les polymères conjugués offrent une grande flexibilité dans les méthodes de détection, dont la fluorescence. Grâce à la surveillance de la fluorescence PANI, des concentrations d’acides nucléiques cibles aussi faibles que 10-11 M (10 pM) peuvent être détectées3. La détection est rapide, se produisant dans les 15 minutes suivant l’hybridation, et spécifique lorsqu’un seul décalage dans une molécule cible peut être différencié3.

La fabrication des capteurs PANI est simple. Il est possible de générer des PANI de haut poids moléculaire qui sont bien dispersés dans l’eau à l’aide de procédures de synthèse standard impliquant un monomère d’aniline, un tensioactif et l’ajout contrôlé d’un oxydant. Le rendement peut être très élevé et l’oxydant n’ayant pas réagi éliminé par lavage à l’eau, ce qui garantit l’absence de croissance supplémentaire de PANI. L’association PANI-sonde se produit spontanément lors du mélange, et la formation complexe est renforcée par une légère exposition aux UV. L’hybridation peut être effectuée immédiatement, et les changements de fluorescence PANI peuvent être analysés après une courte incubation. La simplicité de cette technologie la rend très accessible à de nombreux laboratoires.

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Protocole

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1. traitables PANI Synthèse

  1. Dissoudre l'aniline (1 ml, 11 mmol) complètement dans 60 ml de chloroforme dans 250 ml de ballon à fond rond. Agiter à 600 rpm pendant 5 min et laisser refroidir à 0-5 ° C avec de la glace. Cela prend habituellement 15 à 20 minutes (figure 2A).
  2. Ajouter dodécylbenzène sulfonate de sodium (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) à la solution d'aniline dans un ballon à fond rond, sous agitation à 600 tours par minute.
  3. Dissoudre le persulfate d'ammonium (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) dans 20 ml d'eau et ajouter tout cela goutte à goutte sur 30 min pour éviter la surchauffe de la réaction.
  4. Effectuer la réaction à 0-5 ° C pendant 24 heures, et lui permettre d'atteindre la température ambiante pendant 24 h.
  5. Observer le mélange réactionnel d' abord tourner blanc laiteux après 15 min, puis brun foncé au bout de 2 h, et enfin au vert foncé après 24 h (figure 2B-F).
  6. Filtrer la solution PANI-NaDBS avec un entonnoir de Büchner. Mélanger avec 80 ml de chloroforme et 120 ml d'eau en tanta séparation entonnoir (figure 2G).
  7. Incuber la solution pendant 24 heures à la température ambiante et recueillir le PANI vert foncé de l'entonnoir de séparation, ne laissant pas réagi NaDBS et APS dans le surnageant aqueux.

2. PANI-sonde de mélange et Irradiation UV

  1. Diluer solution PANI 10x avec du chloroforme-eau (1: 3 v / v) et mélanger 200 pi de PANI dilué avec 6,4 pmol d'oligonucléotides d'ADN de la sonde par doux balancement pendant 15 min dans un tube de microcentrifugation.
  2. Irradier la solution de PANI-ADN avec 1 200 pJ / cm 2 d'un agent de réticulation UV pendant 2 min. Il est essentiel que l'exposition aux UV est limitée au montant indiqué. Une exposition prolongée aux UV compromet le changement de fluorescence dans PANI, probablement due à une reticulation covalente de PANI et l'ADN.
  3. complexes à pellets par centrifugation à 17.000 xg pendant 6 minutes et laver avec du tampon phosphate salin (PBS). Pellet à nouveau, et remettre en suspension dans du PBS.

3. Hybridization de PANI-sonde

  1. Ajouter 8 ul de 100 uM d'oligonucléotides d'ADN complémentaire ou cibler des acides nucléiques à 200 ul de complexes PANI-sonde.
  2. Effectuer l'hybridation en basculant mélange de solution pendant 15 min à 40 ° C.
  3. Pellet les complexes de PANI par centrifugation à 17.000 xg pendant 6 min. Laver avec du PBS et re-suspension dans l'eau.

4. Emission Steady Mesure État Fluorescence

  1. Ajouter PANI de différents traitements dans une microplaque à 96 puits et mesurer la fluorescence d'émission dans la gamme 270-850 nm par excitation à 250 nm. Un pic d'émission pour PANI devrait être observée autour de 500 nm.

