Une méthode pour l'ARN de mesure<em> N</em⁶ -methyladenosine Modifications dans les cellules et de tissus

Summary

Une méthode Northern Blot modifiée pour mesurer ^N6- -methyladenosine (m ⁶ a) des modifications dans l' ARN est décrite. La méthode actuelle peut détecter des modifications dans divers ARNs et des contrôles en vertu de divers modèles expérimentaux.

Abstract

N⁶-Methyladenosine (m⁶A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m⁶A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m⁶A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m⁶A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m⁶A modifications in various sources of RNA. While m⁶A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m⁶A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

Introduction

Dynamic and reversible RNA modifications have important roles in RNA homeostasis. Four decades ago, N⁶-methyladenosine (m⁶A) modifications were found to be abundant in eukaryotic transcriptomes¹. They have diverse functions in messenger RNA (mRNA), ribosomal RNA (rRNA), small nucleolar RNA, transfer RNA, and microRNA². The m⁶A modifications of mRNA influence their splicing³, translation⁴, degradation⁵, and localization². Moreover, they affect ribosome biogenesis and microRNA function⁶. The evolutionary conservation of m⁶A modifications of RNA is noted in unicellular bacteria to multi-cellular humans⁷. Delineation of the roles of m⁶A modifications is currently under extensive exploration. The efforts are expected to provide new insights into transcription control. Recent studies reveal that other chemical modifications of mRNA⁸ also play critical roles in RNA metabolism.

Circadian rhythms⁹, stem cell pluripotency¹⁰, triglyceride metabolism⁴, fibrosis¹¹, obesity¹², and major depression¹³ are a few examples of processes where m⁶A modifications are known to control outcomes. Many circadian clock gene transcripts have m⁶A sites¹⁴. Modulation of m⁶A methylase or demethylase elicits circadian period changes¹⁵. Mettl3, an m⁶A transferase, is a regulator for stem cell pluripotency. A deficiency of Mettl3 leads to early embryonic lethality and aberrant lineage priming at the post-implantation stage¹⁰. A deficiency of fat mass- and obesity-associated (FTO), an m⁶A demethylase, in adipocytes affects fatty acid mobilization and body weight through posttranscriptional regulation of Angptl4⁴. These studies reveal that m⁶A not only controls mRNA processing, but also plays critical roles in embryological development and patho-physiology. The function of m⁶A modifications holds implications for therapeutic considerations in the future.

Several methods are available to measure m⁶A modifications of RNA^16-18. Traditionally, thin layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) are used to study the distribution of m⁶A in several RNAs^19,20. Mass spectrometry is a sensitive tool for the detection of m⁶A modifications in RNA. However, the RNA needs to be excised by RNase into short fragments before analysis by mass spectrometry²¹. Methyl-RNA immunoprecipitation and sequencing (m⁶A-Seq)²² immunoprecipitates fragmented RNAs with m⁶A-specific antibodies and performs parallel RNA sequencing. This method generates transcriptome-wide m⁶A landscapes. High-resolution mapping of m⁶A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation (miCLIP) further maps m⁶A modifications at a single-nucleotide resolution²³. Both methods provide details of m⁶A modification across the whole transcriptome, with specific genes’ information. However, quantifications and standardization in both methods are difficult if experiments require the comparison of multiple conditions. Moreover, fragmentations of RNA for m⁶A-Seq alter the original RNA structure, which may affect native m⁶A levels. To detect global m⁶A modifications of RNA and their changes under different experimental conditions, we report a method that employs a modified northern blotting protocol. This method resolves RNA by molecular weight, using gel electrophoresis¹⁸. This procedure provides better standardization and quantifications for experiments that involve multiple conditions or samples. It also provides specific m⁶A modification information for different RNAs, whether rRNA, mRNA, or microRNA.

Protocol

NOTE: Le m d'ARN total ⁶ Un niveau comprend l' ARNr, l' ARNm, et d' autres petits ARN. Depuis l' ARN ribosomal a abondant m ⁶ modifications A, la mesure de m ⁶ niveaux A devront tenir compte de ce fait.

