Subcellulaires Recordings Patch-clamp du Domaine somato de nigrales Dopamine Neurones

Résumé

Les enregistrements de patch-clamp subcellulaires offrent la possibilité d’étudier les propriétés fonctionnelles des dendrites. Cependant, ces structures fines ne sont pas facilement accessibles en raison de leur petit diamètre. Le protocole décrit ici vise à faciliter la collecte d’enregistrements stables et fiables à partir des dendrites des neurones dopaminergiques en tranches in vitro.

Résumé

Les dendrites des neurones dopaminergiques reçoivent et transmettent entrée synaptique, le soutien potentiel d'action back-propagation et la libération de neurotransmetteurs. La compréhension de ces fonctions fondamentales fera la lumière sur le transfert de l'information dans ces neurones. patch-clamp enregistrements dendritiques offrent la possibilité d'examiner directement les propriétés électriques des dendrites et des canaux voltage-dépendants sous-jacents ion. Cependant, ces structures fines ne sont pas facilement accessibles aux pipettes de patch en raison de leur petit diamètre. Ce rapport décrit une procédure étape par étape pour recueillir des enregistrements stables et fiables des dendrites des neurones dopaminergiques dans des tranches aiguës. Mesures électrophysiologiques sont combinées avec la récupération post hoc de la morphologie cellulaire. Des expériences réussies reposent sur l'amélioration de la préparation des tranches, des solutions et des pipettes, le réglage adéquat de l'optique et de la stabilité de la pipette en contact avec la structure enregistrée. principes standard de somatique enregistrement patch-clamp sont appliqués à dendrites, mais avec une approche plus douce de la pipette. Ces techniques polyvalentes peuvent être mises en œuvre pour répondre à diverses questions concernant les propriétés excitables de dendrites.

Introduction

Les neurones reçoivent des informations synaptique principalement sur leurs dendrites. Excitateurs synaptiques et des signaux inhibiteurs répartis sur leur site de production au site d'intégration, où les potentiels d'action (PA) sont évoqués en tant que signal de sortie. Sur leur chemin, les potentiels synaptiques sont influencées à la fois par la structure de dendrites et l'interaction entre les propriétés des membranes passives et actives. La combinaison de ces paramètres très variables élargit la puissance de calcul des neurones ^1,2. Cependant, le faible diamètre des dendrites entrave mais l'étude de leurs propriétés électriques. Le développement continu de la technique patch-clamp ^3, l'optique ⁴ et le perfectionnement des méthodes de préparation de tranches ⁵ au cours des dernières décennies ont permis à des enregistrements de très mince (0,7 à 3 pm Ø) dendrites ^6,7. Ces méthodes ont été, et sont encore largement utilisés pour examiner l'excitabilité des dendrites dans une variété oneurones f ^8. Enregistrements dendritiques directs sont essentiels pour déterminer la distribution ^9-19 et les différences dans les propriétés fonctionnelles ^20-22 des canaux ioniques dans des compartiments neuronaux distincts. Ces données sont le complément nécessaire des distributions de canaux ioniques détectés par immunohistochimie combinée à la lumière et microscopie électronique ^23,24. Enregistrements doubles somatodendritiques ont été mis en œuvre pour explorer la propagation des potentiels d'action ^{9,13-15,21,22,25-27} et la propagation des potentiels synaptiques ^13,16,18 le long du domaine somato de neurones, obtenir des modèles passifs détaillés de câble ^{28- 30} et enquêter sur la résolution temporelle de l' intégration neuronale ^31.

Le substantia nigra (SN) est une région située dans le mésencéphale impliqué dans plusieurs fonctions telles que le contrôle du mouvement, le codage de la récompense et les comportements habituels. La diminution de la dopamine en raison de la spécifiquela perte de dopaminergiques (DA) dans les neurones du SN est associée à des troubles moteurs observés chez les patients atteints de la maladie de Parkinson ^32. Le circuit nigrale se compose de deux principaux types de cellules: les neurones dopaminergiques et GABAergiques. Fait intéressant, ces neurones présentent plusieurs caractéristiques qui les distinguent des autres neurones. L'axone d'une proportion importante de neurones dopaminergiques et certains neurones GABA provient d'un site dendritique indiquant que l'arbre dendritique est hétérogène (axones et dendrites portant axonales dépourvue) ^25,26,33. La morphologie de ces neurones contraste donc avec l'organisation typique des neurones dans lesquels le transfert d'information suit la loi de polarisation dynamique émise par Cajal: à partir de dendrites, de soma et enfin à AXON ^34. Les neurones dopaminergiques sont également connus pour libérer de la dopamine à partir de leurs dendrites ^35, génèrent une activité d'éclatement ³⁶ et ³⁷ plasticité du récepteur NMDA. La dissectiontion de ces phénomènes est insaisissable sans enregistrements directs à partir du site où ils sont initiés. Afin de mieux comprendre la relation entre l'emplacement précis et les propriétés fonctionnelles des canaux ioniques et leur rôle dans le transfert de l'excitabilité et de l'information dendritique dans les neurones de la substance noire, les enregistrements dendritiques directs sont la méthode de choix.

Ce rapport décrit une procédure détaillée qui peut être utilisé pour obtenir des enregistrements de patch-clamp simple et double de dendrites des neurones de la substance noire et le biocytin étiquetage correspondant post hoc. Les principes de base pour patcher le somatique et la membrane dendritique sont très similaires. Pratiquement cependant, les enregistrements à partir de sites dendritiques nécessitent une optimisation spécifique par rapport aux enregistrements somatiques. enregistrements dendritiques succès reposent sur la qualité des tranches, l'ajustement optimal de l'optique, l'approche douce de la pipette de patch et de la stabilité des enregistrements.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales décrites ici suivent les directives institutionnelles et nationales, les directives européennes pour la protection des animaux et les lignes directrices de la Fédération de l'Association européenne des animaux de laboratoire Science.

1. Préparation des solutions

1. Liquide céphalo - rachidien artificiel standard (ACSF; tableau 1)
   1. Utiliser des sels de grande pureté ³⁸ et béchers en verre propre préalablement rincés à l' eau distillée deux fois pour préparer une solution fraîche. Utiliser de l'eau distillée deux fois de haute qualité pour la préparation de toutes les solutions extra- et intracellulaires.
   2. Prenez 2 L bêcher pour dissoudre NaHCO ₃ dans 500 ml d' eau et une autre pour dissoudre les autres sels afin d'empêcher la précipitation des ions divalents ³⁹ selon le tableau 1. Nettoyer la spatule systématiquement avec de l' eau distillée deux fois et le sécher avant de prendre un sel . Utiliser un agitateur magnétique pour homogénéiser DISSOLUTIOn. Ajouter les solutions des deux béchers à une fiole jaugée appropriée et apporter au volume approprié.
   3. Assurez-vous que la solution extracellulaire finale est totalement transparente et sans aucune trace de précipitations.
   4. Appliquer un mélange gazeux composé de 95% O ₂ et 5% de CO ₂ (gaz carbogène) avec une bougie de microfiltrage de verre (Ø 13 mm) 20 - 30 min avant de perfuser les rondelles ^38,40. Contrôlez soigneusement l'osmolarité (2 - 3 des mesures consécutives) de l'ACSF avec un osmomètre (plage optimale: 314-325 mOsmol / L). Conserver la solution restante après la préparation à 4 ° C et de l'utiliser dans les 3 jours.
2. Solution de coupe (saccharose-ACSF; tableau 2) ^5,13
   1. Préparer 3 L de solution fraîche. Utilisez 1 L pour préparer des tranches de cerveau d'un animal. Conserver la solution restante à 4 ° C et de l'utiliser dans les 3 jours.
      NOTE: Haute Mg ²⁺ et de faibles concentrations de ^{Ca2 +} sont utilisées pour dla transmission synaptique iminution et le remplacement de quelques - uns de NaCl avec du saccharose pour préserver le tissu de ^5,40.
3. solutions intracellulaires
   1. Préparer à l' avance une solution de 100 ml pour l' enregistrement de cellules entières doubles (tableau 3).
   2. Inclure méthylsulfate ^13,15,21 pour obtenir une bonne récupération de la morphologie des cellules. Ajouter biocytine (0,1 à 0,4%) pour examiner ensuite la morphologie du neurone. Inclure un colorant fluorescent (par exemple, 594 ou Alexa 101 sulforhodamine ⁴¹⁾ pour suivre l'extension de dendrites au cours de l'enregistrement ( en option).
   3. Préparer à l' avance une solution de 100 ml d' électrode pour l' enregistrement cellule attachée (tableau 4). Dans ce cas , la solution interne est une solution à haute-K ⁺ conçu pour isoler le courant macroscopique cationique activé par hyperpolarisation (I _h) , et contient les programmes de blocage pour les autres canaux ioniques voltage-dépendants.
   4. intra magasinsolutions cellulaires dans 2 aliquotes ml à -20 ° C. Utilisez une nouvelle aliquote pour chaque nouvelle session d'enregistrement. Vérifiez l'osmolarité de chaque aliquote décongelés soigneusement avec un osmomètre. Prenez une nouvelle aliquote si l'osmolarité ne correspond pas à la valeur initiale.
   5. Transférer la solution de la fraction aliquote dans une seringue de 3 ml sur le dessus de laquelle un filtre à seringue stérile de 0,22 um est placée. Conserver la seringue sur la glace au cours de la session d'enregistrement pour limiter la dégradation de ses composés (ATP, GTP ou phosphocréatine).

