génotypage des<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; par Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Résumé

Ici, la PCR d’espacement ribosomique (RS-PCR) est utilisée avec un système d’électrophorèse miniaturisé comme méthode rapide et à haute résolution pour le génotypage de S. aureus à des coûts modérés permettant un débit élevé.

Résumé

La PCR de l’espaceur ribosomique (RS-PCR) est une méthode de génotypage très résolue et robuste pour S. aureus qui permet un débit élevé à des coûts modérés et qui est donc adaptée à une utilisation de routine. Pour une résolution, une évaluation et une gestion des données optimales, un système d’électrophorèse miniaturisé est nécessaire. Avec un tel système d’électrophorèse et le logiciel développé en interne (disponible gratuitement ici), l’attribution du motif des bandes à un génotype est standardisée et simple. L’extraction de l’ADN est simple (préparation à l’ébullition), la configuration des réactions est facile et elles peuvent être exécutées sur n’importe quelle machine PCR standard. Les cycles PCR sont courants, à l’exception des temps de rampe et d’allongement prolongés. Par rapport au typage spa et au typage multi-locus (MLST), la RS-PCR ne nécessite pas de séquençage de l’ADN, ce qui simplifie considérablement l’analyse et permet un débit élevé. De plus, la résolution pour les souches bovines de S. aureus est au moins aussi bonne que le typage spa et meilleure que la MLST ou l’électrophorèse sur gel en champ pulsé (ECP). La base de données RS-PCR comprend actuellement un total de 141 génotypes et variants. La méthode est fortement associée au profil génétique de virulence, à la contagiosité et à la pathogénicité des souches de S. aureus impliquées dans la mammite bovine. Le génotype B de S. aureus (GTB) est contagieux et cause des problèmes de troupeaux entraînant des coûts importants en Suisse et dans d’autres pays européens. Tous les autres génotypes observés en Suisse infectent des vaches et des quartiers. Le génotypage par RS-PCR permet de prédire de manière fiable le potentiel épidémiologique et pathogène de S. aureus impliqué dans l’infection intramammaire bovine (IMI), deux facteurs clés pour la médecine vétérinaire clinique. En raison de ces propriétés bénéfiques, associées à des coûts modérés et à un débit d’échantillons élevé, l’objectif de cette publication est de fournir un protocole détaillé, étape par étape, pour établir et exécuter facilement la RS-PCR pour le génotypage de S. aureus dans d’autres laboratoires.

Introduction

Staphylocoques (S. aureus) est connu comme le pathogène le plus important dans le monde responsable de l' infection intra - mammaire (IMI) chez les bovins ^1. L'étude menée par Fournier et al. ² démontré chez les vaches suisses, les études réalisées par Cosandey et al. ³ et Boss et al. ⁴ vaches de 12 pays européens que S. aureus isolé de bovin IMI est un groupe génétiquement hétérogène. Par amplification par PCR de la région d'espaceur intergénique 16S-23S ARNr (RS-PCR), un total de 17 génotypes ont été initialement détecté dans 101 isolats épidémiologiquement indépendants ^2. Génotype B et le génotype C (GTC) étaient les plus fréquentes (80%), tandis que les 15 autres génotypes (SMT) se sont produits rarement, chaque prise de 1 à 4% de tous les isolats. Au niveau européen ^3, GTB, GTC, GTF, GTI et GTR étaient les génotypes les plus importants , comprenant 76% de toutes les souches analysées (n = 456). GTB était situé en Europe centrale wconsidérant que les autres génotypes ont été largement diffusés. Les 24% restants des souches inclus 41 génotypes, beaucoup d'entre eux, cependant, ont été observés une seule fois.

Les études menées par Fournier et al. ^2, Cosandey et al. ^3, et Graber et al. ⁵ ont démontré en outre que les génotypes étaient fortement associés à leur modèle de gène de virulence, ainsi que le suisse au niveau européen. Les autres études ont révélé des différences massives dans la prévalence IMI chez S. aureus GTB, GTC et les autres génotypes ^2,5: compte tenu de GTB, jusqu'à 87% des vaches dans un troupeau ont été infectées par ce génotype. Dans le cas du GTC et des autres génotypes, cependant, l'IMI a été trouvé que dans 1 à 2 vaches d'un troupeau.

