Article de méthode

Fluorescence-tri cellulaire activé pour la purification de cellules dendritiques plasmacytoïdes de la moelle osseuse de souris

DOI :

10.3791/54641

⸱

4 novembre 2016

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2Flow Cytometry Laboratory, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

Dans cet article

Résumé

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Nous rapportons un protocole utilisant les cellules activées par fluorescence de tri pour isoler les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) avec une grande pureté à partir de la moelle osseuse de souris lupus sujettes à des études fonctionnelles de pDC.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est une technique de purification de populations cellulaires spécifiques basée sur des phénotypes détectés par cytométrie en flux. Cette méthode permet aux chercheurs de mieux comprendre les caractéristiques d’une seule population cellulaire sans l’influence d’autres cellules. Comparé à d’autres méthodes d’enrichissement cellulaire, telles que le tri cellulaire activé magnétiquement (MCS), le FACS est plus flexible et plus précis pour la séparation cellulaire en raison de la capacité de détection du phénotype par cytométrie en flux. De plus, le FACS est généralement capable de séparer plusieurs populations cellulaires simultanément, ce qui améliore l’efficacité et la diversité des expériences. Bien que le FACS présente certaines limites, il a été largement utilisé pour purifier les cellules pour des études fonctionnelles in vitro et in vivo. Ici, nous rapportons un protocole utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence pour isoler une population très rare de cellules immunitaires, des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC), avec une grande pureté de la moelle osseuse de souris sujettes au lupus pour des études fonctionnelles in vitro de pDC.

Introduction

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La séparation efficace d’une population cellulaire de choix par rapport à d’autres cellules permet d’étudier la population qui ne serait peut-être pas possible autrement. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est une méthode permettant d’enrichir une population cellulaire intéressante avec une grande pureté. 1,2 Différents types de cellules expriment généralement des molécules uniques, ou une combinaison unique de plusieurs molécules, sur la membrane plasmique qui peuvent distinguer une population cellulaire d’une autre. Lors de la liaison de ces molécules de surface cellulaire par des anticorps spécifiques conjugués à la fluorescence, une machine de détection appelée cytomètre/trieur en flux est capable d’exciter et de détecter les signaux lumineux de différents colorants fluorescents qui représentent différents marqueurs moléculaires sur les cellules au niveau de la cellule unique. L’information combinée constituée soit de la présence d’un signal lumineux (représentant l’expression positive de la molécule de surface correspondante), soit de l’absence d’un signal lumineux (représentant l’expression négative d’une molécule) définit le phénotype de la cellule. Après être passées à travers le détecteur, les cellules ayant le même phénotype d’intérêt sont détournées vers un tube collecteur désigné en fonction de la charge électrique.

FACS est largement appliqué dans diverses études tant que la population à enrichir est marquée par fluorescence. 3-7 Il a été utilisé pour séparer les bactéries enrobées d’immunoglobulines (Ig)A des bactéries non enrobées d’IgA dans le microbiote intestinal 8 et trier les populations cellulaires génétiquement modifiées exprimant des protéines fluorescentes. 9 Il est important de noter qu’il a la capacité de séparer plus d’une population simultanément, ce qui permet non seulement d’économiser du temps et des réactifs, mais aussi de concevoir des études plus sophistiquées. 10 Cependant, la FACS a aussi ses limites. Si une population d’intérêt est très rare (moins de 1 %), l’efficacité du tri peut être réduite, entraînant une perte de cellules importante. De plus, certaines liaisons d’anticorps peuvent activer la transduction du signal intracellulaire qui induit des changements fonctionnels de la population cellulaire triée. 11 Par conséquent, le phénotype utilisé pour le tri doit être sélectionné avec soin.

D’autres méthodes existent en plus du FACS qui sont également basées sur des marqueurs de surface cellulaire pour l’enrichissement de populations cellulaires spécifiques, comme le tri cellulaire activé magnétiquement (MCS). 12 À l’instar du FACS, les anticorps conjugués aux billes magnétiques peuvent cibler des molécules spécifiques de la surface cellulaire. Lors de l’interaction anticorps-antigène, les cellules recouvertes de billes magnétiques peuvent être séparées des cellules non enrobées après avoir traversé un champ magnétique. Cependant, seul un nombre limité de molécules peut être ciblé dans le MCS, car les billes magnétiques sont, contrairement aux diverses couleurs fluorescentes du FACS, indiscernables. Il est donc difficile pour MCS de définir un phénotype cellulaire avec une combinaison compliquée de marqueurs de surface. 13,14 De plus, le MCS est également capable de provoquer une activation involontaire des cellules cibles.