2. Fabrication et remplissage de Patch Pipette

1. Tirant
   1. Utiliser un extracteur d'électrode horizontale et à paroi épaisse tube en verre de borosilicate. Pour l'ensemble des cellules et des enregistrements attachés aux cellules, utiliser un diamètre extérieur de 2 mm / 1 mm de diamètre intérieur. Assurez -vous que le tube de verre est absolument propre ^38.
   2. Si cela est le cas, immergez capillaires en verre dans un solvant organique (par exemple, l' éthanol) D'abord, puis dans de l'eau distillée deux fois. chauffer brièvement terminaisons capillaires avec un brûleur Bunsen. En variante, un tube de verre de commande lavé et chauffé directement par le fabricant (voir la liste des matériaux).
   3. Pour les deux enregistrements somatodendritiques, faire en sorte que la résistance à la pipette somatique est comprise entre 6 et 10 MQ ^6,11 et entre 8 et 19 MQ pour pipettes dendritiques quand il est rempli avec la solution intracellulaire (tableau 3). Normaliser la résistance de la pipette pour l' enregistrement cellule attachée à une résistance de 10 MQ pour obtenir des résultats comparables , ainsi que le domaine du neurone somato ^16,18,42,43.
   4. Préparer pipettes frais avant chaque session d' enregistrement (tous les jours) ou immédiatement avant ragréage et de les utiliser 5-8 h après leur fabrication ^39. pipettes Stocker dans un récipient en verre recouvert pour les protéger de la poussière et de l'obstruction de la pointe.
2. Polissage
   1. Inspecter et heat-polish chaque pointe de la pipette avec un microforge pour obtenir de meilleurs joints avec la membrane. Avant d'utiliser le microforge, faire fondre un petit morceau de verre sur le filament de chauffage de platine. Remplacer ce revêtement de verre sur le filament de platine par jour pour la constance (Peter Jonas, communication personnelle).
      NOTE: Pipettes utilisés pour les enregistrements attachés cellules peuvent être revêtus avant l'étape de la chaleur de polissage pour réduire le bruit de fond. Le revêtement peut être réalisé avec un agent isolant tel que de la cire fondue dentaire ^22,44 ou d' un élastomère de silicone ^39.

3. Préparation des tranches cérébrales

1. Utiliser des rats sains Wistar âgés de 16 - de 19 jours. Ne pas utiliser des animaux ou des animaux malades souffrant d'hypothermie ou de déshydratation. Avant de commencer la préparation de tranches garder l'animal dans un endroit sûr et silencieux. Évitez d'avoir tout autre animal dans la chambre tout en préparant un animal. Manipuler les animaux doucement.
2. Verser le saccharose ACSF en deux 400polypropylène mL (PP) béchers et les placer dans le -80 ° C congélateur pendant 45 min. Mélanger la solution pour obtenir un liquide / solution congelée de glace froide homogène et placer les béchers sur la glace. Fournir la solution de saccharose-ACSF avec du gaz carbogène en utilisant une bougie microfiltre (Ø 13 mm) dans chaque bécher PP.
3. Préparer la trancheuse et la chambre de réserve
   1. Utilisez une trancheuse de tissu de haute qualité avec très faibles vibrations verticales ^5,38 pour minimiser les dommages aux couches superficielles de tranches, autant que possible. Fixer une lame fraîche et toute rasoir sur la trancheuse.
   2. Utilisez une lame de rasoir neuve pour chaque session de coupe. Éviter la flexion de la lame de rasoir. Ne pas retirer le film gras à la surface de la lame de rasoir (Josef Bischofberger, communication personnelle).
   3. Si elle est disponible, vérifier les vibrations verticales avec un vibroprobe fourni par le fabricant. Sinon, utilisez un vibroprobe sur mesure ^5. Réduire les vibrations verticales de la pale deo à être aussi proche que possible de 0 um.
   4. Préparer une chambre 150 de réserve mL ^45,46 pour les tranches comme représenté sur p. 201 Réf. ^39. Verser ACSF standard dans la chambre de réserve et le placer dans un bain d'eau. Fournir la solution de la chambre de réserve avec carbogène en utilisant une bougie microfiltre (Ø 6 mm). Veiller à ce que les bulles CARBOGEN sont aussi minuscules que possible.
      REMARQUE: Construire une nouvelle chambre de réserve tous les 2 - 3 mois pour maintenir constante la qualité de coupe.
4. Couper les tranches
   1. Dans une salle silencieuse dans laquelle l'expérimentateur ne soit pas perturbé ou stressé, décapite l'animal avec des ciseaux de chirurgie (longueur 150 mm) au niveau de la moelle cervicale.
   2. Couper la peau au dessus de la tête de l'animal dans le nez à la direction caudale avec un scalpel et le retirer latéralement. Coupez le haut du crâne de la caudale à la partie nasale de la tête avec des ciseaux fins et enlever les deux parties du crâne latéralement. Retirez le bla pluie avec une spatule fine et déposez - le avec précaution dans un bécher de PP contenant de la glace-froid (0-4 ° C) de saccharose-ACSF équilibrée avec carbogène ^38.
      NOTE: Cette séquence d'étapes doit être fait le plus rapidement possible, mais aussi méticuleusement (<< 1 min, environ 40 s).
   3. Maintenir le cerveau dans la solution du récipient en PP ~ 2 à 5 minutes. Régler la pression de carbogène pour éviter les mouvements du cerveau. Remplacer la bougie microfiltre si les bulles CARBOGEN sont trop grandes avec une nouvelle.
   4. Placer le cerveau sur une boîte de Petri de 9 cm , dans lequel le fond intérieur est recouvert d'un ~ 0,5 cm d' épaisseur Sylgard couche ^38. Préparer cette boîte de Pétri à l'avance.
   5. Entourez le cerveau avec de la glace froide sucrose-ACSF. Assurez-vous que certains phase liquide de solution ACSF-sucrose submerge le cerveau. Pour coupes coronales, couper la partie frontale du cerveau dans le plan coronal avec un scalpel ou une lame de rasoir. Retirer le cervelet avec une coupe coronale.
   6. Appliquer cyanola colle d' acrylate sur le plateau d'échantillons (zone 1 ~ cm ^2). Collez le bloc de cerveau de telle sorte que la partie frontale fait face à la scène de tranchage. goutte à goutte avec précaution le saccharose-ACSF sur le dessus du cerveau collé à l'aide de la grande ouverture d'une pipette Pasteur en verre, puis plonger lentement la chambre de coupe de la trancheuse. Manœuvrer le plateau d'échantillons de telle sorte que la surface de coupe (ie, le premier tissu de frapper la lame) est la surface ventrale du cerveau ^40.
   7. Appliquer carbogène avec une bougie de microfiltre de verre fléchie (Ø 6 mm) à la chambre de coupe (en option).
   8. Ajuster la lame de rasoir à un angle d'environ 15 ° par rapport au plan horizontal ^5. Couper des tranches coronales de cerveau de ~ 500 pm dans la direction caudale par rapport à nez avant d'atteindre la substantia nigra. Diminuer l'épaisseur à couper 300 - 350 um tranches épaisses contenant la région d'intérêt.
   9. tranches séparées du bloc de tissu avec une aiguille de perfusion très mince attaché àune seringue parallèle au bord de la lame de rasoir. De courbure de l'aiguille de manière à avoir un angle de 90 ° entre l'aiguille et la seringue. Veiller à ce qu'aucune pression ne soit appliquée à la lame de rasoir, tout en enlevant la tranche du bloc de tissu.
5. Tranches de magasins
   1. Transférer les tranches en utilisant la plus grande ouverture d'une pipette Pasteur en verre (fixé à une ampoule) dans la chambre de réserve. Une fois que toutes les tranches sont transférées dans la chambre de réserve (Christoph Schmidt-Hieber, communication personnelle) amener la température du bain d'eau à 34 ° C pendant 0,5 à 1 h.
   2. Après cette période éteindre le bain d'eau et de maintenir les tranches à la température ambiante. Régler la pression de carbogène afin d'éviter les mouvements des tranches dans la chambre de réserve. Gardez les tranches pendant encore 10 à 20 minutes avant de commencer les enregistrements.
   3. Nettoyer l'équipement et les bougies de microfiltration soigneusement encore avec de l'eau distillée deux fois à la fin de l'sliCing procédure.

