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Article de méthode

Injection Intrarénale de Escherichia coli Dans un modèle de rat de pyélonéphrite

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DOI :

10.3791/54649

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18 juillet 2017

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1Department of Radiology, Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Case Western Reserve University, 3Department of Urology, Case Western Reserve University, 4Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit décrit un modèle chirurgical de pyélonéphrite chez le rat utilisant une infection intrarénale directe par Escherichia coli dans le bassinet du rein. La procédure expérimentale peut être utilisée pour étudier la pathogenèse de la pyélonéphrite ainsi que l’inflammation et la fibrose associées.

Résumé

La pyélonéphrite est une infection bactérienne du rein et est le plus souvent causée par Escherichia coli. Les infections récurrentes peuvent provoquer une inflammation rénale importante et une fibrose, entraînant finalement un déclin de la fonction rénale. Avant de pouvoir mettre en place une meilleure prise en charge clinique et une meilleure prévention de la pyélonéphrite, un modèle animal fiable doit être établi afin d’étudier les mécanismes de progression, de récidive et d’efficacité thérapeutique. Le modèle d’infection transurétrale imite étroitement la pyélonéphrite humaine, mais présente des variations considérables en raison de sa dépendance au reflux urétral pour transporter la bactérie vers le rein. Ici, un protocole chirurgical détaillé pour effectuer des injections bactériennes dans le bassinet du rat est fourni et confirmé par l’imagerie par résonance magnétique (IRM) non invasive. Grâce à ce protocole, les animaux sont exposés directement à une concentration souhaitée de bactéries E. coli et peuvent se rétablir complètement de l’intervention chirurgicale avec des soins postopératoires adéquats. Cela facilite les évaluations IRM longitudinales ultérieures des modèles animaux de laboratoire pour comparaison avec les témoins salins (simulés). En utilisant cette approche d’administration directe, la gravité de l’infection est contrôlable et applicable aux études mécanistes de la progression ainsi qu’au développement de nouvelles stratégies de traitement.

Introduction

Les modèles de rongeurs ont été utilisés pour étudier de nombreuses manifestations de maladies humaines, y compris la pyélonéphrite et les infections urinaires (UTI). Les infections urinaires sont un problème de santé mondial et peuvent avoir un impact sur les enfants, les hommes et les femmes de tous âges. 1 , 2 , 3 La manifestation initiale de l'UTI comprend la cystite, et si l'infection augmente le long de l'urètre, une infection rénale (pyélonéphrite) peut suivre. Dans le même temps, la prévalence du diabète touche environ 400 millions de personnes à travers le monde. 4 , 5 Il est important de noter que l'incidence de l'UTI peut être jusqu'à 4 fois plus élevée chez les patients obèses ou qui ont un diabète de type 2, ce qui entraîne un risque accru d'infection à UTI récurrente (UTI), une septicémie, une fibrose rénale de la pyélonéphrite et un dysfonctionnement de la vessie. 6 , 7 , 8 RongeurLes modèles sont importants dans l'étude des infections urinaires, car les traitements antibiotiques actuels produisent une réponse préventive et soutenue uniquement dans un sous-ensemble de patients atteints d'UTI. Pour améliorer les soins cliniques d'UTI, les étapes clés sont de comprendre le mécanisme de rUTI et ses processus pathophysiologiques, de l'infection aiguë à l'inflammation à la fibrose, ainsi que l'impact du diabète sucré de type 2.

L'objectif d'améliorer les modèles animaux est de développer des techniques permettant une évaluation plus précise de la progression de la maladie et des interventions thérapeutiques. Plusieurs approches différentes ont été utilisées pour induire une pyélonéphrite chez les rats et / ou les souris pour étudier la pathophysiologie des lésions rénales, l'effet du traitement antibiotique et d'autres aspects du cours naturel des infections urinaires. Une approche commune pour établir une UTI rétrograde est le cathétérisme transurétral. 10 , 11 , 12 , 13 </ Sup> Cette méthode introduit des bactéries par l'urètre dans la vessie des animaux anesthésiés. Bien que cette technique simule de près la pyélonéphrite humaine, l'incidence et l'ampleur réelles de l'infection pyélonéphrite peuvent être très variables en raison de multiples facteurs, y compris un manque de reflux urétéral spontané ou de sédiment urinaire pendant ou immédiatement après l'inoculation. 11 En conséquence, la variabilité expérimentale pour induire une infection ascendante de pyélonéphrite peut limiter l'utilité de ce modèle pour étudier les infections rénales ainsi que des stratégies thérapeutiques.