Dans nos études d’un modèle murin de lupus érythémateux disséminé (LED), 15 nous avions l’intention de purifier les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) pour étudier leurs changements fonctionnels avec la progression de la maladie. Nous avons d’abord utilisé le MCS pour enrichir la pDC de la moelle osseuse en ciblant PDCA-1, une molécule fortement et uniquement exprimée sur la pDC murine à l’état d’équilibre. Cependant, la pureté cellulaire était étonnamment faible, probablement en raison de la régulation positive de PDCA-1 sur d’autres populations cellulaires dans un environnement inflammatoire tel que le LED. 16 En fin de compte, nous avons utilisé FACS avec une combinaison de quatre marqueurs de surface (CD11c, CD11b, B220 et PDCA-1) pour séparer les pDC de haute pureté en tant que population CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+. Le pDC murin a un autre marqueur de surface spécifique Siglec-H. Nous avons décidé de ne pas utiliser Siglec-H, car la liaison des anticorps de cette molécule réprime la fonction de pDC pour produire de l’IFNα. 11

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Protocole

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NOTE: MRL / Mp-Fas lpr (MRL / lpr) souris lupiques sujettes ont été élevés et maintenus dans un établissement exempt d'organismes pathogènes spécifiques suivant les exigences des institutions de protection des animaux et l' utilisation Commission (IACUC) au numéro de Virginia Tech (Bien - être Assurance animaux: A3208-01). Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Toutes les expériences sur les animaux ont été menées sous IACUC protocole # 12-062.

1. milieu de culture cellulaire et tri Buffer

  1. Préparer milieu complet de culture de cellules (C10) en utilisant du milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal, du pyruvate de sodium 1 mM, 1% à 100 MEM acides aminés non essentiels, Hepes 10 mM, 55 pM de 2-mercaptoéthanol, 2 mM de L-glutamine et 100 U / ml de pénicilline-streptomycine.
  2. Préparer un tampon de tri (HBSS-plein) en utilisant une solution saline équilibrée de Hank 1x (HBSS) complétée avec HEPES 10 mM, 2,5 mg / ml d'albumine de sérum bovin,0,05 mM MgCl2 et 0,2 U / ml d' ADNase I.

2. Souris Dissection

  1. Préparer deux plats de diamètre de 6 cm contenant 4 ml C10. Placez les plats sur la glace.
  2. Euthanasier la souris par inhalation de CO 2.
  3. Récolter la rate et le garder dans un plat avec C10 sur la glace.
    1. Pin de la souris vers le bas avec le ventre vers le haut sur la plaque de dissection. Stériliser le corps par pulvérisation d'éthanol à 70%.
    2. Couper la peau et séparer la peau de la paroi du muscle sous le long de la ligne médiane ventrale de la symphyse pubienne du cou.
    3. Couper la peau le long de la patte arrière de la première incision à la cheville.
    4. Epingler la peau du dos sur les côtés et couper la paroi musculaire le long des côtés de la première place de l'incision au diaphragme.
    5. Epingler la paroi musculaire de retour sur le côté droit de la tête.
    6. Repérez la rate sur le côté droit de la souris au-dessous de l'intestin grêle et à côté de l'estomac. Ramassez une extrémité de the la rate et le séparer de l'estomac.
  4. Couper les deux membres postérieurs dehors, y compris fémur et du tibia, et enlever tous les muscles autant que possible.
    1. Couper les muscles le long de la patte postérieure de l'articulation pelvienne / hanche à la cheville avec un ciseau tranchant, en essayant d'éviter les vaisseaux sanguins.
    2. Séparer la patte arrière en coupant à la pelvien / articulation de la hanche et de la cheville conjointe / pied sans l'exposition des contenus de la moelle osseuse.
    3. muscles restants propres sur les os par grattage avec une lame de rasoir à plusieurs reprises et en coupant les muscles au niveau des points communs.
  5. Gardez les os dans un plat de 6 cm contenant 4 ml C10 sur la glace. Passez à disséquer la prochaine souris.