1. Isolement de l'ARN

1. En utilisant la solution ribonucléase de décontamination (pulvérisée sur des serviettes en papier), essuyez les pipettes et les surfaces de laboratoire de banc. serviettes en papier humides avec de l'eau sans nucléase et essuyez pipettes et des surfaces de laboratoire de banc à nouveau.
2. Extraction d'ARN
   1. Isolement de l'ARN total
      1. En utilisant un agitateur suspendu, d' homogénéisation de 50 à 100 mg de tissu ou de 5-10 x 10 ⁶ cellules dans 1 ml de solution d'isolement d'ARN maintenu à 4 ° C.
         NOTE: Plus le tissu (100-150 mg) peuvent être nécessaires pour des échantillons de tissu adipeux de souris en raison des concentrations d'ARN inférieures qui y sont. Les échantillons proviennent de coeur de la souris, le foie, le muscle squelettique, du poumon, du cerveau, et les macrophages ont été employées précédemment ^4.
      2. Danscubate homogénats d'échantillons pendant 5 min à température ambiante.
      3. Ajouter 100 ul de 1-bromo-3-chloropropane (PCA) pour 1 ml d'échantillon d'homogénat. Agiter les tubes vigoureusement pendant 15 s et procéder à isoler l' ARN total selon les instructions du fabricant ^24.
   2. Polyadénylé de purification d'ARNm de l'ARN total isolé
      1. Purifier ARNm polyadénylés à l'aide de kits ou protocoles disponibles.
         1. Bien agiter pour remettre en suspension chacune des solutions suivantes: solution de liaison, oligo (dT) des billes de polystyrène, et une solution de lavage 2x. Assurez-vous que l'oligo (dT) Perles réchauffer à la température ambiante avant utilisation.
         2. Transférer 120 pi de solution d'élution par préparation dans un tube et on chauffe à 70 ° C dans un bloc chauffant.
         3. Pipeter jusqu'à 500 pg d'ARN total dans un tube de microcentrifugation. Avec de l'eau sans nucléase, ajuster le volume à 250 pi.
         4. Ajouter 250 pi de solution de liaison 2x à l'ARN total ainsirésolu- et brièvement vortex pour mélanger le contenu.
         5. Ajouter 15 ul d'oligo (dT) et des billes vortex pour mélanger à fond.
         6. Laisser incuber le mélange à 70 ° C pendant 3 min.
         7. Retirer l'échantillon du bloc de chauffage et le laisser reposer à température ambiante pendant 10 min.
         8. Centrifuger à 15000 g pendant 2 min.
         9. Retirez délicatement le surnageant, laissant environ 50 pi.
         10. Ajouter 500 pi de solution de lavage pour resuspendre le culot par pipetage.
         11. Pipeter la suspension dans un tube ensemble filtre rotatif / collection.
         12. Centrifuger à 15000 g pendant 2 min. Retirer la colonne du tube collecteur et jeter l'écoulement. Retour à la colonne du tube de collecte.
         13. Pipette 500 pi de solution de lavage sur le filtre de spin.
         14. Centrifugeuse à 15.000 x g pendant 2 min.
         15. Transférer le filtre rotatif dans un tube de collection fraîche.
         16. Introduire à la pipette 50 ul de solution d'élution chaufféà 70 ° C sur le centre du filtre rotatif.
         17. Incuber pendant 2-5 min à 70 ° C. Centrifuger à 15000 g pendant 1 min.
         18. Pipeter une 50 ul supplémentaires de solution d'élution chauffé à 70 ° C sur le centre du filtre rotatif.
         19. Répétez l'étape 1.2.2.1.18.
      2. Ajouter 100 pg / ml de glycogène, 0,1 volume de 3 M de tampon d'acétate de sodium (pH 5,2) et 2,5 volumes d'éthanol absolu. Précipiter nuit à -80 ° C.
      3. Centrifugeuse à 15.000 xg pendant 25 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
      4. Laver le culot avec 1 ml d'éthanol à 75%. Centrifugeuse à 15.000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Retirez délicatement l'éthanol.
      5. Sec à l'air pendant 3-5 min.
      6. Ajouter 10 ul d'eau sans nucléase pour dissoudre le culot.
      7. Conserver à -70 ° C.
3. ARN Qualification et quantification
   1. À l'aide d'un spectrophotomètre, déterminer la concentration d'ARN par Notlng l'absorbance à 260 nm et 280 nm. Le rapport A ₂₆₀ / A ₂₈₀ devrait être de 1,8 à 2,2.
   2. Vérifier la qualité de l' échantillon d'ARN en utilisant 0,8% de gel d' agarose électrophorèse ^25.
      NOTE: L'ARN total eucaryote intact devrait montrer intenses bandes 28S et 18S. Le rapport de 28S par rapport 18S intensité de la bande pour une bonne préparation de l'ARN est ~ 2.