Ce rapport décrit un modèle de rat de pyélonéphrite chirurgicale où E. coli est directement injecté dans le rein du rat. Bien que ce modèle de rat soit envahissant, la quantité d' E. Coli délivrée au rein peut être efficacement contrôlée, ce qui permet une infection et une inflammation rénales rénales. 14 Dans cette procédure, nous décrivons égalementComment ces infections rénales induites peuvent être surveillées longitudinalement avec l'imagerie par résonance magnétique (MRI) in vivo .

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Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été effectuées selon les protocoles approuvés du Comité d'aide et de prise en charge des animaux institutionnels (IACUC) à l'Université Case Western Reserve. La durée de la procédure chirurgicale décrite ci-dessous est d'environ 45 à 60 minutes. La procédure d'IRM elle-même est d'environ 15 minutes pour chaque point de temps.

1. Anesthésie

  1. Anesthésier le rat dans la chambre d'isoflurane réglée à 2% d'isoflurane mélangé à de l'oxygène pour faciliter la manipulation et la contrainte des animaux avant d'administrer une anesthésie injectable intrapéritonéale.
  2. Après 3 à 5 minutes d'exposition à l'isoflurane, vérifiez que l'animal est anesthésié et ne présente aucune réponse au pincement de l'orteil.
  3. Plus de rat sédatif avec une injection intra-péritonéale d'un mélange de xylazine et de kétamine: 75 mg / kg de kétamine / 10 mg / kg de xylazine. Lorsque vous effectuez des injections intra-péritonéales, retirez l'aiguille pour s'assurer que des parties de l'intestin ou d'autres organes vitaux n'ont pas été perforées.
  4. jeNject 2 mg / kg de bupivacaïne par voie sous-cutanée sur le site d'incision pour fournir un soulagement de la douleur topique.

2. Préparation de la zone chirurgicale

  1. Stériliser les instruments et les fournitures chirurgicales avant d'être utilisés pour la chirurgie et disposer sur le coussin chirurgical pour la stérilité. La plupart des instruments et des fournitures peuvent être autoclavés et réutilisés.
  2. Utilisez des gants stériles pour toutes les interventions chirurgicales.
  3. Utilisez un rasoir électrique pour raser la fourrure du côté droit de l'animal. Raser l'animal du fond de la cage thoracique vers le haut de la patte postérieure en fournissant une grande zone sans cheveux pour l'incision.
  4. Placez l'animal sur un tampon chirurgical stérile pour isoler la zone désinfectée des zones environnantes.
  5. Nettoyer la peau avec un désinfectant comme la povidone iodée ou la betadine. Commencez le lavage au centre du site chirurgical et passez à l'extérieur de manière circulaire. Répétez au moins trois fois avec un nouvel essuyage de povidone iodine ou betadine.
  6. Scrub le site chirurgical avec des tampons à alcool de 70% jusqu'à ce que la peau soit claire, car l'iode peut être toxique s'il est absorbé.