IMI causée par S. aureus, se traduit normalement par une inflammation des glandes mammaires correspondant et une augmentation des cellules inflammatoires dans le lait. En conséquence, la coopération de cellules somatiquesunts dans le lait (SCC), l'indicateur clé de la qualité du lait dans la plupart des pays, est augmenté conduisant à un prix du lait a diminué ou même l'arrêt de la livraison.

En plus de l'interface RS-PCR de Fournier et al. ^2, d' autres méthodes de typage ont été décrites pour le sous - typage des souches bovines de S. aureus ^8-11. Deux plus communs comprennent le typage spa ¹² et Multi Locus Sequence Typing (MLST) ^13. L'ancien est basée sur le séquençage d' ADN de la région d'espacement variable du gène codant spa pour la protéine A staphylococcique, alors que celui - ci nécessite une séquencement de 7 gènes de ménage. Cela signifie qu'un ¹² et ¹³ sept PCR, respectivement, doivent être réalisées, suivies d' une purification de l' amplicon, une réaction de séquençage et l' analyse en utilisant un équipement spécifique. Par rapport à RS-PCR, ces méthodes nécessitent un effort supplémentaire considérable dans le laboratoire résultant en un débit d'échantillons faibles et des coûts élevés. lele débit est particulièrement faible pour les ECP. Compte tenu de la résolution de ces méthodes pour les souches bovines de S. aureus, RS-PCR est au moins aussi bon que spa tapant ⁴ et mieux que MLST ⁴ ou ECP ^15.

Toutes ces méthodes , y compris la dactylographie binaire ¹³ ont démontré leur efficacité dans l' obtention d' un éclairage supplémentaire sur la pathogenèse de bovins IMI causée par S. aureus, mais à cause des restrictions mentionnées ils sont moins appropriés pour les grandes investigations cliniques. En outre, le génotypage par RS-PCR comme décrit par Fournier et al. ² permet la prédiction fiable de l'épidémiologie et le potentiel pathogène de S. aureus impliqué dans l' IMI bovine, deux valeurs clés de la médecine vétérinaire clinique.

Protocole

1. Staphylococcus aureus

1. Étaler 10 pi de S. aureus culture mère ou une colonie cultivée sur un milieu sélectif sur des plaques de gélose Columbia contenant du sang de mouton à 5% (BA).
2. Incuber aérobies à 37 ° C pendant 18 h à 24 h.

2. Extraction de l'ADN

1. Préparer un tampon contenant du Tris TEL-HCl 10 mM et 10 mM de _Na2EDTA, pH 8,5. Préparer des aliquotes et autoclave à 121 ° C pendant 15 min.
2. Collecter une colonie de BA à l'aide d'une anse stérile en matière plastique ou d'un cure-dent en bois stérile et remettre en suspension dans 100 ul TEL. Utiliser 1,5 ml tubes avec bouchons à vis.
3. Incuber à 95 ° C pendant 10 min. Ensuite, placez les échantillons immédiatement sur de la glace.
4. Diluer les échantillons 1: 100 dans H ₂ O approprié pour la PCR (= ADN matrice pour la PCR). Les échantillons non dilués et dilués peuvent être conservés à -20 ° C pendant 1 mois.