4. Double somatique et Somatodendric Recordings à nigrales Neurosciences biocytine Dépôt

1. Suivez les descriptions pour le montage d'une installation de patch-clamp pour les tranches indiquées dans Le Guide Axon et Refs. ^39,40,47. Informations concernant les aspects les plus fondamentaux de patching sont en Réf. ^48.
2. Préparer chambre d' enregistrement
   1. Placez 1 - 2 ml d'eau distillée deux fois dans la chambre d'enregistrement. Vérifiez qu'il n'y a pas de fuite. Placez la chambre d'enregistrement sur la table xy décalage.
   2. Alimenter ACSF norme au moyen d'un système de tuyauterie de perfusion imperméable à l'oxygène (polytétrafluoroéthylène) à la chambre d'enregistrement. Stabiliser le débit de perfusion dans la chambre à un débit de 4 - 5 ml min ^-1. Maintenir la longueur du tube joignant le récipient contenant l'ACSF et la chambre d'enregistrement le plus court possible (1 m).
   3. Sélectionnez une tranche de cerveau de la chambre de réserve et le transférer dansla chambre d'enregistrement en utilisant la plus grande ouverture d'une pipette Pasteur en verre. Recouvrir la tranche avec un anneau de platine pour son ancrage au fond de la chambre d'enregistrement tel que représenté à la p. 201 Réf. ^39. Utilisez un anneau de platine plat (Ø 1,5 cm) et coller des fils de nylon parallèles (espacement> 2 mm) sur elle.
3. Ajuster et optimiser l'optique
   1. Visualisez les tranches en utilisant la microscopie infrarouge (IR) vidéo ^4,47,49,50. Réglez l'éclairage de Köhler ⁵¹ et optimiser le contraste différentiel d'interférence (DIC) ⁵¹ optiques ou l'éclairage oblique (Dodt de contraste Gradient - DGC) ^52,53. Plus de détails sur cette procédure sont donnés dans les références. ^40,49.
   2. Vérifier la qualité de la tranche. Ne garder que les tranches avec des surfaces lisses et même qui ne sont pas trop fortement contrastées et ont seulement de petits cratères dispersés.
   3. Remplir 2 pipettes de patch frais et inutilisés avec une solution intracellulaire ( Tableau 3). Utilisez un tube de 0,5 ml contenant la solution de pipette pour remplir la pointe de la pipette par l'action de capillarité. Pour accélérer le remplissage de pointe de pipettes sans filament, appliquer une pression négative à la fin de la pipette en utilisant un tube fixé à une seringue.
4. Positionner les pipettes dessus de la surface de la tranche
   1. Vérifiez la présence de chlorure revêtement sur les fils d'argent (électrode de référence du bain et de l' électrode de patch; pour plus de détails, consultez le Guide Axon et Refs ^39,54.).
   2. Insérer la pipette de façon séquentielle dans les supports de pipettes et d' appliquer une pression positive (~ 70 mbar) en utilisant un circuit de tubes reliant le support de pipette, un robinet à trois voies ⁴⁰ et d' un manomètre. Abaisser la pipette dans le bain de la chambre d'enregistrement.
   3. Vérifier que la valeur de la pression sur le manomètre est constante pendant environ 1 - 2 min. Si la pression diminue, vérifier la tuyauterie ou l'étanchéité des joints toriques à l'intérieur du porte-pipette.
   4. Placez la pointe de la pipette dans le milieu de l'écran vidéo et veiller à ce qu'elle ne soit pas obstrué. Assurez-vous que la pointe de la pipette ne se déplace pas lors de l'application ou de relâcher la pression à la pipette.
   5. Vérifiez la dérive et les vibrations de la pointe de pipette en tirant une petite croix au centre de l'écran exactement à la position de la pointe de la pipette et d'observer pendant 5 min mouvements possibles de la pointe.
   6. Appliquer un échelon de tension (5 mV) pour surveiller la résistance à la pipette sur un oscilloscope. Réglez le potentiel de maintien de l'amplificateur patch-clamp à 0 mV. Annuler la pipette potentiel de décalage de telle sorte que le courant continu de la pipette est à zéro au compteur amplificateur ^39,51.
   7. Déplacez les pipettes vers le bas pour la tranche et les maintenir au-dessus de la surface.
5. Sélectionnez et patcher un neurone avec de longues dendrites
   1. Dans le substantia nigra sélectionner un neurone sain avec de longues dendrites qui peuvent être suivies sur une longue distance à peu près le même plane (figure 1A et 1B) en utilisant Contraste IR-Dodt Gradient (IR-DGC). Choisissez un corps cellulaire lisse et homogène. Évitez les deux cellules fortement contrastées à la surface de la tranche (figure 1C et 1D), car il est difficile de briser et de préserver des conditions d'enregistrement stables au fil du temps (résistance série stable). Sélectionnez les neurones qui ont leur soma 10 - 30 um sous la surface de la tranche.
   2. Déplacer l'électrode somatique à proximité du soma (40 - 50 um loin) et l'électrode dendritique à proximité de la dendrite à la même distance. Utilisez un grossissement 2X (changeur quadruple) pour sélectionner et patcher une partie d'un dendrite. Obtenir sur le moniteur d'un grossissement absolu de 2,100X sans grossissement (1X) et de 5,500X avec un grossissement 2X.
   3. Légèrement relâcher la pression de la pipette somatique de 10 mbar. Si nécessaire, régler la pression de la pipette dendritique et somatique pour éviter le déplacement de la cStructure ell (soma et dendrites) dans la tranche.
   4. Placez la pipette dendritique à proximité de la membrane afin de voir une petite capitons. Relâchez la pression sur la pointe de la pipette et patcher le dendrite tout en contrôlant la résistance à la pipette. Dans des conditions idéales, seulement une très légère aspiration est suffisante pour obtenir une bonne étanchéité.
   5. Gardez la pipette dendritique en mode cellule attachée. Déplacer la pipette somatique à proximité de la membrane somatique et patcher la membrane somatique. Veiller à ce qu'une haute résistance d'étanchéité est obtenue avant la rupture de la membrane cellulaire (> 1 GQ) ^39. Rétracter légèrement les deux pipettes à une distance de la membrane par un couple de um pour éviter la déformation du corps cellulaire et des dendrites.
   6. Pour les deux pipettes, de réduire autant que possible l'amplitude des transitoires de capacité pipette au - dessus de l'étape en cours en utilisant une impulsion de tension à gain élevé et peu de filtrage ⁵¹ et l'oscilloscope. Entrez dans la cellule entière en mode wie la pipette dendritique et ensuite avec la pipette somatique.
   7. Éliminer les transitoires de capacité de cellules entières et de compenser la résistance série. Surveiller et documenter la résistance d'accès au début de, et régulièrement pendant l'expérience. Si la résistance série est trop élevée (> 50 MQ), réessayer avec une autre pipette.
   8. Collecter images IR-DGC (Figure 1A et 1B) avec une imprimante vidéo graphique ^25, une carte d'acquisition ou d' un appareil photo numérique à grossissements haute et basse.
      NOTE: Gonflement des neurones pendant l' enregistrement (Figure 1E et 1F) est sporadiquement observé, mais rarement quand l'osmolarité et le pH des solutions est réglé correctement ^39.
   9. Obtenir des enregistrements doubles somatiques de cellules entières (soma - soma) avec la même procédure (figure 2A).
6. Appliquer long (plusieurs centaines de ms) de plus en plus de dépolarisation étapes actuelles séquentiellementavec la pipette somatique et dendritique pour évoquer les points d' accès (figures 2B, 3C et 3D). Notez le potentiel résultant à la dendritique et pipette somatique simultanément.
7. Examiner la propagation des potentiels postsynaptiques excitateurs artificiels (aEPSPs) dans les neurones dopaminergiques
   1. Créer un courant post - synaptique (RPEC) forme d' onde excitatrice pour injecter comme une commande de courant pendant deux enregistrements de courant-clamp (figures 4A et 4B). Pour ce faire, construire une double fonction exponentielle avec amplitude et cours du temps des valeurs correspondant à des valeurs réelles mesurées pour EPSCs dans le neurone d'intérêt ^55. Contrôlez soigneusement les taux du RPEC construit et de la forme d'onde de RPEC injecté échantillonnage pour préserver le cours du temps d'origine.
      Remarque: Avant d'appliquer la forme d'onde dans un vrai neurone, le tester en utilisant une cellule de modèle.
   2. Séquentiellement injecter la forme d'onde via le dendritique etpipette somatique et enregistrer les potentiels pour les deux pipettes somatiques et dendritiques concomitante résultant. Vérifiez régulièrement possible dérive des pipettes.
8. Finalisation de l'enregistrement à partir d' un neurone
   1. Prenez une photo IR-DGC à un faible grossissement (objectif: 5X ou 10X) pour documenter la position du neurone dans la tranche et les électrodes.
   2. Retirer doucement et lentement la dendritique et les pipettes somatiques à partir de la membrane neuronale en séquence afin de former outside-out correctifs avec les deux pipettes. Retirer la pipette en utilisant une séquence de mouvements ^latéraux-38 vers le haut. Ceux-ci devraient être à court d'abord, puis augmenter progressivement en longueur. Cette configuration d'enregistrement favorise la bonne fermeture de la membrane cellulaire.
   3. Surveiller la décroissance des courants capacitifs (augmentation de la résistance d'accès) en réponse à une impulsion de tension de 5 mV à la tension de serrage tout en retirant la pipette.
   4. Une fois que la membrane est de la merconduit autour de la pointe de la pipette, prendre complètement hors de la chambre d'enregistrement. Retirer l'objectif du bain. Maintenir la tranche dans la chambre d'enregistrement pendant 15 - 20 min dans la norme ACSF pour permettre l'équilibrage de la biocytine (à partir de la solution intracellulaire) dans le neurone enregistré.
   5. transférer doucement la tranche en utilisant la grande ouverture d'une pipette Pasteur dans un 25 ml bouche large bouteille ambre (marron) en verre contenant ACSF standard. Fermez la bouteille avec un bouchon. Voir le paragraphe 6 pour l'étape de fixation.