3. Procédure chirurgicale

  1. Maintenir cette procédure dans des conditions aseptiques.
  2. Placez l'animal anesthésié sur un lit de chauffage chaud dans la position de décubitus latéral gauche avec le flanc droit vers le haut.
    REMARQUE: il faut veiller à maintenir la température du corps central de l'animal à 35-37 ° C pour prévenir l'hypothermie. Ce lit chauffant devrait également être stérilisé au besoin pour maintenir les conditions aseptiques.
  3. Sentez-vous pour la cage thoracique, et faites une petite incision rétropéritonale dorsale droite de 2-3 cm en utilisant une lame de scalpel stérile de taille 10 commençant au bas de la cage thoracique.
  4. Placez la gaze stérile longitudinalement de chaque côté de l'incision.
  5. Dissectionner le tissu sous-cutané, la graisse et les muscles afin de visualiser et d'accéder à la cavité abdominale. Utilisez des ciseaux à lame incurvée pour permettre une pénétration plus profondeRayer la plaie et couper les tissus épais.
  6. Une fois que le foie est clairement visible et accessible, utilisez une pince serrée pour rétracter le foie vers le haut.
  7. À l'aide d'une autre paire de pinces émoussées, d'autre part, exposez le rein droit de sorte qu'il se trouve juste à l'extérieur de la cavité abdominale.
  8. Utilisez le doigt du pointeur et le pouce de la main gauche pour maintenir le rein en position. Avec la main droite, injectez lentement et régulièrement une solution de E. coli UTI89 0,1 ml (concentration entre 1 x 10 8 -1 x 10 9 ) d'une seringue stérile dans le bassin rénal (qui apparaît comme une bulle blanche) 15 .
    REMARQUE: Préparez le titre bactérien comme décrit dans la référence 15 .
  9. Placez une bande d'hémostatique absorbable sur l'aiguille pour empêcher l'écoulement d'inoculum dans le péritoine. Retirez lentement l'aiguille du bassin rénal.
    REMARQUE: Il faut prendre soin de ne pas percer ou infecter les tissus environnants, ce qui entraîne une infectibilité hors cibleOns et / ou des complications.
  10. Utilisez une seringue plus grande pour bien rincer le rein avec une solution saline normale avant de le remettre dans la cavité abdominale.

4. Sutures

Remarque: La suture qui sera enterrée dans les tissus devrait être de 4 à 0 sutures tressées non absorbables. Les sutures absorbantes ou monofilaments peuvent être utilisées pour les surfaces corporelles.

  1. Placez les sutures uniformément et aussi près du bord du tissu que possible pour empêcher l'obstruction du flux sanguin; Généralement pas plus de 0,3 cm du bord est nécessaire.
  2. Saisissez la peau et évitez-la légèrement à l'aide d'une pince fine à pointe dentée, et faites pivoter le porte-aiguille dans une position pronisée en vue de percer la peau.
  3. Conduisez l'aiguille à travers l'épaisseur totale de la peau en supprimant le poignet pour faire pivoter l'aiguille et la passer à travers la peau.
  4. Répétez ce processus pour le bord de la peau le plus proche de l'individu exécutant la procédure.
  5. SerrerLes sutures suffisent pour s'opposer aux bords des tissus. Tout plus serré entravera l'approvisionnement en sang, cicatrisera lentement et entraînera une déhiscence.
  6. Attachez la suture en utilisant des noeuds carrés, comme s'il s'agissait d'un simple point interrompu, sauf que seul le brin court est coupé, laissant environ une queue de 3-4 mm.
  7. Une fois que le premier point a été attaché, préparez-vous à placer un deuxième point à environ 3 mm de la première et continuez la suture en cours d'exécution.
  8. Une fois la fin de l'incision atteinte, n'attimez pas complètement le dernier point. Au lieu de cela, utilisez la boucle qui est retenue avec le porte-aiguille ici comme brins courts pour attacher l'extrémité distale de la fermeture de suture.
  9. En utilisant des attaches d'instruments, attachez la suture en utilisant des noeuds carrés. Il en résulte 3 brins dépassant le nœud terminé à l'extrémité distale.

5. Récupération animale

  1. Injecter 2,1 mg / kg de Yohimbine intra-péritonéale après une intervention chirurgicale pour inverser l'anesthésie. UNEOn s'attend à ce que les nimaux se récupèrent complètement de la procédure chirurgicale après 3-5 heures.
  2. Gardez l'animal sur un coussin chauffant (pour éviter l'hypothermie) et le lit doux absorbant après la chirurgie.
  3. Fournir une réhydratation avec des liquides oraux ou parentéraux jusqu'à ce qu'il puisse revenir à l'alimentation normale (dans les 24 heures). Injecter environ 0,6 ml de solution saline normale par voie peritoneale immédiatement après la chirurgie pour limiter les effets de déshydratation.
  4. Fournir une analgésie tel que décrit dans le protocole approuvé par l'IACUC sur les soins et l'utilisation des animaux. Injecter 5 mg / kg de carprofène par voie sous-cutanée pour le traitement de la douleur.
  5. Surveillez régulièrement les incisions pour le gonflement, l'exsudat, la douleur ou la déhiscence.