3. RS-PCR

1. Pour chaque échantillon , la pipette dans un tube de PCR 1,5 ul de H ₂ O, 12,5 pi de Taq Master Mix, 2 ul G1 amorce 10 pM, 2 ul L1 amorce 10 pM, et 7 ul de l' ADN matrice qui correspond à environ 30 ng de pureté DNA ^2.
2. Exécuter le programme de cyclage suivant dans un thermocycleur standard de PCR: 15 min 95 ° C, suivie par 27 cycles comprenant 94 ° C pendant 1 min, suivie d'une rampe 2 min et recuit à 55 ° C pendant 7 min. Après encore 2 min rampe, étendre à 72 ° C pendant 2 min. Se terminer par PCR par une extension finale à 72 ° C pendant 10 min suivi par un refroidissement à 4 ° C.
   REMARQUE: Les produits de PCR peuvent être conservés à -20 ° C pendant 5 jours.
3. Pour chaque série de RS-PCR comprend un contrôle positif, à savoir, un échantillon avec un génotype connu (normalement GTB), et un contrôle négatif (H ₂ O).

4. Electrophorèse

1. Utilisez un kit commercial d'électrophorèse miniaturisé pour l'ADN (kit MED) ensembleavec un Bioanalyseur connecté à un PC et le logiciel installé. Étudier les manuels correspondants du fabricant avec soin.
2. Mettre en place la station d'amorçage de la puce et ajuster le clip de seringue selon le manuel du fabricant.
3. Préparer le mélange gel colorant selon le manuel du fabricant.
4. Chargement du mélange gel-dye (selon le manuel du fabricant).
   1. Equilibrer le mélange gel colorant à la température ambiante pendant 30 min avant utilisation.
   2. Mettez nouvelle puce à ADN sur la station puce d'amorçage. Pipette 9 pi de gel colorant dans le G. bien marqué
   3. Assurez-vous que le piston est positionné à 1 ml, puis fermer la station puce d'amorçage. Appuyez sur le piston jusqu'à ce qu'il soit maintenu par la pince de seringue. Attendre exactement pendant 30 secondes, puis relâchez le clip de la seringue.
   4. Attendre 5 sec. Tirez lentement le piston pour 1 ml poste.
   5. station d'amorçage Open puce et pipette 9 pi de gel colorant dans les deux puits marqués 'G'.
5. Chargement du Marker
   1. Pipette 5 pi de marqueur dans l'ensemble des 12 puits d'échantillon et à bien l'échelle. Ne laissez pas l'un de ces 13 puits vides.
6. Chargement du Ladder et les échantillons.
   1. Pipette 1 pi d'échelle d'ADN pour le bien-marqué du signe de l'échelle.
   2. 1 ul d'échantillon (puits utilisés) ou 1 pi d'eau déminéralisée (puits non utilisés).
   3. Mettre la puce horizontalement dans l'adaptateur et le vortex pendant 1 min à 2400 rpm.
   4. Exécutez la puce dans le Bioanalyseur à moins de 5 min.
7. Exécution de l'analyse
   1. Démarrez le Bioanalyseur et l'ordinateur connecté. Ouvrez le logiciel.
   2. Ouvrez le couvercle du Bioanalyseur et placez la puce dans le support de puce (la puce correspond à une seule façon). Fermez le couvercle avec précaution.
   3. Dans le cadre de l' instrument du logiciel sélectionnez "Electrophoresis"> "ADNdb"> "DNA 7500". Acceptez le préfixe du fichier en cours du logiciel ou de le modifier.
   4. Cliquez sur le bouton de démarrage présente dans le logiciel. Entrez les noms des échantillons dans le logiciel. Lorsque la course à puce est terminée (après environ 30 min) , la Fin du message Run apparaît dans le logiciel de Bioanalyseur.
   5. Retirer la puce et nettoyer les électrodes de la Bioanalyseur selon les instructions du fabricant.