2. Gel Electrophoresis et le transfert

REMARQUE: Les protocoles de préparation de tampon sont donnés dans le tableau 1.

1. Préparation du gel de formaldehyde (1%)
   1. Rincer tout l'équipement d'électrophorèse avec de diéthyle (DEPC) l'eau.
   2. Faire fondre 2,5 g d'agarose dans 215 ml d'eau DEPC complètement dans un four à micro-ondes.
   3. Ajouter 12,5 ml de 10x 3- (N- morpholino) propanesulfonique (MOPS) tampon et 22,5 ml de 37% de formaldéhyde.
   4. Verser dans l'appareil d'électrophorèse avec un peigne à une épaisseur de 1,5 mm.
   5. Éliminer les bulles ou pousser tourlet sur les bords du gel avec un peigne propre.
   6. Permettre au gel de se solidifier à la température ambiante.
2. La préparation des échantillons
   1. Mélanger 1-10 ug de l'ARN total et 11,3 ul de tampon d'échantillon.
   2. Mélanger 2 pg du marqueur d'ARN (1 pg / pl) 11,3 pi de tampon d'échantillon.
   3. Ajouter de l'eau sans nuclease à partir des échantillons 2.2.1 et 2.2.2 à un volume total de 16 ul.
   4. Chauffer à 60 ° C pendant 5 min, puis refroidir sur la glace.
   5. Mélanger 16 ul de l'échantillon à partir 2.2.3 avec 4 pi de colorant de suivi, qui contient 0,1 pg / pl de bromure d'éthidium sur la glace.
      ATTENTION: Le bromure d'éthidium est peut-être tératogène et toxique en cas d'inhalation. Lire le bromure d'éthidium fiche de sécurité.
3. Electrophorèse
   1. Ajouter 200 ml de 10x MOPS tampon à 1.800 ml de ddH ₂ O pour faire un tampon de migration MOPS 1x.
   2. Utilisez le tampon en cours d'exécution 1x MOPS pour rincer les puits du gel.
   3. Pre-run til gel à 20 V pendant 5 min.
   4. Charger les échantillons d'ARN dans les puits du gel.
   5. Couvrir de papier d'aluminium pour éviter exposition à la lumière. Exécutez à 35 V pendant environ 17 h (pendant la nuit)
   6. Examiner et photographier le gel sous une lumière UV.
4. Transfert
   1. Couper le gel pour éliminer la portion inutilisée.
   2. Préparer 500 ml de 10 x tampon SSC (250 ml de tampon 20x SSC et 250 ml d'eau DEPC).
   3. Laver le gel deux fois avec un tampon 10x SSC pendant 20 minutes avec agitation à 50 tours par minute.
   4. Couper 1 filtre feuille de papier assez grand pour servir de document de mèche, qui absorbe un tampon de transfert à partir du plateau de transfert (Figure 1).
   5. Couper 4 morceaux de papier filtre à la même taille que le gel.
   6. Découper une feuille de membrane en nylon chargée positivement à la même taille que le gel.
   7. Marquer une encoche sur le gel et la membrane en tant que marqueur pour assurer l'orientation correcte.
   8. Faire tremper la membrane dans un tampon SSC 2x pendant 15 min.
   9. Verser 500 ml d'of 10x SSC tampon dans le bac de transfert.
   10. Poser la grande feuille de papier filtre sur la plaque de verre et le papier filtre humide avec un tampon de transfert.
   11. Etaler les bulles avec une pipette.
   12. Faire tremper 2 morceaux de papier filtre pré-découpé dans un tampon de transfert et les placer sur le centre du papier filtre de l'étape 2.4.5. Retirez toutes les bulles.
   13. Poser le côté supérieur de gel sur le papier filtre.
   14. Poser la membrane sur le dessus du gel. Aligner les encoches du gel et la membrane.
   15. Placer 2 morceaux de papier filtre pré-coupe sur le dessus de la membrane et le papier filtre avec un tampon de transfert humide.
   16. Retirez toutes les bulles entre les couches.
   17. Appliquer un film plastique autour du gel pour assurer que les serviettes seulement absorbent le tampon qui passe à travers le gel et la membrane.
   18. Empilez les serviettes en papier sur le dessus du papier filtre.
   19. Placer une plaque de verre surdimensionné sur le dessus des serviettes.
   20. Placer un poids sur le dessus de la pile.
   21. Maintenir pendant une nuit pour permettre à l'ARN de transférer du gel vers la membrane.