5. Les enregistrements cellulaires-joint

1. Sélectionner un neurone avec une dendrite prolongeant sur une longue distance dans le même plan. Assurez-vous que la dendrite d'intérêt peut être suivi à un soma bien défini.
2. Remplir la pipette de patch avec une solution d'électrode (tableau 4). Concevoir la solution pour enregistrer le courant d'intérêt dans la configuration cellule attachée par l'inclusion d'agents pharmacologiques spécifiques pour bloquer d'autres ions channels.
3. Patch du dendrites dans le mode cellule attachée
   1. Visualiser une partie de la dendrite et approcher la pipette de recodage utilisant le manipulateur. Adapter la pression à la pointe de la pipette en vérifiant le manomètre (70 - 80 mbar) pour éviter le déplacement de la dendrite. Patcher le dendrite comme décrit dans 4.5.4.
   2. Enregistrez quelques images IR-DGC (figure 5A). Essayez d'obtenir une résistance d'étanchéité aussi grande que possible (> 1 GQ ^39), au mieux entre 3-10 GQ pour les enregistrements attachés ^cellules-18 (figure 5B). Rentrez la pipette loin de la membrane par un couple de um pour éviter la déformation de la dendrite.
   3. Observer les courants d'action en mode cellule attachée reflétant les potentiels d'action spontanés de neurones de la substance noire. Compléter le ACSF avec Ca ²⁺ et Na ⁺ bloqueurs de canaux _(CdCl2 et TTX, respectivement) pour supprimer les courants d'action.
   4. Appliquer un sv 2étape ension de -90 mV à partir d' un potentiel de maintien de 0 mV au patch pour évoquer I _h (Figure 5C). Garder à l' esprit que le potentiel de la pipette et le potentiel membranaire de repos sont en série dans la configuration cellule attachée ^56. Pour plus de détails, consultez Le guide Axon et Ref. ^39.
   5. Vérifiez régulièrement la dérive possible de la pipette.
   6. A la fin de l'enregistrement, la rupture du patch pour passer en mode de configuration cellule entière et immédiatement prendre une lecture du potentiel de membrane. Rentrez la pipette comme décrit dans les sections 4.8.2 et 4.8.3 pour obtenir un patch outside-out.
4. Enregistrement de la soma correspondante dans le mode de cellule entière
   1. Regardez le long de la dendrite et de localiser le soma correspondant. Utiliser une pipette à résistance élevée (5 à 10 MQ) ^6,14,57 rempli d'une solution de K ⁺ intracellulaire à base (tableau 3). Appliquer une brève aspiration (pression négative) à lapointe de la pipette à la rupture de la membrane afin d'entrer dans le mode cellule entière.
   2. Vérifier l'identité du neurone de courant en appliquant une pince à long hyper- et dépolariser les étapes de courant (figure 5D) et permettent de diffuser biocytine le long des dendrites. Appliquer court dépolarisants étapes actuelles pour visualiser le cours du temps AP.
   3. Après ≤10 min, retirer la pipette pour obtenir un patch outside-out tel que décrit dans les sections 4.8.2 - 4.8.3. transférer doucement la tranche en utilisant la grande ouverture d'une pipette Pasteur dans un flacon de 25 ml en verre ambré contenant ACSF standard. Fermez la bouteille avec un bouchon.
   4. En variante, d'abord obtenir un ensemble de cellules somatiques avec une solution de pipette contenant en outre un colorant fluorescent. Permettre la diffusion du colorant et de sélectionner une partie d'une dendrite ^26. Avec une deuxième pipette, patcher le dendrites dans le mode cellule attachée. Utiliser un microscope confocal si elle est disponible pour améliorer la visualisation de l'étiquette fluorescenteed Dendrite ^14,22.
   5. Effectuer des enregistrements dendritiques dans la configuration outside-out, en variante ou en plus , les enregistrements cellule attachée ^10,22. Voir un exemple de courants de voltage-dépendants enregistrés à partir d' un patch outside-out dans la figure 5E et 5F.