5. Déduire le Génotype du profil Electrophoresis

1. Chargez le logiciel Mahal (logiciel est disponible gratuitement auprès des auteurs).
2. des données de référence à l'importation dans le logiciel Mahal: "Fichier"> "Importer des données de référence"
3. Ouvrez l'électrophorèse exécuter dans le contexte des données du logiciel Bioanalyseur. Sélectionnez un profil d'électrophorèse d'un échantillon.
4. Vérifiez les pics pertinents.
   1. Utilisez le logiciel Mahal pour vérifier les pics pertinents: "Outils"> "Fluorescence moyenne". Insérez dans la boîte "Fluorescence"les valeurs de fluorescence ont indiqué que les unités de fluorescence (FU), car ils peuvent être lus à partir du logiciel bioanalyser. Insérez les 4 (3) pics avec la plus haute fluorescence dans l'ordre croissant et séparés par des virgules. Exemple: 126130132137.
      NOTE: Si tous ces pics FU sont indiqués par le logiciel Bioanalyseur, ils doivent être estimés en les lisant à partir de la parcelle.
5. Appuyez sur le bouton «Calculer». Un pic est pertinent si la fluorescence observée dépasse la valeur indiquée dans la case «hauteur du pic Minimal".
6. Déduire le génotype.
   1. Insérer dans les textbox Mahal "Peaks d'entrée (pb)" les tailles pb de tous les pics pertinents dans l'ordre croissant et séparés par des virgules. Exemple: 440.462.519.579.637.
      NOTE: Si toutes ces dimensions maximales sont indiquées par le logiciel Bioanalyseur, ils doivent être estimés en les lisant à partir de la parcelle.
7. Appuyez sur le bouton «Calculer».
8. Dans la listeboîte, chercher le minimum carré Mahalanobis distance "D2M". Si la valeur de P droit correspondant à il est ≥0.05 alors la probabilité est ≥5% que l'hypothèse nulle H ₀ est rejetée (H _0: l'observé et le profil de référence sont identiques) ce qui signifie que le profil observé est accepté d'être identique à le profil de référence du génotype indiqué.
9. Si D2M est minime , mais le champ de la valeur P correspondant est vide, rejeter H ₀ avec une probabilité <5%.
   NOTE: Cela signifie que les profils sont inégaux bien D2M est minime. Un tel résultat peut résulter de conditions d'électrophorèse non-moyenne.
   1. Pour corriger ces écarts, insérer dans la zone de texte "Observé Peak (pb)" la valeur 395 et appuyez sur le bouton "Calculer". Vérifiez à nouveau pour D2M minimale et une ≥0.05 P de valeur correspondant. En cas d'échec, essayez les valeurs 405, 415, et 425.
      REMARQUE: Parfois, les petites étapes sont encoreindiqué. Si toujours pas réussi, le profil observé est pas présent dans les données de référence, il peut être un nouveau génotype ou variante.
10. Divers Profils
    1. Répéter les étapes 05.06 à 05.09 pour chaque profil d'électrophorèse séparément.

Résultats

Définition d'un génotype et ses variants

Un profil électrophorétique différent dans plus d'une bande de tous les génotypes identifiés est considéré comme un nouveau génotype. Les nouveaux génotypes sont nommés et étendus selon Fournier et al. ⁵ conduisant à des génotypes de la RGT à la GTZ, suivis par les génotypes GTAA à GTAZ et GTBA à GTBZ et GTCA à GTCC à l' heure actuelle. Variation en un gr...

Discussion

L'étape la plus critique de toute la procédure est quand il y a un excès d'ADN dans RS-PCR (> 30 ng pur ADN / dosage) ^2. En général, la résolution d'un profil est optimale si tous ses sommets commencent et se terminent à la ligne de base. Si deux pics sont trop rapprochés, la résolution est incomplète. Dans ces conditions, le logiciel peut conduire à bioanalyser inappropriée identification des pics de telle sorte que l'identification manuelle est nécessaire.

Tou...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tris(hydroxyméthyl)-aminométhane	Merck	1,08382,0500	Mw = 121,14 g/mol
Titriplex III	Merck	1,08418,0250	Mw = 372,24 g/mol ; La substance est équivalente à Na2EDTA· ; 2H2
O Acide chlorhydrique 5 mol/L	Merck	1.09911.0001
Gélose Columbia+5 % de sang de mouton	bioMé ; rieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Bioanalyseur Agilent	G2940CA		Agilent
2100 expert sofware	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix  ;	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinthe		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'Primer
G1	Mycrosinthe		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'

Agilent 2100 Technologies