3. Détection de la N ⁶ -methyladenosine

1. Membrane Réticulation
   1. Gardez la membrane humide dans un tampon 2x SSC.
   2. Placez 2 feuilles de papier filtre immergé avec 10x tampon SSC en réticulant UV.
   3. Placer la membrane sur le dessus du papier-filtre, le côté de l'ARN adsorbé vers le haut.
   4. Sélectionnez "mode autocrosslink" (120.000 pJ) et appuyez sur le bouton "Démarrer" pour lancer l'irradiation.
   5. Examiner la membrane et le gel avec un gel UV image receveur pour confirmer le transfert de l'ARN du gel à la membrane.
2. immunotransfert
   1. Bloquer la membrane dans 5% de lait dégraissé dans une solution salée tamponnée au Tris avec du Tween 20 (TBST), un tampon à température ambiante pendant 1 h.
   2. Laver trois fois avec du tampon TBST pendant 15 min.
   3. Incuber la membrane pendant une nuit à ⁶ m A (<em> N ⁶ -methyladenosine) solution d'anticorps (1: tampon TBST de lait non gras 1000 dans 5%) à 4 ° C.
   4. Laver la membrane trois fois avec le tampon TBST pendant 15 min.
   5. Incuber la membrane dans la solution d'âne conjugué à HRP anti-lapin d'anticorps (1: 2000 dans du tampon TBST de lait non gras à 5%) pendant 1 h à température ambiante.
   6. Laver la membrane trois fois avec le tampon TBST pendant 15 min.
   7. Appliquer le substrat de chimioluminescence amélioré (0,125 ml par ^cm2 de membrane).
   8. Capturez la chimioluminescence avec les réglages optimaux de l'imageur numérique, selon les instructions du fabricant ^26.
3. m ⁶ A Quantification
   1. Mesurer la m ⁶ Une intensité de chimioluminescence par rapport à l' aide du logiciel ImageJ.
      1. Dans le menu du logiciel ImageJ, sélectionnez l'option "Fichier" pour ouvrir le fichier pertinent.
      2. Sélectionnez l'outil "Rectangle" de ImageJ et dessiner un cadre autourles signaux.
      3. Si l' ARN ribosomal est pas l'objet des expériences, d' éviter les 18S et 28S ribosomal RNA m ⁶ bandes A pour le calcul.
      4. Cliquez sur "Command" et "1" pour confirmer la voie sélectionnée.
      5. Appuyez sur "commande" et "3" pour afficher le tracé sélectionné.
      6. Cliquez sur l'outil "Straight" et tracer des lignes pour séparer la zone segmentée.
      7. Cliquez sur l'outil "baguette" pour enregistrer les mesures.
      8. Exporter les données.
      9. Normaliser les niveaux de m ⁶ A avec l'ARN ribosomal 18S bande à partir de la coloration au bromure d'éthidium.

