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Article de méthode

A Facile et écologique Route pour fabriquer poly (acide lactique) Échafaudages avec Graded Pore Taille

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DOI :

10.3791/54595

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17 octobre 2016

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1Department of civil, environmental, aerospace, and materials engineering (DICAM), RU INSTM, University of Palermo

Dans cet article

Résumé

Dans ce travail, des échafaudages en poly(acide lactique)/polyéthylène glycol (PLA/PEG) ont été préparés en utilisant une combinaison de mélange à l’état fondu et de lixiviation sélective. La méthode décrite ici a permis de développer des échafaudages à trois couches en contrôlant fortement à la fois la porosité et la taille des pores. Les propriétés mécaniques ont également été évaluées dans un environnement physiologique.

Résumé

Au cours des dernières années, les échafaudages à gradation fonctionnelle (FGS) ont acquis un rôle crucial dans la fabrication de dispositifs pour l’ingénierie tissulaire. L’importance de ce nouveau domaine de recherche sur les biomatériaux est due à la nécessité de développer des implants capables d’imiter la fonctionnalité complexe des différents tissus, y compris un changement continu d’une structure ou d’une composition à une autre. Dans ce dernier contexte, un sujet d’intérêt majeur concerne la conception d’échafaudages appropriés pour les tissus d’interface os-cartilage. Dans cette étude, des échafaudages à trois couches avec une taille de pores graduée ont été obtenus en mélangeant à l’état fondu du poly(acide lactique) (PLA), du chlorure de sodium (NaCl) et du polyéthylène glycol (PEG). Les distributions de la taille des pores ont été contrôlées par granulométrie NaCl et solvatation PEG. Les échafaudages ont été caractérisés d’un point de vue morphologique et mécanique. Une corrélation entre la méthode de préparation, l’architecture des pores et le comportement mécanique de compression a été trouvée. La force d’adhérence de l’interface a été évaluée quantitativement à l’aide d’un test de résistance interfaciale conçu sur mesure. De plus, afin d’imiter la physiologie humaine, des tests mécaniques ont également été effectués dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 37 °C. La méthode présentée ici offre un contrôle élevé de la porosité, de la distribution de la taille des pores et des performances mécaniques, offrant ainsi la possibilité de fabriquer des échafaudages à trois couches avec des propriétés sur mesure en suivant un itinéraire simple et écologique.

Introduction

L’intérêt pour les polymères biodégradables a pris de l’importance au cours des dernières années, tant dans le milieu universitaire que dans l’industrie, en raison des préoccupations croissantes concernant les déchets plastiques et la réduction de l’utilisation de sources non renouvelables1-7. En particulier, les polymères synthétiques biocompatibles et biodégradables sont répandus dans plusieurs domaines d’application biomédicale, tels que les médicaments à libération contrôlée8,9, les fils de suture résorbables8,10, l’intensification des bioprocédés11 et l’ingénierie tissulaire12.

L’ingénierie tissulaire se concentre sur le développement de dispositifs capables de restaurer et de maintenir une fonction normale dans les tissus malades ou blessés. La plupart des tissus natifs sont composés de différents types de cellules et de matrices extracellulaires (MEC) dans des hiérarchies spatiales spécifiques. Par exemple, le cartilage articulaire (CA) se compose de différentes zones avec différents types et orientations de fibres de collagène et de protéines de liaison au collagène. De plus, le cartilage et l’os présentent des structures hiérarchiques significativement différentes. Dans ce contexte, la préparation d’échafaudages multicouches avec des propriétés modifiées dans chaque couche pourrait permettre de remplacer des tissus hétérogènes en prenant en compte tous les microenvironnements locaux de ces systèmes complexes13,14.

Sur la base des caractéristiques cellulaires/biologiques et/ou physico-chimiques des échafaudages, les principales stratégies adoptées par l’ingénierie tissulaire peuvent être divisées en monophasique, biphasique et triphasique. Les approches biphasiques et triphasiques (BTA) utilisent deux ou trois architectures de pores, matériaux ou charges différents pour préparer des dispositifs fonctionnels multicouches. De plus, un seul matériau peut être utilisé pour réaliser des dispositifs biphasiques ou triphasiques, à condition qu’il soit possible de créer un gradient dans ses propriétés physiques12.

La migration cellulaire joue un rôle clé dans la morphogenèse, l’inflammation, la cicatrisation des plaies et les métastases tumorales. Le mouvement cellulaire est encouragé par la présence d’un gradient de propriétés physico-chimiques de la surface au cœur du dispositif. Par conséquent, les biomatériaux répondant aux exigences discutées ci-dessus peuvent être utiles dans l’étude de la migration cellulaire. En plus des gradients chimiques qui déclenchent la migration cellulaire (chimiotaxie), les propriétés mécaniques du substrat de culture cellulaire peuvent également conduire au mouvement cellulaire (mécanotaxie)15.

