Visualisation Fréquence Stromule avec Fluorescence Microscopy

Summary

Des protocoles pour étudier la dynamique des stromules des chloroplastes, les tubules remplis de stroma qui s’étendent à partir de la surface des chloroplastes, sont décrits.

Abstract

Les stromules, ou « tubules remplis de stroma », sont des extensions tubulaires étroites de la surface du chloroplaste qui sont universellement observées dans les cellules végétales mais dont les fonctions restent mystérieuses. Parallèlement à l’attention croissante portée au rôle des chloroplastes dans la coordination des réponses des plantes au stress, l’intérêt pour les stromules et leur relation avec la dynamique de signalisation des chloroplastes a augmenté ces dernières années, aidé par les progrès de la microscopie à fluorescence et des fluorophores protéiques qui permettent une visualisation rapide et précise de la dynamique des stromules. Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour tester la fréquence des stromules dans les chloroplastes épidermiques de Nicotiana benthamiana, un excellent système modèle pour étudier la biologie des stromules des chloroplastes. Nous fournissons également des méthodes pour visualiser les stromules des chloroplastes in vitro en extrayant les chloroplastes des feuilles. Enfin, nous décrivons des stratégies d’échantillonnage et des approches statistiques pour analyser les différences de fréquences des stromules en réponse à des stimuli, tels que le stress environnemental, les traitements chimiques ou le silençage génique. Les chercheurs peuvent utiliser ces protocoles comme point de départ pour développer de nouvelles méthodes d’expériences innovantes afin d’explorer comment et pourquoi les chloroplastes fabriquent des stromules.

Introduction

Les chloroplastes sont des organites dynamiques dans les cellules végétales responsables de la photosynthèse et d’une foule d’autres processus métaboliques. Les voies de signalisation du chloroplaste exercent également une influence significative sur la physiologie et le développement des plantes, en coordonnant les réponses des plantes au stress environnemental, aux agents pathogènes et même à^{la forme des feuilles de 1 à 6}. Récemment, les biologistes se sont intéressés à un aspect mal compris de la structure du chloroplaste : les stromules, des tubules très minces remplis de stroma qui s’étendent à partir de la surface du chloroplaste⁷.

Protocol

NOTE: Pour ce protocole, nous avons mis l' accent sur le dosage de la fréquence stromule dans l'épiderme de N. benthamiana laisse. Plusieurs lignées transgéniques stables ont été générés qui peuvent être utilisés à cette fin, y compris 35S _PRO: FNRtp: EGFP ¹³ et NRIP1: Cerulean ^6. Ces deux lignées montrent une expression robuste de fluorophores dans le stroma des chloroplastes des feuilles cultivées dans un large éventail de conditions. Alternativement, fluorophores chloroplastiques ciblées peuvent être transitoirement exprimés en N. benthamiana en utilisant Agrobacterium transforma....

Results

Ce protocole a été utilisé pour visualiser la fréquence stromule à jour et la nuit dans les cotylédons de jeune N. plantules benthamiana. Les tranches d'une pile z- ont été fusionnées en une seule image (figure 1A). Pour les besoins visuels, cette image était alors désaturée et inversée de telle sorte que stroma apparaît en noir (figure 1B). Les chloroplastes ont été marquées soit comme ayant aucun stromules (astérisque vert) o.......

Discussion

Lors de l'instruction stromules, trois facteurs importants doivent être pris en considération tout au long de: (i) la manipulation du tissu végétal doit être maintenu à un minimum absolu, (ii) le système expérimental doit être maintenue constante, et (iii) les stratégies d'échantillonnage doit être soigneusement planifiée pour assurer robuste, des données reproductibles sont analysées.

Stromules sont remarquablement dynamiques: ils peuvent prolonger et se rétracter rapidement devant .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
Microscope confocal à balayage laser  ;	Carl Zeiss Inc	Modèle : LSM710
Diacétate de carboxyfluorescéine (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879  ;
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	EMD	MX1458-6
Mélangeur Waring	Waring  ;	Modèle : 31BL92
Fiji	fiji.sc		Logiciel open-source pour l’analyse d’images biologiques