6. biocytine Étiquetage des nigrales Neurones

1. La fixation du tissu
   1. Si possible, utilisez des chambres séparées pour l' enregistrement de tranche / traitement histochimique ^38.
   2. Fixer les tranches en remplaçant l'ACSF avec 4% de paraformaldehyde dans 0,1 M de tampon phosphate salin (PBS, pH = 7,4) avec une pipette Pasteur. Toujours utiliser une solution fraîchement préparée fixateur (<< ancienne 1 semaine).
      ATTENTION: Utiliser des gants appropriés et une hotte chimique placé dans un laboratoire d'histologie pour manipuler paraformaldéhyde en raison de sa toxicité. Lire la fiche de données de sécurité de ce produit dangereux avant utilisation et check la réglementation concernant la sécurité chimique (Directive Substances Dangereuses (67/548 / CEE) de la Commission européenne) que cette poudre est pensé pour induire le cancer. D' autres détails sont dans la réf. ^58.
   3. Placer les tranches à 4 ° C pendant une nuit. Éviter la contamination de l'installation du patch-clamp ou tout autre équipement utilisé pour électrophysiologie par paraformaldehyde.
   4. Après fixation, remplacer la solution de fixation avec du PBS. Utilisez un autre pipettes Pasteur pour enlever la solution fixateur et l'application de la PBS. tranches de magasins dans PBS à 4 ° C avant un traitement ultérieur (1 - 2 semaines). Dans ce cas, remplacer PBS deux fois par semaine. Utilisez toujours fraîchement préparé PBS (<< ancienne 1 semaine).
2. La coloration du tissu
   1. Préparer une plaque de culture cellulaire à 24 puits pour les étapes de coloration. Utiliser un équipement propre pour transférer des tranches. Rincer les tranches 3 x 5 min à l'aide du PBS frais.
   2. Appliquer fluorescéine avidine DCS (avidine D, le grade de trieur de cellules; 1 ul fluorescein / mL de Triton X-100) et 0,3% de Triton X-100 dans du PBS à 4 ° C pendant une nuit. Protéger les tranches de la lumière tout au long de la coloration. En guise d'alternative à la fluorescence, les neurones de l' étiquette par l' intermédiaire de la 3,3'-diaminobenzidine pour la lumière ou d' électrons analyse microscopique ^21,58.
      ATTENTION: Triton X-100 est dangereux. Lire la fiche de données de sécurité et les directives de la Commission de l'UE avant d'utiliser cette substance.
   3. Rinçage 3 x 30 min avec du PBS, puis avec du PB (tampon phosphate, afin d'éviter la formation de cristaux à la surface de la tranche).
3. Monter les tranches sur des lames de verre standard. Couvrir les tranches soigneusement avec un milieu d'enrobage. Éviter les bulles d'air dans le milieu d'enrobage. Mettez la lamelle en douceur afin de couvrir complètement la tranche. Sécher à l'air les lames pendant une nuit avant de les visualiser avec un microscope.
4. Rangez les tranches marquées à 4 ° C après la visualisation. Astuces utiles sur les procédures histochimiques sont en Refs. ^58,59.
5. Nettoyer l'équipement utilisé pour l'histologie et l'électrophysiologie séparément. Ne pas mélanger l'histologie et de l'équipement d'électrophysiologie ensemble.

Visualisation 7. Post Hoc de Neurones biocytine remplis

1. Utilisez un microscope confocal pour visualiser la morphologie des neurones récupérés.
   1. Environ localiser le neurone marqué par fluorescence dans la tranche avec épifluorescence. Examiner l'arbre dendritique des neurones et de localiser l'axone et bleb axonal (2-4 pm Ø) en utilisant un objectif 10x ou 20x. Le document au cours de l'axone.
   2. Passer au microscope confocal et choisir la diode laser 488 nm pour exciter la fluorescéine contenue dans le neurone marqué. Suivre l'extension de l'axone et les dendrites dans l'axe z.
   3. Enregistrer des images successives afin d'obtenir un z-pile pour la cellule entière. Ajuster la résolution de l'axe z (distance entre les images consécutives) de 0,5 à 1 um. Collecter des images confocale d'un usin cellulaireg faible (objectif 10X) et haute (objectif 60X, immersion dans l'huile) grossissement.
   4. Ouvrez le fichier image du neurone obtenu avec le microscope confocal avec un logiciel d'imagerie (ImageJ) ^60. Comparez l'image z-projection avec une image IR-DGC par oeil pour localiser la position précise des pipettes de patch pendant l'enregistrement électrophysiologique (figures 1, 2A, 3A, 4A, 5A et 5E).
   5. Déterminer morphometries de neurones marqués: mesurer l'axone - distance de soma, les distances entre les pipettes d'enregistrement le long du domaine somato et entre la pipette dendritique et axone en utilisant la fonction "Mesure" dans ImageJ.
   6. Reconstruire certains neurones avec NeuronJ (ImageJ), Imaris ²⁹ ou Neuromantic ^61.

8. Analyse des données électrophysiologiques

1. Utilisez le logiciel associé à l'amplificateur pour analyser grossièrement les données (par exemple, Clampfit) ou directement und' autres logiciels pour l' analyse des données telles que Stimfit, un logiciel open source ^62,63 comme dans notre récente publication ¹³ ou par exemple WinWCP.

Résultats

Le protocole décrit ci-dessus a l'intention de faciliter la collecte de données à l'aide des enregistrements de patch-clamp dendritiques. Cette technique, combinée avec histochimie post hoc, aide à mieux comprendre les mécanismes de nombreux signaux électriques originaires ou étalement en dendrites. Accès direct aux dendrites avec des pipettes de patch est difficile, mais une attention particulière à plusieurs aspects méthodologiques permettra d'améliorer le taux des enregistrements de succès. Un expérimentateur suffisamment d'expérience dans l'enregistrement somatique stable peut espérer obtenir une résistance élevée (GQ) joints d'étanchéité et des expériences complètes sur la plupart des tentatives. Un à deux enregistrements dendritiques de haute qualité peuvent être collectées par dissection.

La disponibilité des tranches de cerveau de haute qualité contenant soma et les dendrites en bonne santé est une condition préalable à l' accès à ces structures fines (figure 1). Le criteriun pour la sélection de ces neurones sont une surface lisse et homogène partout dans la cellule et un soma et les dendrites avec un faible contraste lorsqu'ils sont observés avec optimaux ajustés optique (figure 1A et 1B). Neurones Sélection trop fortement contrastés généralement conduit à des enregistrements instables (Figure 1C et 1C). Par conséquent, ces neurones doivent être évités.

Comparativement à d'autres neurones, les neurones dopaminergiques de la substance noire présentent des caractéristiques morphologiques et électrophysiologiques spécifiques. Ces caractéristiques habituellement évalués avec une seule pipette somatique peuvent également être observés dans deux somatique (Figure 2) et les enregistrements somatodendritiques (figure 3). De longues injections de courant hyperpolarisants induisent une rectification potentiel de membrane appelée «affaissement» (figures 2B et 5D). L'axone est originaire, dans la plupart des cas, sur un site dendritique identifiésen utilisant des critères complémentaires ^13,25,26, ce qui indique que le compartiment dendritique dans ces neurones est hétérogène (figure 3A - 3B). En conséquence, le compartiment où l'AP est d' abord observé correspond au compartiment dans lequel débouche l'axone (figure 3C - 3D) ^13,25,26. L'axone est généralement terminée par un bleb axonale causée par une coupure de l'axone pendant la coupe ^64, mais cette structure ne soit pas systématiquement détectée.