La structure multicouche peut également fournir la libération accordable de médicaments spécifiques incorporés dans la matrice polymère, en modifiant la surface spécifique de la couche ou la quantité de médicaments chargés.

Au cours de la dernière décennie, afin de développer des échafaudages possédant un gradient discret ou continu de propriétés morphologiques, telles que la porosité ou la taille des pores, plusieurs approches ont été présentées16-31. Les articles les plus récents se sont concentrés sur la préparation du BTA en adoptant : la lixiviation des particules 12,28,32, la technique de moussage au gaz16, l’électrofilage17-19, la technique de coulée couche par couche20, le prototypage rapide21,22, la séparation de phase induite thermiquement (TIPS)22, la lyophilisation par centrifugation24,25, les surfaces minimales triplement périodiques (TPMS)26, la coulée par congélation27-30.

Dans le cadre de ce travail, nous présentons un itinéraire simple et rapide pour réaliser des échafaudages poreux à trois couches (TLS) à base de PLA, en combinant le mélange à l’état fondu, le moulage par compression et la lixiviation au sel. Contrairement à la plupart des technologies couramment utilisées pour la production d’échafaudages, la stratégie adoptée ici peut être considérée comme entièrement respectueuse de l’environnement, car elle ne nécessite aucun solvant toxique potentiellement dangereux pour l’environnement et pour les cellules et tissus vivants32. Les relations de base entre le traitement, la structure et les propriétés établies dans cette étude en analysant à la fois les caractéristiques morphologiques et le comportement mécanique des dispositifs fabriqués fournissent des indications pour les progrès futurs dans la conception d’échafaudages multifonctionnels gradués avec des propriétés cibles spécifiques.

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Protocole

1. Échafaudages Fabrication

  1. Broyer NaCl dans un mélangeur de laboratoire pendant 20 min et le sécher sur un radiateur à 100 ° C.
  2. Mettre le NaCl a séché (45 g au moment) dans une machine à tamiser pendant 30 minutes à la fréquence la plus élevée disponible sans se produisant dans la résonance. Collecter des six fractions de sel allant de 500 um à 1000 pm (M 500); de 300 pm à 500 pm (M 300); de 100 pm à 200 pm (M 100); de 90 à 100 um (M 90); de 45 um à 65 um (M 45) et enfin M 10 avec des particules de sel de taille inférieure à 45 um comme schématisé sur la figure 1.
  3. Vacuum sécher pendant la nuit tous les matériaux afin d'éviter la scission hydrolytique au cours du traitement. Pour chaque matériau, sélectionner la température afin de maximiser le degré de séchage sans surmonter - dans le cas des polymères - la transition vitreuse. Par conséquent, pour choisir T = 90 ° C pour le PLA et T = 25 ° C pour le PEG, T = 105 ° C pendant NaCl.
  4. nourrirPLA, le PEG et du NaCl, avec une composition en pourcentage en poids 20/5/75 respectivement à une commande de mélangeur discontinu à T = 190 ° C et n = 60 tours par minute, puis les traiter jusqu'à obtenir une valeur constante du couple, habituellement au bout d'environ 10 minutes. Par la suite, la collecte rapide de la matière résultante.
  5. Préparer les mono-couches en utilisant une presse de laboratoire fonctionnant à 210 ° C, mettre les mélanges dans des moules cylindriques appropriés avec un diamètre de 10 mm et une hauteur de 3 mm et de les conserver pendant 60 secondes à la pression ambiante et 3 minutes à 180 bar . Par la suite, refroidir les mélanges à la température ambiante, en maintenant la pression de 180 bars.
  6. Assemblée des Trois-couches par moulage par compression
    1. Préparer chaque couche unique de la même manière que celle décrite dans (1.5), mais en utilisant des moules différents, à savoir ayant un diamètre de 10 mm et une hauteur de 1 mm. Enfin, obtenir 6 disques ayant un diamètre de 10 mm et une hauteur de 1 mm, contenant six différentes tailles de particules: M 500, M 300, M 100,
    2. for assembler trois couches échafaudage A (TLS A), empiler M 500, M 300 et M 100 à l'intérieur du moule cylindrique et compression mouler les dans une presse de laboratoire fonctionnant à 210 ° C pendant 60 secondes à la pression ambiante et 3 minutes à 180 bar et ensuite refroidi à température ambiante, en maintenant la pression de 180 bar.
      REMARQUE: Préparer le TSL B en empilant les uns des autres M 90, M 45 et M 10 dans les mêmes moules et d'effectuer l'opération de moulage par compression en suivant la même procédure que celle utilisée pour TLS A.
  7. Retirez les disques des moules cylindriques et les mettre dans un bain d'eau bouillante déminéralisée, sans agitation. 3 heures après, retirer les structures poreuses résultant du bain et laissez-les sécher pendant 12 heures à la température ambiante dans une hotte chimique.

