Article de méthode

Caractérisation phénotypique des macrophages du Rat Kidney par cytométrie de flux

DOI :

10.3791/54599

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18 octobre 2016

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1Renal, Vascular and Diabetes Research Lab, IIS-Fundaciòn Jiménez Dìaz, Autonoma University, 2Department of Physiology, Faculty of Medicine, Complutense University, 3Department of Immunology, Centro Nacional de Microbiologìa, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

Dans cet article

Résumé

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Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour phénotypiques et l'analyse quantitative des macrophages résidents de reins de rats par cytométrie de flux. Les cellules colorées ainsi obtenues peuvent également être utilisées pour d'autres applications, y compris le tri cellulaire, l'analyse de l'expression des gènes ou des études fonctionnelles, augmentant ainsi les informations obtenues dans le modèle expérimental.

Résumé

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Il y a de plus en plus de preuves suggérant le rôle important de l’inflammation et, par conséquent, des macrophages dans le développement et la progression de l’insuffisance rénale. Les macrophages sont des cellules hétérogènes qui ont été impliquées dans les lésions rénales. Les macrophages peuvent être classés en deux phénotypes différents : les macrophages activés classiquement (macrophages M1), qui libèrent des cytokines pro-inflammatoires et favorisent la fibrose ; et des macrophages activés alternativement (macrophages M2) qui sont associés à des fonctions d’immunorégulation et de remodelage tissulaire. Ces phénotypes de macrophages doivent être discriminés et analysés pour déterminer leur contribution aux lésions rénales. Cependant, il existe peu d’études rapportant des informations phénotypiques et fonctionnelles cohérentes sur les sous-types de macrophages dans des modèles de maladies rénales inflammatoires, en particulier chez les rats. Ce fait peut être lié aux marqueurs macrophages limités utilisés chez le rat, contrairement à la souris. Par conséquent, de nouvelles stratégies sont nécessaires pour quantifier et caractériser le contenu rénal de ces cellules infiltrantes de manière fiable. Ce manuscrit détaille un protocole de digestion rénale et une analyse phénotypique et quantitative plus poussée des macrophages des reins de rat par cytométrie en flux. En bref, les reins ont été incubés avec de la collagénase et les macrophages totaux ont été identifiés selon la double présence de CD45 (antigène commun des leucocytes) et de CD68 (marqueur de macrophage PAN) dans les cellules vivantes. Cette coloration a été suivie d’une coloration de surface de CD86 (marqueur M1) et CD163 (marqueur M2). Des macrophages péritonéaux de rat ont été utilisés comme contrôle positif pour la détection des marqueurs de macrophages par cytométrie en flux. Notre protocole a entraîné une faible mortalité cellulaire et a permis de caractériser différents marqueurs protéiques intracellulaires et de surface, limitant ainsi la perte d’intégrité cellulaire observée dans d’autres protocoles. De plus, cette procédure permet d’utiliser les macrophages pour d’autres techniques, notamment le tri cellulaire et les études d’expression de l’ARNm ou des protéines, entre autres.

Introduction

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L’insuffisance rénale est un problème de santé mondial, avec une prévalence accrue et associée à une morbidité et une mortalité élevées1. L’un des mécanismes les plus importants impliqués dans la progression et le développement des lésions rénales est l’inflammation, principalement déclenchée par les macrophages. Les macrophages jouent un rôle central dans de nombreuses maladies inflammatoires, y compris les troubles rénaux2. Ainsi, une présence élevée de macrophages infiltrants a été signalée dans les biopsies de patients atteints d’insuffisance rénale aiguë (IRA) ou d’insuffisance rénale chronique (IRC)3,4. Des études récentes suggèrent que l’évolution à long terme de l’insuffisance rénale pourrait être contrôlée par les macrophages5,6. En réponse au microenvironnement local, les macrophages peuvent se différencier en différents phénotypes qui jouent diverses fonctions biologiques7. Deux phénotypes de macrophages bien différenciés ont été établis : les macrophages activés classiquement (macrophages M1) et les macrophages alternativement activés (M2)8. Les macrophages M1 favorisent l’inflammation, tandis que les macrophages M2 ont un rôle anti-inflammatoire et sont impliqués dans la réparation des tissus9. Par conséquent, une meilleure connaissance de l’hétérogénéité des macrophages est nécessaire pour comprendre leur régulation et leur contribution à la pathologie rénale et développer de nouvelles approches thérapeutiques.