3. splénocytes Isolation

  1. Homogénéiser la rate doucement avec un piston de la seringue contre une cellule crépine de 70 um sur le dessus du plat contenant 4 ml C10 jusqu'à ce qu'aucune pièces rouges sont visibles.
  2. Ajouter supplémentaire de 6 ml C10 dans le plat à travers le tamis ae puis transférer le 10 ml de suspension totale de cellules dans un tube de 15 ml conique.
  3. Centrifuger le tube conique à 800 g pendant 5 min, 4 ° C.
  4. Après centrifugation, le surnageant et aspirer le remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de 2 x globules rouges (RBC) du tampon de lyse. Incubation à température ambiante pendant 5 min.
  5. Après incubation, centrifuger le tube conique à 800 g pendant 5 min, 4 ° C.
  6. Après centrifugation, le surnageant et aspirer le remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de C10. Jeter toutes les grandes touffes (cellules mortes) et maintenir le tube sur la glace pour plus tard.
    NOTE: S'il y a beaucoup de petits amas, utilisez un tamis cellulaire de 70 pm pour filtrer la suspension cellulaire une fois.
  7. Comptez le nombre de cellules avec du bleu trypan en utilisant un compteur de cellules automatisé.

4. moelle osseuse de cellules d'isolement

  1. Transférer les os avec 4 ml C10 dans un mortier et ajouter 6 ml C10 pour obtenir un volume de 10 ml C10 au total.
  2. Casser les os doucement dans le mortier en utilisant apEstle.
  3. Remuer doucement avec le pilon pour libérer la moelle osseuse en C10.
  4. Transférer les 10 ml C10 contenant de la moelle osseuse dans un tube conique de 50 ml sur de la glace à travers un tamis cellulaire de 70 pm. Ajouter 10 ml C10 frais dans le mortier contenant encore les os.
    NOTE: Pipette la solution contenant de la moelle osseuse et à plusieurs reprises avant de passer à travers le tamis si touffes rouges sont visibles.
  5. Répétez les étapes deux fois 4.2 à 4.4. Après le dernier lavage, les os doivent apparaître blanc.
  6. Centrifuger le 50 ml tube conique à 800 g pendant 5 min, 4 ° C. Pendant ce temps, préparer 5 ml de milieu de gradient de densité prête à être utilisée dans un tube à centrifuger conique de 15 ml à température ambiante.
  7. Après centrifugation, le surnageant et aspirer le remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de C10.
  8. couche lentement la suspension de 10 ml de cellules au-dessus du milieu de gradient de densité de 5 ml, en maintenant une interface claire entre les deux phases. Puis centrifuger le tube de 15 ml conique à 1363 g pendant 30 min àRT (20 ° C) avec jeu d'accélération et de décélération 9 défini comme 0 (ou frein OFF).
  9. Après centrifugation, enlever le haut 8 ml de solution soigneusement et recueillir la couche 2 ml de buffy à l'interface (une couche de cellules mononucléaires) dans un nouveau tube de 15 ml conique.
  10. Ajouter 12 ml C10 glacé aux 15 ml tube conique contenant des cellules mononucléées de la moelle osseuse, capuchon et inverser plusieurs fois pour bien mélanger, puis centrifuger le tube à 800 g pendant 10 min, 4 ° C.