6. Validation par imagerie par résonance magnétique

  1. Effectuer des expériences d'IRM n vivo sur des scanners d'IRM à petits animaux sur le terrain.
  2. Induire l'anesthésie avec 3% d'isoflurane dans l'oxygène et positionner l'animal avec le rein droit chez isocenter dans le scanner IRM et appropriéA alimenté la bobine radiofréquence. Fournir aux animaux une anesthésie à l'isoflurane à 1-2% en continu tout au long de la procédure d'imagerie par une pointe de nez.
    REMARQUE: Pour les images IRM in vivo représentées sur la figure 1 , une bobine de volume de taille de rat (diamètre intérieur = 72 mm) a été utilisée.
  3. Utilisez un système de surveillance et de contrôle des animaux pour maintenir le taux de respiration de chaque animal (40-60 respirations / min) et la température corporelle du corps (35 ± 1 ° C).
  4. Utiliser une acquisition d'IRM à écho de spin multicouches et multi-écho pour obtenir des images pondérées en T2 axiales et à haute résolution des reins infectés et contrôlés. Les paramètres typiques d'acquisition de l'IRM sont le temps de répétition = 5 000 ms, le temps d'écho = 40 ms, l'épaisseur de la tranche = 2,0 mm, la résolution spatiale dans le plan = 200 μm, 3 moyennes du signal et un temps d'acquisition de 8 min.

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Résultats

Les techniques d'imagerie médicale offrent la possibilité d'évaluer de façon non invasive l'UTI et l'efficacité thérapeutique. Par conséquent, l'IRM a été utilisée pour valider l'induction d'une infection aiguë après injection de 1-2 x 10 7 UTI89 E. coli et pour visualiser les changements dans le rein avant et après la chirurgie. La figure 1a-b montre une région d'infection rénale qui augmente progressivement (flèches jaunes). Les images IRM obtenues ...

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Discussion

La pyélonéphrite aiguë ascendante chez les rongeurs (c.-à-d. Les souris et les rats) peut être produite par un cathétérisme transurétral. 16 , 17 , 18 Cette méthode d'infection transurétrale est avantageuse en ce qu'elle est non invasive et imite la pathophysiologie humaine de l'infection ascendante. 17 , 18 , 19 <...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas d’autres divulgations.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier le NIH/NIDDK K12 DK100014 (Lan Lu), le Case Comprehensive Cancer Center (NIH/NCI P30 CA43703) et le Clinical and Translation Science Collaborative de Cleveland (NIH/NCATS UL1 TR000439).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tampon absorbantFisher14-127-47
Tampon de gaze de coton stérileFisher22-415-469
Gants chirurgicaux en latexHenry Schein Animal Health21540
Ciseaux Mayo incurvésFisherS17341
Foreceps droit émousséFisher08-895
Manche de scalpel  ;Fisher08-913-5
Lames de scalpel stérilesFisher53220
1 ml Seringue Luer-LokBD Biosciences309628Pour injections bactériennes
20 ml Seringue Luer-Lok  ;BD Biosciences301031Pour lavage salin
HemostatSeneca Medical240267
23 G 3/4 po. Aiguille  ;BD Biosciences305143
30 G 1 po. Aiguille  ;BD Biosciences305128
Seringue à insuline U-100Exel International  ;25846Pour les injections de médicaments
IsofluraneHenry Schein Santé animale050033
XylazineHenry Schein Santé animale33197Injecter IP
KétaminePatterson Vétérinaire  ;07-881-9413Inject IP
Yohimbine (Atipamezole)Patterson Vetrinary  ;07-867-7097Injecter IP après la chirurgie
Bupivacaïne (Marcaine)Patterson Vetrinary  ;07-890-4584Injecter SQ au site de l’incision
4-0 Suture intestinale chromiqueEthicon Inc.U203H
4-0 Suture Vicryle TresséeEthicon Inc.J304H
1 ml Seringue SubQBD Biosciences309597
E. coli  ; UTI89 ou CFT073ATCC700928
Hémostat Résorbable SurgicelEthicon Inc.ETH1951CS  ;
Biospec 9.4T MRI  ;Bruker  ;94/20 USR

Références

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Réimpressions et autorisations

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