L'enfoncement prononcé observé dans les neurones DA nigraux consécutive à l'activation de I _h suggère une forte expression de sous - unités HCN. Pour déterminer l'influence de I _h sur l'intégration des signaux synaptiques, (RPEC) des formes d' onde de courant synaptiques-like ont été générées et injectés par l'électrode d'enregistrement dendritique pendant somatodendritiques deux enregistrements ⁵⁵ ( Figure 4). La cinétique de ces EPSCs simulées ont été basées sur les constantes de temps de montée et de déclin de réelles EPSCs spontanées. Le aEPSP résultant a été enregistré avec l'électrode somatique. Application du bain _Ih bloqueur ZD 7288 a augmenté la durée de la aEPSP, ce qui indique la contribution de I _h au cours du temps de signaux synaptiques (figure 4B). ZD 7288 abolit également la membrane de rectification potentiel confirmant que les résultats de l' affaissement de l'activation de _lh (figure 4C). Les résultats obtenus avec EPSP simulés peuvent être corrélés à des expériences utilisant des EPSP évoqués électriquement ^65. Pour cartographier la répartition précise du canal dans le domaine somato des neurones dopaminergiques, des enregistrements attachés cellules ont été mises en œuvre (Figure 5). Un joint d' étanchéité à haute résistance (>> 1 GQ) est une nécessité absolue pour les enregistrements attachés aux cellules (figure 5B I _h active lentement avec de longues étapes de tension hyperpolarisants et l'état d' équilibre est atteint en cours après des centaines de ms (Figure 5C), comme indiqué précédemment ^66. Cette observation indique que les canaux HCN exprimés dans les dendrites des neurones dopaminergiques ont différentes sous - unités par rapport à ceux dans les neurones pyramidaux ou d' autres types de cellules ^10,16,66. Que la distribution de la chaîne peut être non homogène dans le compartiment dendritique et le compartiment dendritique est lui-même hétérogène, l'identité de la dendrite (Axon porteurs ou nonaxon portant dendrites) est révélée en comparant l'image IR DGC avec l'image confocale après coloration biocytin (Figure 3A et B). La récupération de la morphologie des cellules est donc nécessaire que les deux enregistrements somatodendritiques double et pour les enregistrements attachés aux cellules via des enregistrements entiers de cellules somatiques ultérieures.

Figure 1. Visualiser le Soma et proximal dendrites de nigrales Neurones Dopaminergiques Utilisation de l' infrarouge vidéomicroscopie. (A) IR-DGC image d'un neurone DA nigral montrant le soma et dendrites proximale et les deux pipettes somatiques et dendritiques. Un enregistrement somato double a été réalisée avec succès sur ce neurone sain. Observer le faible contraste et la surface lisse dans le domaine somato de la cellule. (B) Un autre exemple d'un DA neurone sain. (C) DA neurone avec une surface plus rugueuse et inégale et un contraste plus fort. Alors qu'un double enregistrement a été obtenu, la stabilité était suboptimale, et la durée d'enregistrement est courte (~ 15 min) en raison d'une augmentation progressive de la résistance d'accès aux deux pipettes. (D) Deuxième exemple d'un neurone DA montrant un fort contraste soma et dendrites proximale. Dans ce cas, on a observé peu de temps après la pause en mode cellule entière une forte augmentation de la résistance d'accès. Une tentative pour diminuer la résistance d'accès par pression négative a échoué. Neurones dans le panneau C et D pourraient avoir été endommagés lors de la procédure de tranchage et doivent être évités pour des expériences. (E) simultanée de l' enregistrement à double somatique dans un neurone sain DA au début de l'enregistrement. (F) Même neurone que dans le panneau E avec un corps de cellule gonflée après environ 17 min. Notez l'absence complète de contraste, l'apparence de boule du soma et la présence du gros noyau qui ne sont pas apparents dans les neurones sains. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. simultanée Double Somatic Enregistrement à partir d' un DA Neuron. (A) IR-DGC image pendant l' enregistrement double somatique d'un neurone de DA. (B) hyperpolarisant et dépolarisants longues injections actuelles de 1 (-160 à 80 pA, incrémenter 80 pA) et variations de tension correspondantes enregistrées simultanément avec les deux pipettes de patch. Notez la présence de l'affaissement dans la trace de tension avec la longue étape en cours hyperpolarisant et le grand après-hyperpolarisation après l'AP lors de l'impulsion de courant de dépolarisation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Enregistrement omatodendritic de double dans un DA Neuron. (A) d'image IR-DGC d'un neurone DA. La distance entre le dendritique et somaPipette tic est de 29 um d' image (B) . confocale z projection du neurone dans le panneau A marquée avec de l' avidine conjuguée à de l' isothiocyanate de fluorescéine (FITC). Le neurone a été rempli avec biocytin pendant l'enregistrement. L'axone est issue d'une dendrite proximale proche du soma comme indiqué par la flèche. (C) à double enregistrement somato de tension de cellule entière simultanée du neurone dans le panneau A. AP enregistré dans le soma (traces de tension noir) et dendrites (tension rouge traces) en réponse à longue étape d'injection de courant d'un 1 via le somatique (gauche, trace actuelle noir) et pipette alternativement dendritique ( à droite, trace actuelle rouge) (D) somatique et AP dendritique représentés à l' échelle de temps dilatée.. Avec soit somatique ou l'injection de courant dendritique, l'AP somatique (noir) a précédé l'AP dendritiques (rouge). Le délai entre les points d'accès dans ce neurone était de 120 ms et 210 ms avec somatique et injection de courant dendritique, respectivement. Les retardsont été mesurées à l'AP amplitude demi-maximale pendant la phase ascendante de l'AP. L'AP est d' abord observé dans le compartiment à proximité de laquelle l'axone émerge, qui confirme les observations précédentes ^25,26. Dans ce cas, l'enregistrement dendritique est faite à partir d'un dendrite axone-défaut. Un exemple d'un enregistrement à partir d' un dendrite axone portant est dans la réf. ¹³ (dans leur Fig. 1). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Propagation de EPSP artificielles le long de la somato Axe du DA Neurones. (A) d'image IR-DGC d'un neurone DA. La distance entre la pipette et somatique dendritique est de 45 um. Les deux pipettes de patch sont dans le mode d' enregistrement de cellules entières de courant de serrage (B) . Courantenregistré avec la pipette dendritique dans le courant de serrage et utilisé pour générer le EPSP artificiel (en haut). Le courant est obtenue par l'injection d'une forme d' onde RPEC-like (T pour _hauteur = 0,6 ms; T pour _{décroissance} = 3 ms; amplitude = 100 pA) via la pipette d'enregistrement dendritique ^55. Au fond, aEPSPs enregistrées au soma dans le contrôle des conditions (noir) propagé et après l'application de bain de la ZD7288 I _h de blocage (30 uM; trace rouge). Chaque trace de tension est la moyenne de 40 balayages simples. Observez la grande augmentation de la durée EPSP en présence d'ZD7288 indiquant la contribution de I _h au cours du temps de EPSP. (C) Tension traces enregistrées à partir du soma dans des conditions de contrôle (noir) et après l'application de 30 uM ZD 7288 ( rouge) en réponse à une longueur (30 uA, 1 s) étape en cours d'hyperpolarisation. Noter l'absence du potentiel de membrane de rectification (affaissement) après le blocage de I _{h. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.}

Figure 5. Présence de I _h en dendrites de DA Neuron. (A) IR-DGC image d'un neurone DA et la pipette sur dendrites proximale. (B) courants capacitifs et fuite au cours d' une commande mV 5 de tension dans la configuration cellule attachée. La résistance d'étanchéité est de 5 GQ dans cet exemple , l' étape (C) de la tension d' hyperpolarisation. (90 mV en haut) à partir d' un potentiel de membrane de 0 mV a provoqué une activation lente I _h. La trace actuelle a été inversée et équipée d'une fonction exponentielle unique donnant une constante de temps t = 632 ms. (D) Tensionles réponses de l'ensemble des cellules soma enregistrées (panneau A) à 1 s hyper- et dépolarisants impulsions de courant (-160 à 120 pA, 40 pA incrémentation). L'enregistrement de cellules entières somatiques a été réalisée après l'enregistrement cellule attachée. Noter l'absence de points d' accès en raison de l'application extracellulaire de TTX et Cd ²⁺ pour supprimer la décharge spontanée pendant l' enregistrement cellule attachée. Ces voltage-dépendants Na ⁺ et Ca ²⁺ bloquants actuels ont été ajoutés pour supprimer les courants d'action. Panneaux A - D sont issus du même neurone (E) , l' image infrarouge DIC d'un autre neurone de la DA et une pipette dendritique courants (F) dépendant de la tension activé par une impulsion de test à 0 mV à partir d' une pré - impulsion de 50 ms à -120 mV.. dans un patch outside-out excisé de la dendrite proximale du neurone dans le panneau E. Tenir potentiel -80 mV. Notez l'inactivation dépendant du temps du courant. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grandeversion de ce chiffre.