Les modèles murins et rats ont été largement utilisés pour comprendre le mécanisme moléculaire et cellulaire impliqué dans les lésions rénales10. Cependant, il existe des différences substantielles dans les divers marqueurs utilisés pour identifier les phénotypes des macrophages entre ces rongeurs. Par conséquent, plusieurs marqueurs murins, tels que F4/80 ou Ly6C, ne sont pas utilisés chez le rat, limitant ainsi l’extrapolation des résultats entre ces espèces. De plus, il existe un nombre limité de marqueurs décrivant les phénotypes des macrophages chez les rats, ce qui explique le peu d’études analysant l’hétérogénéité des macrophages chez ces animaux par rapport aux souris. Par conséquent, de nouvelles stratégies de caractérisation des sous-ensembles de macrophages sont nécessaires pour comprendre le rôle des macrophages dans les modèles de maladies rénales chez le rat.

Ce manuscrit décrit un protocole pour l’analyse phénotypique et quantitative des macrophages des reins de rat par cytométrie en flux. Cette technique peut être suivie de plusieurs essais, y compris le tri cellulaire et les études d’expression de l’ARNm ou des protéines pour permettre une caractérisation approfondie du rôle des macrophages dans les maladies rénales.

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Protocole

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Ce protocole a été approuvé par des institutions locales de protection des animaux et l'utilisation des comités suite à la directive 2010/63 / UE du Parlement européen et la ligne directrice nationale 53/2013.

1. Préparation des réactifs et solutions

  1. Préparer tous les réactifs et les solutions dans des conditions stériles et à utiliser sous une hotte à flux laminaire. Conserver les solutions à 4 ° C.
  2. Préparer tampon de coloration (2% de sérum bovin fœtal (FBS) dans du PBS 1x Dulbecco).
  3. Préparer une solution de collagénase en ajoutant 0,5 mg de collagénase à chaque ml de solution saline.
  4. Préparer une solution d'anesthésie de la kétamine / xylazine (2: 1 v / v).

2. Kidney Perfusion et Extraction

  1. Anesthésier les rats par injection intraperitoneale de kétamine / xylazine (75 mg / 12 mg / kg de poids). pincer délicatement un petit pli de la peau, pour vérifier que l'animal est suffisamment anesthésiée. Ensuite, couvrir les yeux avec vétérinaire onguent pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Note: 4-mone rats Wistar sont utilisés dans cet essai.
  2. Une fois que le rat est totalement anesthésié, placez-le sur une table chirurgicale en position couchée.
  3. Appliquer 70% d'éthanol dans l'abdomen.
  4. Faire une incision centrale à travers la peau abdominale et le péritoine, du pubis à la cage thoracique afin d'exposer les cavités pleurale et abdominale.
  5. Injecter une solution saline (0,9%) dans l'aorte abdominale pour perfuser les reins en utilisant un système de perfusion jusqu'à ce que tout le sang est retiré du rein. Couper l'aorte au niveau abdominal pour aider à libérer le sang.
  6. Retirer les deux reins du rat en coupant du hile rénal (veine rénale, l'artère et de l'uretère). Pour décapsuler le rein, appuyez sur le bord du rein en utilisant les doigts, séparer soigneusement la capsule 11.
  7. Placer le rein dans une solution saline équilibrée de Hanks.

3. Rein Digestion et Cell Suspension

  1. Coupez la moitié d'un rein avec des ciseaux en petits morceaux et mettez-lemorceaux dans un tube de 1,5 ml.
    Remarque: Toutes les concentrations suivantes sont calculés pour 1 échantillon (de rein de 1/2 rat).
  2. Ajouter 1 ml de la solution de collagénase et incuber à 37 ° C pendant 30 min. Mélanger par inversion toutes les 5 minutes pour vous assurer que la solution de collagénase accède au tissu entier.
  3. Recueillir la solution et le faire passer à travers un filtre (40 pm) à l'aide d'un piston, et remettre en suspension dans 10 ml de tampon de coloration.
  4. Centrifuger à 400 g pendant 15 min.
  5. Re-suspendre le culot dans 1 ml ACK (Ammonium-Chloride-potassium) Lyse Buffer. Au bout de 1 min 30 sec à la température ambiante, on ajoute 10 ml de tampon de coloration pour arrêter la réaction.
  6. Centrifuger à 400 g pendant 10 min.
  7. Remettre en suspension le culot dans un volume suffisant de tampon (1 ml) et filtrer la coloration de la suspension cellulaire à l'aide d'un filtre (30 pm).
  8. Comptez le nombre de cellules en utilisant l'exclusion du bleu trypan sur un hémocytomètre et ajouter 2 millions de cellules dans un tube de 1,5 ml pour staining.