5. Cellule Coloration de surface pour FACS

  1. Coloration de l' échantillon
    1. Préparer anti-souris CD16 / 32 solution d'anticorps (1 à 100 de dilution dans du HBSS-plein, 5 ug / ml de concentration finale).
    2. Après centrifugation à l'étape 4.10, aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 100 pi de solution d'anticorps anti-souris CD16 / 32 pour bloquer les récepteurs Fc sur les cellules mononucléaires. Laisser incuber sur de la glace pendant 10 min.
    3. Préparer le mélange d'anticorps par fluorescence conjugué (anti-souris CD11c-PE dilution 1:40, anti-souris CD11b-APC-Cy7 1:80 dilution, anti-souris PDCA-1-FITC dilution 1:40 et anti-souris B220-V500 dilution 1:40 dans HBSS complet, tel que recommandé par le fabricant à 100 volume final ul par échantillon).
      NOTE: Il est important de titrer les anticorps avant utilisation.
    4. Après 10 minutes d'incubation à l'étape 5.1.2, ajouter 4 ml glacée HBSS complet et centrifuger à 800 g pendant 5 min, 4 ° C pour éliminer non liée anti-souris CD16 / 32.
    5. Après centrifugation, le surnageant et aspirer le remettre en suspension le culot cellulaire dans 100 mélange d'anticorps par fluorescence conjugué ul. Incuber sur la glace pendant 15 min dans l'obscurité.
    6. Après 15 minutes d'incubation, ajouter 4 ml glacée HBSS complet et centrifuger à 800 g pendant 5 min, 4 ° C pour éliminer les anticorps de fluorescence conjugué non lié.
    7. Préparer la solution de chargement FACS (500 ng / ml de DAPI dans HBSS-plein).
    8. Après centrifugation à l'étape 5.1.6, aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 μ; L FACS solution de chargement. Transférer la suspension cellulaire dans un 12 x 75 mm tube de fond rond (FACS tube) et maintenir le tube sur la glace dans l'obscurité jusqu'à ce que le tri dans les 1 h.
  2. Coloration pour l' indemnisation
    1. Étiquette 6 FACS tubes comme PE, APC-Cy7, FITC, V500, DAPI ou souillures. Splénocytes aliquotes à 1 x 10 6 cellules / tube dans les tubes FACS, et laver avec 4 ml de HBSS-plein à 800 xg pendant 5 min, 4 ° C.
      REMARQUE: Utiliser DNA-binding colorant fluorescent, DAPI, de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes. DAPI peut passer à travers la membrane plasmique des cellules mortes (mais pas de cellules vivantes) et de l'ADN chromosomique se lient.
    2. Aspirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 100 pi de HBSS-plein.
    3. Dans chaque tube FACS correspondant, ajouter l'un des anticorps suivants: anti-souris CD19-PE dilution à 1:40, anti-souris CD11b-APC-Cy7 dilution 1:80, anti-souris PDCA-1-FITC ou dilution 1:40 B220-V500 anti-souris dilution 1:40 comme recommandé par le manufacturer. Laissez le 5 e (DAPI) et 6 e (souillures) FACS tubes comme ils sont. Bien mélanger en secouant et incuber tous les tubes FACS sur la glace dans l'obscurité pendant 15 min.
    4. Après incubation, ajouter 4 ml de glace froide HBSS complet dans chaque tube et centrifuger les tubes FACS à 800 xg pendant 5 min, 4 ° C.
    5. Après centrifugation, le surnageant et aspirer le remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de la glace froide HBSS-plein à l'exception de la pastille dans le tube marqué DAPI, qui est remis en suspension dans 500 pi de solution de charge FACS. Garder les 6 tubes sur la glace dans l'obscurité jusqu'à ce que le tri.

6. Tri sur le Cell Sorter

REMARQUE: L'opération de tri procédure sur le cytomètre et le logiciel est standardisé avec une instruction détaillée fournie par la société. En bref, nous utilisons 100 buse de microns à 20 psi, régler la concentration de la cellule cible entre 5-10000000 par ml, et d' ajuster l' efficacité à 70% ou plus (c. -à- conflits maintenus sous 30%).