Substance	g / mol	La concentration	pour 1 L
NaCl	58,443	125 mM	7.305 g
NaHCO3	84,007	25 mM,	2.100 g
KCl	74,551	2,5 mM	0,186 g
NaH 2 PO 4	137,99	1,25 mM	0,172 g
glucose	198.17	25 mM,	4,95 g
MgCl2	1 M (solution)	1 mM	1 ml
CaCl2	1 M (solution)	2 mM	2 ml
Osmolarité: ~ 310 mOsmol / L (plage optimale: 314-325 mOsmol / l), pH = 7,4

Tableau 1: liquide céphalo - rachidien artificiel (ACSF).

Substance	g / mol	La concentration	pour 1 L
NaCl	58,443	87 mM,	5.084 g
NaHCO3	84,007	25 mM,	2,1001 g
KCl	7.551	2,5 mM	0,18637 g
NaH 2 PO 4	137,99	1,25 mM	0,17248 g
MgCl2	1 M (solution)	7 mM	7 ml
glucose	198.17	10 mM,	1,9817 g
saccharose	342,29	75 mM	25,672 g
CaCl2	1 M (solution)	0,5 mM	0,5 ml
Osmolarité: ~ 326 mOsmol / l, pH = 7,4

Tableau 2: sucrose-ACSF pour préparer des tranches.

Substance	g / mol	La concentration	pour 100 ml
KMeSO 4	150,2	120 mM	1,8024 g
KCl	74.56	20 mM,	0,14912 g
MgCl2	1 M (solution)	2 mM	200 ul
Na 2 ATP	551.1	2 mM	0,1102 g
Na 2 GTP	523,2	0,5 mM	0,02661 g
Na 2 -Phosphocreatine	255,1	5 mM	0,1275 g
EGTA	380,4	0,1 mM	3.803 mg
Hepes	238,31	10 mM,	0,23831 g
biocytine	1 mg / mL		0,1 g
Osmolarité: ~ 302 mOsmol / l, pH = 7,2 ajusté avec du KOH

Tableau 3: solution intracellulaire pour deux enregistrements.

Substance	g / mol	La concentration	100mL
KCl	74.56	120 mM	0.8947 g
CaCl2	1 M (solution)	2 mM	200 ul
MgCl2	1 M (solution)	1 mM	100 ul
Hepes	238,31	10 mM,	0,23831
TEA-Cl	165,7	20 mM,	0,3314 g
4-AP	94.11	5 mM	0,04705 g
BaCl2	244.26	1 mM	0,02443 g
CdCl2	183,32	0,02 mM	0.3666 mg
TTX	1 mM	200 nm	20 ul
Osmolarité: ~ 290 mOsmol / L, ajusté avec D-glucose (Ref 16.); pH = 7,4

Tableau 4: solution Electrode pour les enregistrements attachés aux cellules.

Discussion

Ce rapport décrit un protocole étape par étape pour mettre en œuvre deux enregistrements de cellules entières somatodendritiques et enregistrements dendritiques locaux. Il est utile pour déterminer l'influence des canaux ioniques ( par exemple, I _h) sur le décours temporel des potentiels post - synaptiques et la cartographie de la répartition du canal ionique (I _h) le long du domaine somato des neurones dopaminergiques de la substance noire, respectivement. Résultant des mesures électrophysiologiques sont combinés pour poster histochimie hoc pour récupérer la morphologie des cellules. La procédure a été utilisée pour étudier les neurones dopaminergiques situés dans la substantia nigra, mais peut être généralisé pour les neurones voisins nigrales GABA, aire tegmentale ventrale neurones DA ou d'autres neurones du mésencéphale. Toutes les étapes peuvent également être suivies pour examiner d' autres canaux ioniques exprimés dans les dendrites des neurones de la substance noire , sans modifications importantes. Visualisation post hoc est particulièrement pertinente pour les neurones avec axone portantdendrites, tels que les neurones de la substance noire ^25,26, hippocampiques interneurones oriens-alveus ²¹ ou certains neurones pyramidaux CA1 ^67. Fait intéressant, les neurones partageant cette caractéristique semble être plus fréquente qu'on ne le pensait généralement ^67. L'analyse morphologique révèle aussi la position précise des électrodes et axone. La détection de ce dernier peut être optimisée par le marquage des protéines exprimées dans le segment initial de l' axone (canaux voltage-gated Na ⁺ ou ankyrine G) en utilisant l' immunohistochimie ^68,69.

La fiabilité des données recueillies avec des enregistrements dendritiques et l'étiquetage neuronale ultérieure dépend toujours de la qualité de coupe. par conséquent, l'effort maximum a besoin d'être appliqué à préserver la viabilité des cellules dans le tissu. Ceci est réalisé avec une manipulation douce des animaux sains, des outils et des réactifs de haute qualité, une oxygénation suffisante des températures de tissus et de glace-froid tout au long de la préparation de tranches. des conditions d'enregistrement stables reposent sur la sélection des neurones sains. Dans le mode de cellule entière, la résistance série doit initialement être aussi faible que possible et maintenue constante pendant toute l'expérience. La stabilité des enregistrements dépend en outre des manipulateurs de haute qualité dépourvus de dérive et les vibrations. Ces perturbations peuvent être réduites par l'optimisation de la stabilité de la pipette: vérifier la connexion au porte-pipette et headstage, en contrôlant que les câbles sont micromanipulateur mou, évitant ainsi des changements soudains de température ou de mouvement de la scène et le contrôle du mécanisme du manipulateur. Pour deux enregistrements, méthylsulfate ^13,15,21 a été inclus dans la solution intracellulaire, mais gluconate ^9,14,25 peut aussi être employé. Cependant, l'anion principal peut modifier le potentiel de membrane et ^70,71 des courants dépendant de la tension ^72. Solution intracellulaire peut être complétée avec de l'ATP, GTP et de préserver la phosphocréatine physiologiques fonctions des neurones. En outre, l' ajout d' un colorant fluorescent dans la solution de pipette (par exemple, Alexa 594 , ou sulforhodamine 101 ⁴¹⁾ pour visualiser les dendrites lors d' un enregistrement somatique peut être utile , par exemple , de placer une application de pression (figure 7 dans la réf. ⁴¹⁾ ou une stimulation électrique pipette. La solution de la pipette pour l' enregistrement cellule attachée contient une concentration élevée en K ⁺ et sans Na ⁺ pour enregistrer un grand I _h. Il convient de noter le rapport Na ⁺ / K ⁺ de concentration influe sur l'amplitude de courant ^10, le potentiel d'inversion du courant ¹¹ et de l'ouverture de porte de ⁷³ I _h. Alternativement, I _h peuvent également être enregistrées à l' aide à l' extérieur-outs ^10. Dans cette configuration d'enregistrement cependant, le milieu intracellulaire dans la proximité des canaux peut être perturbée. Par conséquent, les différences de l'activation dépendant de la tension de I _{h est observée lorsque les courants de comparaison obtenus en utilisant des correctifs attachés aux cellules et à l' extérieur-outs ^10. Gonflement des neurones est parfois rencontré pendant l' enregistrement patch-clamp, et résulte souvent de causes distinctes telles que la faible qualité de l'eau, fort déséquilibre de l'osmolarité ou le pH entre les solutions ³⁹ ou des erreurs intra- et extracellulaire dans la composition des solutions. La qualité des enregistrements électrophysiologiques a une incidence directe sur la qualité de la morphologie des neurones récupérés. Pipette à haute résistance somatiques sont utilisés pour les enregistrements doubles (6 - 10 MQ, comme dans les références ^6,11.) Et pour les enregistrements somatiques isolés après des enregistrements attachés aux cellules afin de minimiser la dilution du milieu intracellulaire ^14. L'enregistrement somatique de cellules entières après l'enregistrement cellule attachée est donc maintenu court (<10 min). Outside-out patches à la fois du somatiques et dendritiques pipettes sont essentiels pour la bonne fermeture de la cell membrane et la récupération subséquente de la morphologie cellulaire. En plus de la structure de la cellule, le contenu neurochimique peut être déterminé pour les neurones enregistrés ^59,74. Par exemple, la protéine tyrosine hydroxylase intracellulaire peut être immunomarquées pour l' identification univoque des neurones dopaminergiques ^13.}