4. Cellule d'analyse Coloration et cytométrie de flux

  1. Centrifuger les cellules à 100 g pendant 5 min.
  2. Remettre en suspension le culot dans 100 pl de sérum de rat (dilution 1: 100) pendant 10 min à 4 ° C pour bloquer les récepteurs Fc.
  3. Lavage en ajoutant 1 ml de tampon de coloration et de centrifugation 100 g pendant 5 min.
  4. Mélanger les anticorps pour la coloration de la surface cellulaire dans 100 pi de tampon de coloration pour chaque condition: CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) et de solution pour détecter des cellules vivantes (3: 1000).
  5. Remettre en suspension le culot cellulaire dans le mélange d'anticorps pendant 20 minutes à 4 ° C dans l'obscurité.
  6. Lavage en ajoutant 1 ml de tampon de coloration et centrifuger à 100 g pendant 5 min. Répétez cette étape.
  7. Ajouter 600 ul d'une solution / perméabilisation de fixation pendant 20 min à 4 ° C dans l'obscurité.
  8. Laver 2 fois avec 1 ml de tampon perméabilisation / Wash et centrifuger à 170 g pendant 5 min.
  9. Ajouter l'anticorps CD68 FITC (35: 1000) pour le Intracelcoloration lular à 100 pi de tampon de perméabilisation / Wash pour chaque condition.
  10. Remettre en suspension le culot dans la solution de CD68-anticorps et incuber pendant 50 min à 4 ° C dans l'obscurité.
  11. Laver avec 1 ml de tampon perméabilisation / Wash et centrifuger à 170 g pendant 5 min.
  12. Re-suspendre le culot dans 100 ul de tampon de perméabilisation / Wash, ajouter un anticorps CD86PE (35: 1000) et incuber pendant 20 min à 4 ° C dans l'obscurité.
  13. Laver en ajoutant 1 ml de perméabilisation / tampon de lavage et de centrifugation à 100 g pendant 5 min.
  14. Re-suspendre le culot dans 100 ul de tampon perméabilisation / Wash et de passer à une cytométrie en flux tube.
  15. Analyser les échantillons par cytométrie de flux. Déterminer CD45 coloration dans les cellules vivantes gated à la lumière / lumière diffusée vers l'avant-Side dispersés (SSC / FSC) fenêtre. Dans une deuxième étape, l' analyse de CD86 et de l' expression de CD163 dans des cellules CD68 +.

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Résultats

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Nous avons analysé l'hétérogénéité des macrophages dans un modèle expérimental de lésion rénale inflammatoire associée à une présence accrue de l'infiltration des macrophages dans le rein. Dans ce modèle, les lésions rénales a été induite par l' administration de l' aldostérone (1 mg -1 kg -1 jour) plus de sel (NaCl 1%) dans l' eau potable pendant 3 semaines chez les rats Wistar, comme indiqué précédemment 12.

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Discussion

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Les macrophages sont des cellules hétérogènes qui jouent un rôle important dans diverses maladies inflammatoires, y compris les troubles rénaux. Il y a un intérêt croissant pour la caractérisation des sous - ensembles des macrophages dans la maladie rénale parce que chaque sous - population macrophage contribue d'une manière différente au développement des lésions rénales, comme indiqué dans la glomérulonéphrite, la néphropathie diabétique et le cancer du rein 14-16. Dans les premiers stades de la lésion ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par des subventions de FIS/FEDER (Programa Miguel Servet : CP10/00479, PI13/00802 et PI14/00883), de la Société espagnole d’athérosclérose, de la Société espagnole de néphrologie et de la Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) à Juan Antonio Moreno. FIS/FEDER finance PI14/00386 et Instituto Reina Sofìa de Investigaciòn Nefrològica à Jesús Egido. Fundaciòn Conchita Rabago à Melania Guerrero Hue. Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) à Alfonso Rubio Navarro.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Hotte à flux laminaireFasterOu équipement équivalent
CentrifugeuseHettichOu équipement équivalent
Cytomètre en flux (FACSAria)BD Biosciences
Sérum fœtal bovinBioWestS1820-500
PBS 10xLONZABE17-515Q
CollagénaseSigma-Aldrich12/1/9001
Tampon de lyse ACKThermo Fisher ScientificA10492-01
Filtres de cytométrie en flux BDBiosciences340626
Filtres à cellules FalconThermo Fisher Scientific352340
Tubes de cytométrieen flux Falcon3520525 ml Tube en polystyrène à fond rond
Tubes à centrifugerCorning centristar430791
Bain-marieMemmert GmbH + Co. KGWNE 737 ° ; C
Solution de fixation/perméabilisation ou tampon de perméabilisation/lavageBD Biosciences554714
Rompum (xylazine)BayerOu équivalent
Ketalar (kétamine)PfizerOu équivalent
Solution saline équilibrée de HanksSigma-AldrichH8264-500ML
Solution salineBraun
Anti-CD45 (clone : OX-1) APC-Cy7Biolegend202216Dilué 1:100
Anti-CD68 (clone : ED1) FITCBio-RADMCA341FDilué 35:1 000
anti-CD86 (clone : 24F) PEBiolegend200307Dilué 35:1 000
anti-CD163 (clone : ED2) Alexa Fluor 647Bio-RADMCA342RDilué 4:100
Colorant vivant/mort  ;Sondes moléculairesL34955diluées 3:1 000
622415

Références

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  1. Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
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Mots-clés

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