Caractérisation des complexes multi-unité de protéine MxA humaine utilisant dénaturant non-Gel-électrophorèse polyacrylamide

Résumé

Cet article décrit un protocole simple et rapide pour évaluer l’état oligomérique de la protéine GTPase MxA de type dynamine à partir de lysats de cellules humaines en utilisant une combinaison de PAGE non dénaturante et d’analyse par western blot.

Résumé

La formation de complexes oligomères est une condition préalable cruciale à la structure et au bon fonctionnement de nombreuses protéines. La protéine effectrice antivirale MxA, induite par l’interféron, exerce une large activité antivirale contre de nombreux virus. MxA est une GTPase de type dynamine et a la capacité de former des structures oligomères d’ordre supérieur. Cependant, la question de savoir si l’oligomérisation de MxA est nécessaire pour son activité antivirale fait l’objet d’un débat. Nous décrivons ici un protocole simple pour évaluer l’état oligomérique de MxA exprimé de manière endogène ou ectopique dans la fraction cytoplasmique de lignées cellulaires humaines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide non dénaturant (PAGE) en combinaison avec l’analyse par Western blot. Une étape critique du protocole est le choix des détergents pour éviter l’agrégation et/ou la précipitation de protéines particulièrement associées aux membranes cellulaires telles que MxA, sans interférer avec son activité enzymatique. Un autre aspect crucial du protocole est la protection irréversible des groupes thiols libres des résidus de cystéine par l’iodoacétamide pour empêcher les interactions artificielles de la protéine. Ce protocole est adapté à une évaluation simple de l’état oligomérique de MxA et permet en outre une corrélation directe de l’activité antivirale des mutants d’interface MxA avec leurs états oligomères respectifs.

Introduction

La structure quaternaire d'une protéine joue un rôle important dans de nombreux processus cellulaires. Les voies de signalisation, l' expression des gènes, et l' enzyme activation / désactivation tous comptent sur le bon assemblage des complexes protéiques ^1-4. Ce procédé également connu sous le nom d'homo- ou d'hétéro-oligomérisation est due à la liaison covalente irréversible ou des interactions protéine-protéine électrostatique et hydrophobe réversibles. Oligomérisation non seulement de diversifier les différents processus cellulaires sans augmenter la taille du génome, mais fournit également une stratégie de protéines pour construir....

Protocole

NOTE: Ce protocole est basé sur la non-dénaturant PAGE protocole précédemment publié ^12. Dans cette étude, l'état oligomérique de la protéine MxA a été évaluée en utilisant soit des cellules Vero ou des cellules surexprimant MXA A549 IFN-a stimulée endogène exprimant MXA. Le protocole décrit ci-dessous peut être utilisé pour analyser l'état d'une quelconque protéine oligomérique en plus MXA. Cependant, une optimisation supplémentaire peut être nécessaire.

1. Préparation de lysat cellulaire pour les non-dénaturant PAGE

NOTE: Pour analyser l'état oligomérique de la protéine MxA humaine d....

Résultats

Utilisation non-dénaturant PAGE, nous avons analysé l'état oligomérique de type sauvage humaine MXA, les dimères mutants d'interface MXA (R640A) et MXA (L617D), ainsi que le mutant d'interface monomère MXA (M527D) à partir de lysats cellulaires ^12. Les cellules ont été lysées dans un tampon contenant 1% d' octylphénoxypolyéthoxyéthanol (NP-40) et iodoacétamide pour assurer la solubilisation et la protection des groupes thiol libres protéine (voir figure 1). Comme décrit précéd.......

Discussion

Ici, nous décrivons une méthode simple qui permet la détermination rapide de l'état oligomérique des protéines exprimées dans des cellules de mammifères par PAGE non dénaturante suivie d'une analyse par transfert de Western. L'avantage majeur de cette approche est que l'état oligomérique d'une protéine donnée peut être déterminée à partir de lysats de cellules entières sans purification protéique préalable. Cela peut être important pour des protéines qui oligomériser ou exercent leur fonction en asso.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Slide-A-Lyzer MINI Unités de dialyse, 10K MWCO, 0,5 ml	Thermo Fisher Scientific	69570	Pré-équilibrage dans le tampon de dialyse (si l’élimination du glycérol est souhaitée) Peut être fabriqué par vous-même selon Fiala et al. 2011
4&ndash ; 15 % Mini-PROTEAN TGX Gels protéiques préfabriqués, 10 puits,	Bio-Rad	456-1083	Pré-exécuté dans le tampon de fonctionnement pour ajuster le système de tampon
cOmplete, Mini, sans EDTA	Roche  ;	11836170001	utiliser 1 comprimé par flacon de 50 ml
de PBS, pH 7,4 et 500 ml de solution Gibco	Thermo Fisher Scientific	14190-094
Ponceau S	Sigma-Aldrich	P7170	TOXIC portez des gants et protégez les yeux
NativeMark Unstained Protein Standard  ; 50   ; l	Invitrogen	P/N 57030	charge 5 & micro ; l/well
A549 cellules	ATCC	ATCC CCL185	Croissance dans un milieu de croissance (voir Tableau 1)
Cellules	Vero ATCC	ATCC CCL81	Croissance dans un milieu de croissance (voir Tableau 1)
anti-Mx1	Anticorps Novus Biologicals	H00004599_D01P	Utilisation à une dilution de 1:1 000
ECL Anticorps entiers anti-IgG de lapin, de raifort lié à la peroxydase (à partir de âne)	GE-Healthcare	NA934V	Utilisation à une dilution de 1:10 000
0,5 % Trypsine-EDTA (1x)  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; Life Technologies	Thermo Fisher	15400-054
Iodoacétamide   ; 5 g	Sigma-Aldrich	I-6125	stock  ; 100 mM
Bromphenolblue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies	Thermo Fisher Scientific	41966-029
Pen  ; Streptocoque 100 x  ;   ;   ;   ; 100ml  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; life technologies	Thermo Fisher Scientific	15140 - 130
Glutamax 100x Stock, 100 ml  ;   ;   ;   ; life technologies	Thermo Fisher Scientific	350500-038
Sérum fœtal de bovin, dialysé , US Origine 500 ml Gibco Lot :42G9552K	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Papier filtre en cellulose	Bio-Rad	1703965
PVDF blot  ; membrane	GE-Healthcare	10600022
Tris(hydroxyméthyl)aminométhane	Biosolve	0020092391BS
fluorure de sodium (NaF)	Sigma Aldrich	S-7920
NP-40	Calbiochem	492015
cOmplete, Mini, sans EDTA	Roche  ;
Tween 20	Calbiochem	6555204
CHAPS 10 % solution	Amresco	N907
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	43819
Glycine	Biosolve	0007132391BS
orthovanadate de sodium (Na3VO4)	Sigma Aldrich	450243
Glycérol	Sigma Aldrich	G7757
β ;-Glycérophospate	Sigma Aldrich	G9422
Lait en poudre	Migros/Suisse
Méthanol	Millipore	1.06009
Chlorure de sodium (NaCl)	Sigma Aldrich	71380
Chlorure de magnésium (MgCl2)	Amresco	288
Sulfate de dodécyle de sodium (SDS)	Sigma Aldrich	L4509
hydroxyde de sodium (NaOH)	Sigma Aldrich	S-8045

11836170001