5. Fluorescence Microscopy Mesure de hybridée Duplex

  1. Baisse manteau PANI sur une lamelle de verre borosilicate et sec à 40 ° C pendant 48 heures.
  2. Ajouter la sonde (8 pi de 100 uM) sur un film PANI séché et irradier avec une lumière UV (1200 pJ / cm 2 ) pendant 2 min.
  3. Lavez le film PANI-sonde avec du PBS et sèche à 40 ° C pendant 48 heures.
  4. Effectuer l'hybridation pour 15 minutes en ajoutant des acides nucléiques cibles. Cela pourrait être un échantillon biologique ou d'un oligonucléotide cible de commande (8 ul de 100 uM). Suivi avec un lavage PBS.
  5. Obtenir les images fluorescentes à 40X, avec un filtre à long passe de 500 nm.

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Résultats

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Figure 2A capture la configuration de réaction au début du processus de polymérisation, à savoir, avant l' addition APS. La formation de micelles est l'étape initiale dans la réaction de synthèse processus PANI se produit à l'interface micellaire. La figure 2B montre une solution laiteuse après 5 min. 30 minutes après l' APS est ajouté la réaction se transforme en une couleur légèrement brune. Figure 2C représente le changement ...

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Discussion

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Un capteur à base PANI-des acides nucléiques nécessite la solubilisation du polymère dans l'eau afin d'interagir avec l'ADN et l'ARN. La dispersion de PANI dans l' eau est effectuée en utilisant des agents tensioactifs, formant des micelles comme indiqué précédemment 8. Outre les NaDBS utilisées ici d' autres tensio - actifs anioniques tels que l' ester dodécylique d'acide 4-sulfophtalique, les tensioactifs non ioniques tels que l' éthoxylate de nonylphénol, ou des agents t...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les travaux ont été soutenus par le Collège des sciences et de la technologie de l’Université du Mississippi du Sud, le Collège des sciences et de la technologie du Mississippi et le programme INBRE du Mississippi (numéro de prix P204M103476 de l’Institut national des sciences médicales générales).

Remerciements

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Aniline  ;Fisher Scientific  ;A7401-500°ACS, liquide, réfrigéré
Peroxydisulfate d’ammoniumFisher Scientific  ;A682-500° A682-500 ;ACS, cristallin
Dodécylbenzène sulfonate de sodiumPfaltz & Bauer  ;D56340  ;95 % solide
ChloroformeFisher Scientific  ;MCX 10601  ;liquide
amorces d’ADNopéron MWGn/aséquence d’ADN personnalisée ~20  ;
microplaque bps  ;USA Scientific  ;1402-9800  ;96 pu, le polypropylène car il ne réagit pas au chloroforme
Film adhésif pour microplaquesUSA Scientific  ;2920-0000  ;Réduit la contamination de puits à puits, le déversement d’échantillons et l’évaporation
Verre de protection de microscopeFisher Scientific  ;12-544-D  ;Revêtement PANI sur verre de protection irradié aux UV
réticulant UV  ;UVP  ;HL-2000°Énergie : X100 &mu ; J/cm2 ; Temps : 2 min
Four d’hybridation VWR01014705 TTempérature : 400  ; ° ; C; avec balancement pendant 15 min
Appareil en verre  ;Fisher ScientificFiole à trois cols à fond rond pour la réaction ; entonnoir de goutte, bouchons, condenseur, entonnoir de séparation
MicroscopeLeica Microsystems  ;Leica IMC S80Grossissement 20X ; Pseudo couleur 536 nm ; Exposition 86 ms ; Gain 1,0x ; Lecteurs de microplaques Gamma 1.6
Dispositifs moléculaires  ;Référence 89429-536

Références

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  1. Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
  2. Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers. Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).
  3. Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
  4. Song, E., Choi, J. -W. Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing. Nanomaterials. 3 (3), 498(2013).
  5. Liu, S., et al. Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection. Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).
  6. Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface. Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).
  7. Zhang, Y., et al. Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection. PLoS ONE. 6 (6), e20569(2011).
  8. Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization. Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).
  9. John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant. J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).
  10. El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions. J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).
  11. Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid. J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).
  12. Jia, W., et al. Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization. Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).
  13. Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium. Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).
  14. Scales, C. W., et al. Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†. Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).
  15. Kadashchuk, A., et al. Localized trions in conjugated polymers. Phys Rev B. 76 (23), 235205(2007).
  16. Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array. Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).
  17. Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization. Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).

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Mots-clés

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