Transduction-Transplantation Modèle de souris de syndrome myéloprolifératif

Résumé

Ce manuscrit fournit une description de la méthodologie utilisée pour établir des modèles murins de transduction-transplantation. Un compte rendu détaillé est donné des erreurs techniques à éviter lors de la réalisation de greffes de moelle osseuse. Il faut bien comprendre l’importance d’un titre viral élevé, de la transfection/transduction et de l’irradiation.

Résumé

La transduction-transplantation est un moyen rapide et efficace de modéliser les hémopathies malignes humaines chez la souris. Cette technique permet d’exprimer le gène d’intérêt dans les cellules hématopoïétiques et peut être utilisée pour étudier le rôle du gène dans l’hématopoïèse normale et/ou maligne. Ce protocole fournit une description détaillée de la façon d’effectuer une transduction-transplantation en utilisant des mutations de la calréticuline (CALR) récemment identifiées dans le néoplasme myéloprolifératif (NMP) à titre d’exemple. Dans ce protocole, des cellules entières de moelle osseuse provenant de souris donneuses traitées au 5-flurouracil (5-FU) sont transduites avec un rétrovirus codant pour le CALR mutant et transplantées dans des hôtes syngéniques létalement irradiés. Les cellules donneuses exprimant des CALR mutants sont marquées par une protéine fluorescente verte (GFP). Les souris transplantées développent un phénotype MPN comprenant une élévation des plaquettes dans le sang périphérique, une expansion des mégacaryocytes dans la moelle osseuse et une fibrose de la moelle osseuse. Nous fournissons un compte rendu étape par étape de la génération du rétrovirus, du calcul du titre viral, de la transduction de cellules entières de la moelle osseuse et de la transplantation chez des souris receveuses irradiées.

Introduction

Transduction-transplantation est une méthode utile pour modéliser les hémopathies malignes chez les souris. Cette technique a été particulièrement précieux pour l' étude des tumeurs malignes myéloïdes remontant à la première démonstration que l' expression ectopique de BCR-ABL1 pourrait fidèlement récapituler la leucémie myéloïde chronique chez les souris ^1. Cette technique a ensuite facilité l'étude approfondie de JAK2 ^V617F et MPL ^{W515K / L} muté syndrome myéloprolifératif (MPN).

NPP sont un groupe de tumeurs malignes caractérisées par une surproduction de cellules myéloïdes matures et une fib....

Protocole

Cette étude a été approuvée et réalisée conformément aux recommandations formulées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'Université de Californie, Irvine. Toutes les procédures ont été réalisées sous anesthésie à l'isoflurane et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance.

1. Production de retrovirus écotropique

1. Préparer des plasmides de haute qualité avec une concentration d'au moins 1 pg / pl en utilisant soit un kit maxi-prep commerciale ou la purification de chlorure de césium.
   NOTE: notamment un vecteur MSCV squelette codant pour le gène d'intérêt (d....

Résultats

La technique de transduction transplantation se traduit par la reconstitution hématopoïétique des souris receveuses avec des cellules exprimant le gène d'intérêt. La figure 1 montre une vue d' ensemble du modèle de souris transduction transplantation de calréticuline muté NPP. En bref, un retrovirus exprimant CALRwt ou CALRdel52 est utilisé pour infecter des cellules BM à partir d'un donneur de souris C57B / 6. Les cellules transduites sont transplantées dans.......

Discussion

Ce protocole fournit une description détaillée de la façon d'effectuer des greffes de moelle osseuse chez des souris de récapituler une maladie thrombocytémie comme essentielle à la progression de la myélofibrose avec mutation CALRdel52 comme le conducteur de la maladie. transplanter avec succès des cellules exprimant les résultats CALRdel52 une augmentation des plaquettes, l'expansion des mégacaryocytes et la fibrose de la moelle osseuse. Comme greffe de moelle osseuse est un processus en plusieurs étapes, il e.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lignées cellulaires
DMEM	Corning	MT-10-013-CV
Cellules 293T	ATCC	CRL-11268
3T3 cellules	ATCC	CRL-1658
Plasmids
EcoPak, également connu sous le nom de pCL-Eco	Addgene	12371	Des lignées cellulaires d’emballage rétroviral, telles que EcoPack 2-293, peuvent être utilisées à la place du plasmide EcoPak et des cellules 293T standard. D’autres plasmides d’enveloppe et d’emballage du &gamma ;-rétrovirus sont disponibles auprès d’Addgene et d’autres.
MSCV-IRES-GFP (MIG)Addgene		20672	Des plasmides de transfert &gamma ;-rétroviral supplémentaires sont disponibles auprès d’Addgene et d’autres.
Consommables
27 G x 1/2" aiguilles	BD	305620
Sérum fœtal bovin	Corning	MT-35-010-CV
Pénicilline/streptomycine/L-glutamine	Corning	MT-30-009-CI
Trypsine-EDTA (0,05 %)	Corning	MT-25-052-CI	Peut être fait maison
PBS	Corning	MT-21-031-CV
Boîtes de 10 cm	Fisher	172931
tubes coniques de 15 ml	Fisher	12565268
de 60 mm Boîtes	Fisher	150288
en polybrène	Fisher	NC9840454
5-FU	Fisher	A13456-06
100 µ ; Croires à cellules m Fisher		22363549
tubes coniques de 50 ml	Fisher	12565270
à plaque à 6 puits	Fisher	130184
tubes FACS	Fisher	14-959-5
0,45 &mu ; m filtres à seringue	Fisher	0974061B
Opti-MEM	Gibco	31985-070
Tampon ACK	Lonza	10-548E	Peut être fait maison
Souris recombinante IL-3	Peprotech	213-13
Souris recombinante IL-6	Peprotech	216-16
Souris recombinante SCF	Peprotech	250-03
X-tremeGENE 9	Roche	6365809001	Réactif de transfection
1,5 ml tubes à centrifuger	USA Scientific	1615-5500
Equipment
BD Accuri C6
Irradiateur

à rayons X