  1. Préparer la collecte des tubes FACS avec 500 ul de FBS / tube contenant 100 U / ml de pénicilline-streptomycine.
  2. Régler les paramètres de compensation de la trieuse de cellules en utilisant des tubes de compensation unique tache de l'étape 5.2.
    1. Enregistrez 10.000 cellules dans le tube unstained pour régler la porte négative pour chaque intensité de fluorescence.
    2. Enregistrez 10.000 cellules dans d'autres tubes de compensation unique tache de mettre en porte positive pour chaque intensité de fluorescence.
      REMARQUE: Le logiciel calcule automatiquement les paramètres de compensation.
  3. Utilisez un échantillon de l'étape 5.1 pour définir les portes de populations de cellules triées en enregistrant 3.000 cellules. En utilisant l'intensité de fluorescence en tant que paramètres de X et où l'axe Y, la population de cellules de grille cible manuellement en tant que groupe de points apparemment séparés des autres points.
    NOTE: Cet ensemble de déclenchement est flexible et arbitraire sur la base des besoins des chercheurs. Si les chercheurs attendent une plus grande pureté à base d'un ou plusieurs marqueurs, déplacer la portesupérieur en fonction de l'intensité de fluorescence correspondante.
  4. Chargez un tube de collecte et de commencer à trier la population de cellules cibles.
  5. Gardez le tube de prélèvement sur la glace après le tri jusqu'à ce que tous les tubes échantillons sont effectués.
  6. Ajouter de la glace froide C10 au tube de collecte jusqu'à 4 ml, capuchon et mélanger par inversion.
  7. Centrifuger le tube de collecte à 800 g pendant 5 min, 4 ° C, puis aspirer le surnageant, ce qui laisse environ 200 ul avec du culot cellulaire intacte.
  8. Ajouter 1 ml de glace froide C10 à remettre en suspension le culot cellulaire et transférer toute la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml.
  9. Centrifuger le tube de 1,5 ml à 800 g pendant 5 min, 4 ° C et à aspirer le surnageant, en laissant 100 pi avec le culot de cellules intactes.
  10. Conserver les populations de cellules triées sur la glace jusqu'à utilisation.

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Résultats

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Nous avons cherché à enrichir la moelle osseuse pDC avec une grande pureté, et sans l'influence d'autres types de cellules, de MRL / lpr lupus-prone souris des jeunes et des personnes âgées pour étudier les changements fonctionnels de pDC quant à leur capacité à produire de l'IFNa. La première stratégie de purification a été utilisée PMM, qui, comme le montre la figure 1, a conduit à seulement 7,75% de pureté après l'enrichissement. Par rapport à MCS, FACS enrichi pDC av...

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Discussion

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Le protocole décrit dans ce manuscrit concerne l’enrichissement de haute pureté de pDC vivants qui conservent la capacité de produire de l’IFNα. Les applications de ce protocole comprennent, sans s’y limiter, la purification de pDC et/ou de toute autre cellule mononucléée de la moelle osseuse de MRL/lpr et de toute autre souche de souris pour l’étude des fonctions cellulaires et moléculaires. Plusieurs étapes critiques de ce protocole consistent à assurer une viabilité et une pureté élevées de la pDC triée. La première é...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts concernant la publication de cet article.

Remerciements

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Nous remercions le laboratoire de cytométrie en flux du Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine pour l’utilisation de la plateforme de cytométrie en flux. Ce travail a été soutenu par les fonds de démarrage de XML. XL est membre du programme d’études supérieures en sciences biomédicales et vétérinaires.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
RPMI 1640gibco de life technologies11875-093
Sérum de veau fœtalHyCloneSH30396.03
Pyruvate de sodiumgibco de life technologies11360-070
MEM acides aminés non essentielsgibco de life technologies11140-050
HEPESgibco de life technologies15630-080
2-mercaptoéthanolgibco de Life Technologies21985-023
L-glutamine  ;gibco de life technologies25030-164
Pénicilline-streptomycinegibco de life technologies15140-122
1x Hank' s Solution saline équilibrée  ;gibco by life technologies14175-079
MACS BSA Solution mèreMiltenyi Biotec130-091-376
MgCl2SIGMAM8266
DNase ISIGMAD4527
Tampon de lyse des globules rouges (RBC)  ;eBioscience00-4300-54
Gradient de densité moyenGE Healthcare17-1440-02Ficoll-Paque Plus  ;
anti-souris CD19-PEBD Pharmingen553786
anti-souris CD11c-PEeBioscience12-0114-82
anti-souris CD11b-APC-CY7BD Pharmingen557657
anti-souris PDCA-1-FITCeBioscience11-3172-81
anti-souris B220-V500  ;BD Pharmingen561226
DAPIinvitrogenD3571
Plasmacytoïde Dendritic Cell Isolation Kit II, sourisMiltenyi Biotec130-092-786
BD FACSAria I cytomètre en flux  ;BD Biosciences643178
BD FACS Diva version 6BD Biosciences

Références

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Mots-clés

Fluorescence activated Cell SortingPlasmacytoid Dendritic CellsBone Marrow IsolationCell Surface StainingForward Scatter AnalysisSide Scatter AnalysisMagnetic Activated Cell SortingLupus prone MiceIFNalpha ProductionCell Purity Analysis

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