Representative Results

Discussion

Modifications of RNA have important roles in cellular function and physiology. The current understanding of the regulation, function, and homeostasis of these modifications is still being explored and expanded⁸. Therefore, a precise and gold-standard method to evaluate the modifications of RNA is needed. The modified northern blotting method provides precise quantification of RNA modifications and clear delineation of the modifications in diverse RNAs. Although the method requires at least 3 days, it can be standardized and can be used in various experimental designs. Moreover, with different antibodies, it can detect different RNA modifications²⁷.

It is important to separate different RNAs when analyzing RNA modifications. Ribosomal RNA comprises a large portion of the total amount of RNA^28,29. The results from analyzing RNA modifications only in total RNA will represent mostly the changes of rRNA. Methylation and other such modifications of rRNA could potentially mask the changes in other RNAs. With the procedure of gel separation, the modifications of mRNA and other small RNAs can be more accurately analyzed.

Transcriptome-wide mapping with m⁶A immunoprecipitation and sequencing provides detailed insight into the modification of each type of RNA²². It provides information on the specific RNAs and a resolution of around 80-120 bp. Although m⁶A-Seq can compare the modifications between different experimental conditions, the selection of proper standards and controls for such experiments is difficult¹⁸. Immunoprecipitation is difficult to reproduce, often giving significant variations amongst repeats. Moreover, m⁶A-Seq requires the fragmentation of RNA samples before immunoprecipitation and sequencing³⁰. The fragmentation process could potentially induce undue influences on the original RNA modifications. If the experiment does not need the specific gene’s information but requires different conditions for comparison, the current method provides better visualization and control for diverse experimental setups.

Modification of RNA is an important step in regulating transcriptional control³¹. However, the homeostasis and the regulatory mechanisms of various RNA modifications under diverse physiological realms are still unclear. Using the present modified northern blotting method, different RNA modifications can be quantified and compared. Furthermore, the changes and regulations of RNA modifications can be investigated in greater detail. In the future, it could also be possible to combine the experimental data from both the classical northern blotting and the modified northern blotting protocols, providing greater insights into RNA biology.

The most important factor determining the success of the modified northern blotting protocol is the integrity of the RNA sample. RNAs with some amount of degradation may yield good classical northern blotting results, but this could potentially have significant impact on the modified northern blotting results. The modifications of RNA in different tissues or cell lines could also vary significantly. It is important to test the suitable RNA sample loads for different tissues before performing the final experiments.

As blotting procedures have been traditionally named after Dr. Southern and different geographical directions, we propose the name “northeastern” blotting for the current technique.

Materials

RNaseZap solution	Ambion	AM9782	Protocol 1.1
TRI Reagent solution	Ambion	AM9738	Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP)	Sigma	B9673	Protocol 1.2.1.3
Ethanol	JTbaker	8006	Protocol 1.2.1.3
Isopropanol	Sigma	I9516	Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit	Sigma	MRN70	Protocol 1.2.2.1
Glycogen	Ambion	AM9510	Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate	Fluka	71183	Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water	Ambion	AM9930	Protocol 1.2.2.6
DEPC	Sigma	D5758	Protocol 2.1.1
Agarose	JT Baker	A426	Protocol 2.1.2
MOPS	Sigma	M1254	Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution	Sigma	F8775	Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt	JT Baker	8993	Protocol 2.1.3 10x MOPS buffer
formamide	Sigma	F7503	Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker	Ambion	AM7150	Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide	Amresco	X328	Protocol 2.2.5
Ficoll PM400	GE Healthcare	17-0300-10	Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue	Sigma	114391	Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol FF	Sigma	X4126	Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride dihydrate	JT Baker	3624	Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Trisodium citrate	Sigma	S1804	Protocol 2.4.2 20x SSC buffer
Hybond Blotting Paper	GE Healthcare	RPN6101M	Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane	GE Healthcare	RPN303B	Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400	Stratagene	400075	Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500	ANT Technology	Gel Catcher 1500	Protocol 3.1.5
Anti-m<sup>6</sup>A (N<sup>6</sup>-methyladenosine)	Synaptic Systems	202003	Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab	GE Healthcare	NA934	Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System	BIO-RAD	1708280	Protocol 3.2.8