Neurones dopaminergiques sont principalement concentrés dans le SN pars compacta, avec une densité beaucoup plus faible présente dans le SN pars reticulata, où ils sont mélangés avec un plus grand nombre de neurones GABA ^75. Tandis que le corps cellulaire des neurones dopaminergiques est souvent supérieure à celle des neurones GABA, l'identification visuelle de ces cellules avec l'IR-vidéomicroscopie est incertain et partiellement entravé par l'opacité des pars compacta. Afin de contourner ces limitations, la pré-sélection des neurones dopaminergiques peut être facilitée par l'utilisation de souris transgéniques exprimant un marqueur fluorescent dans une population spécifique de neurones (TH ⁶⁵ ou DAT pour les neurones dopaminergiques, GADpour les neurones GABA) et l'éclairage du épifluorescence. En variante, un colorant fluorescent peut être inclus dans la solution de l'électrode somatique pour faciliter la visualisation des dendrites. Augmentation de la résolution de la cellule fluorescente est amené par Nipkow disque rotatif confocal ^14,22,30 ou microscopie à deux photons ⁷ combinée à l' IR-DGC ^6. Plusieurs avantages sont liés à DGC par rapport à une CIVD. Tout d' abord, sous forme de prismes DIC ne sont pas nécessaires, l'image IR-DGC peut être recouverte d'une ^49,52,53,76 d'image de fluorescence. Deuxièmement, DGC peut être combiné avec photostimulation et optogénétique ^77.

Un inconvénient de la préparation de tranche est la préservation de l'intégrité des neurones. DA neurones étendent leurs dendrites dans les trois plans de l' espace ^78,79 et donc troncature du compartiment dendritique ne peuvent pas être complètement évités en tranches ^80. Le choix de l'orientation des tranches (coronale, horizontal ou parasagittal) est un compromis. L'origine de l'innervation et la conception expérimentale doit être considérée pour sélectionner la bonne orientation des tranches.

rapiéçage dendritique directe est la technique utilisée pour cartographier la répartition des canaux ioniques fonctionnels dans les différents compartiments de cellules. En outre, cette technique permet de déterminer la variabilité des propriétés fonctionnelles des canaux ^20. En complément de l'emplacement et de la densité des canaux ioniques peuvent être déterminés par immunohistochimie à la lumière et microscopie électronique à des niveaux ^17,23. Cette approche offre également la possibilité de déterminer la densité de canal dans les petites structures de calibre qui sont inaccessibles aux pipettes de patch. Cependant , ces canaux peuvent être dans un état fonctionnel distinct ²⁴ ou même inactifs par rapport à ceux enregistrés en utilisant des techniques de patch-clamp. Les deux techniques sont donc nécessaires pour obtenir une image complète de l'emplacement et les propriétés decanaux ioniques dans une région cellulaire spécifique ^17. Avec le développement des colorants sensibles à la tension, l' imagerie de tension a été utilisée pour examiner la propagation des PA et des EPSP dans les neurones à plusieurs endroits ^81. Comme une alternative à deux enregistrements de patch-clamp, cette approche peut même être mis en œuvre pour dendrites minces qui ne sont pas accessibles aux pipettes de patch, mais nécessitent un étalonnage précis du signal et la moyenne.

Alors que les neurones dopaminergiques dans le SN et l'aire tegmentale ventrale sont largement étudiés par l'intermédiaire des enregistrements somatiques dans le contexte physiologique et physiopathologique, les propriétés fonctionnelles de leurs dendrites reste largement inconnue dans les deux conditions. Patcher de dendrites a été mis en place pour les neurones dopaminergiques de la substance noire par plusieurs groupes avec succès ^13,25,26 et reste la méthode de choix pour disséquer les propriétés excitables de ces structures subcellulaires fines ^8. les enregistrements fournissent une nouvelle dendritique Opportunité de scruter l'efficacité et la plasticité de la transmission synaptique et la plasticité de l' excitabilité dendritique ^82,83.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Eau bidistillée	Millipore	Super Q	Résistivité >14 M&Omega ; cm, idéale 18,2 M&Omega ; cm à 25  ; ° ; C, filtré (0,22 & micro ; m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
Bougies microfiltres	Robu	Porosité 3, 6 mm ou 13 mm de diamètre
Trancheuse à tissus avec vibrosonde	Leica	VT1200	Paramètres de coupe : vitesse 0,07, amplitude 1,40
Trancheuse à tissus	Dosaka	DTK-1000	Paramètres de coupe : vitesse 4, fréquence 7
Lames de rasoir	Gilette	Super Silver
Outils de dissection	Braun, Aesculap
Chambre de réserve			Beckers
en PP	VWR	213-1725	400 ml
Filtre à seringue	Merk Millipore	Millex - GV 0.22 µ ; m
Colle cyanoacrylate  ;	UHU"	Sekunden Kleber"	liquide
Chambre d’enregistrement  ;	Luigs & Neumann	Slice mini chambre
Extracteur de pipette horizontal	Sutter Instruments	Brown-Flaming P-97
Pipettes	Hilgenberg	1807524	2 mm d.a./1 mm d.i. caporités en verre, extrémités polies au feu, lavées
Cire dentaire	Coltè ; Plateau orthodontique ne/Whaledent		Bandes de cire Grille
		platine	pour ancrer les tranches dans la chambre d’enregistrement, fabriquée sur mesure avec un disque de platine
Microforge	Narishige	MF-830	pour polir au feu les pointes de pipette
Sulfate de méthyle de potassium	MP Biomedicals	215481
Biocytine	Sondes moléculaires	B1592
Manomètre	GREISINGER électronique	GDH 13 AN
Microscope	Zeiss	FS
Dodt Gradient Contrast	Luigs & Manipulateurs Neumann
	Luigs & Neumann	LN Mini 25
Frame grabber	La source d’imagerie	Caméra DFG/USB2pro
	DAGE-MTI	NC-70
Condenseur	Zeiss		grande ouverture numérique Condenseur fonctionnant à l’huile
Objectif	Zeiss	W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR	63X Grossissement, longue distance, grande ouverture numérique 1.0 immersion dans l’eau objectif
Quadruple changeur	Luigs & Neumann		entre la caméra et le microscope
Moniteur vidéo noir et blanc	Sony	SSM-175CE	16 pouces, 850 lignes TV,
flacons d’échantillons analogiques, verre ambré, avec capuchon	VWR	215-2409	pour transférer les tranches de la configuration à la salle d’histologie
The Axon Guide	Molecular Devices		Book
Stimfit	https://github.com/neurodroid/stimfit		Analyse des données électrophysiologiques
Paraformaldéhyde	Sigma	441244	voir FICHE DE DONNÉES DE SÉCURITÉ et Directive sur les substances dangereuses (UE) avant utilisation
Plaque de culture cellulaire bien	Greiner-Bio-One	662160	pour la coloration des coupes fixes
Triton X-100	Merk	108643	voir FICHE DE DONNÉES DE SÉCURITÉ et Directive sur les substances dangereuses (UE) avant utilisation
souris anti-TH monoclonal primaire	Immunostar	22941	concentration de travail : 1/1 000
chèvre anticorps secondaire anti-souris - Alexa Fluor 568	Invitrogen - Thermo Fisher Scientific	A-11031	concentration de travail : 1/500
Sérum de chèvre normal	Dako	X0907
Sondes moléculaires anti-effacement ProLong Diamond	- Thermo Fisher Scientific	P36961
Fluorescéine Avidin DCS	Vector Lab	A-2011
Microscope confocal	Olympus	FV1000
ImageJ	http://imagej.nih.gov/ij/
NeuronJ	http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/		plugin pour ImageJ
Imaris	http://www.bitplane.com		Reconstruction de neurones remplis de biocytine
Neuromantic	http://www.reading.ac.uk/neuromantic/		Reconstruction de neurones remplis de biocytine
WinWCP	http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm		Analyse de données électrophysiologiques