2. Analyse morphologique

  1. Évaluer les morphologies des échafauds par microscopie électronique à balayage.
    1. Décomposer les échantillons sous azote liquide, puis fixer leéchantillons sur un talon d'aluminium à l'aide d'un ruban adhésif de carbone. Enfin, par pulvérisation cathodique coate d'or pendant 90 s sous atmosphère d'argon avant l'imagerie afin d'éviter une décharge électrostatique pendant le test.

3. Échafaudages Pore Taille

  1. Élaborer les images obtenues par analyse par MEB avec un logiciel de traitement d'image capable de reconnaître la distribution de la taille des pores de l'échafaudage.
    NOTE: Dans ce travail , l'analyse de la distribution de la taille des pores a été réalisée à l' aide d' un logiciel basé sur MATLAB décrit précédemment 33

4. porosité

  1. Pondérer les échantillons avant la lixiviation et à évaluer la porosité théorique selon l'expression suivante:
    figure-protocol-1
    REMARQUE: M de NaCl, m et m PEG PLA sont respectivement la masse théorique de NaCl, le PEG, PLA et, en supposant que des mélanges homogènes. Til a des densités (ρ) de NaCl, le PEG et le PLA sont respectivement de 2,16 g / cm3, 1,12 g / cm 3 e 1,24 g / cm 3.
  2. Pondérer les échantillons après le lessivage et le séchage, afin d'évaluer la densité apparente des échantillons (ρ échafaudage), puis d' évaluer la réelle porosité comme l'inverse du rapport entre la densité apparente de l'échafaudage et la densité non poreuse PLA par en utilisant l'expression (2).
    NOTE: Il exprime le rapport entre le volume vide de l'échafaudage et le volume complet de l'échafaud (vide + plein).
    figure-protocol-2

5. Propriétés mécaniques

  1. Tester les échantillons selon le mode de compression utilisant une machine de traction équipée d'une cellule 1 kN de charge. Réglez une vitesse de déformation constante de 1 mm min -1.
  2. Afin d'étudier les performances mécaniques des échantillons dans l'environnement physiologique, équiper le dynamometer avec un bain contenant (PBS), (pH = 7,4) à 37 ° C et effectuer le test avec la même configuration que celle décrite au point 5.1.
    1. Avant chaque mesure dans un environnement humide, tremper les échantillons avec du PBS dans une fiole à vide pendant 5 minutes afin de laisser PBS remplir tous les pores. Par la suite, permettent aux échafauds de rester dans PBS à 37 ° C pendant 15 minutes pour atteindre la température de consigne.
  3. Déterminer la force d'adhérence interfaciale (IAS) entre les couches de TL A et B TL en utilisant un équipement de test de résistance interfaciale conçu sur mesure, relié à une machine d' essai mécanique suivant une méthode décrite dans la littérature 32,34.
    1. Fixer l'échafaud sur la plate-forme et d'assurer son alignement correct avec la cellule et la base de la charge du cylindre de la machine. Fixer les échantillons d'échafaudage à des bouts de test d'aluminium en utilisant un adhésif à haute viscosité et les placer dans l'équipement pour les tests.
    2. Pour le test de l'état humide, hydrater les échantillons dans PBS pendant 1 h priou à l'essai. Utiliser une cellule kN 1 de charge, sous une charge de traction appliquée à un taux de 1 mm min -1 souche.
      NOTE: Prendre en compte que l'échec peut se produire soit à la résistance à la rupture de l'une des couches ou à cause de délaminage au niveau des interfaces. Évaluer l'IAS comme la force maximale de la courbe contrainte-déformation.

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Résultats

L'influence de la taille des particules de NaCl sur l'architecture des pores de l'échafaudage a été évaluée qualitativement et quantitativement en examinant la morphologie des échantillons et le calcul de la distribution de taille des pores par analyse d'image, respectivement , la figure 2A -. F montre des micrographies MEB des échafaudages mono-couches résultantes sel de lixiviation de matériaux contenant différentes grosseurs de particu...

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Discussion

La première étape critique est l'optimisation de l'efficacité tamiser. Le contrôle élevé de la taille des particules de NaCl est fondamentale pour la préparation d'échafaudage avec une distribution de taille de pores souhaitée. Une autre étape essentielle est d'éviter la rupture des minces monocouches PLA lors de l'extraction de l'échantillon du moule. L'analyse de traitement d'image pourrait ne pas être représentative de l'ensemble du dispositif.

Au cours...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu financièrement par l’INSTM.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Poly(acide lactique)NatureWorksPLA 2002D
Poly(éthylène glycol)Sigma83797-1KG-F
Cloure de sodiumSigma793566-5KG-D
Solution tampon de phosfateSigmaP5368-10PAK
Mélangeur de laboratoireBrabenderPLE 330 - Plasticorder
Laboratory PressCarver
Phenom-worldProX
Universal Testing MachineInstron3365 (UK)
BioPuls BathInstron, Norwood
Sieving MachineEndecottsE.V.F.1.
Four sous videISCONSV9035
Precision BalanceSartoriusAX224
Microscopie électronique à balayage

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