Ce manuscrit décrit plusieurs protocoles pour l'administration d'agents pharmacologiques pour les abeilles, y compris des méthodes non invasives simples pour les abeilles en vol libre, ainsi que des variantes plus invasives qui permettent le traitement des abeilles sobres localisé précis.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Manipulation neuropharmacologiques de Restrained et vol libre abeilles,
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les abeilles démontrent les capacités d'apprentissage étonnantes et le comportement social de pointe et de la communication. En outre, leur cerveau est petit, facile à visualiser et à étudier. Par conséquent, les abeilles ont longtemps été un modèle privilégié parmi les neurobiologistes et neuroethologists pour étudier les bases neurales du comportement social et naturel. Il est important, cependant, que les techniques expérimentales utilisées pour étudier les abeilles ne pas interférer avec les comportements à l'étude. À cause de cela, il a été nécessaire de développer une gamme de techniques pour la manipulation pharmacologique des abeilles. Dans cet article, nous démontrons des méthodes pour traiter les abeilles sobres ou en vol libre avec une large gamme d'agents pharmacologiques. Ceux-ci comprennent à la fois des méthodes non invasives telles que les traitements oraux et topiques, ainsi que des méthodes plus invasives qui permettent l'administration de médicaments précis, soit de manière systémique ou localisée. Enfin, nous discutons des avantages et des inconvénients de chaque méthode et de décrireobstacles et la meilleure façon de les surmonter communs. Nous concluons par une discussion sur l'importance d'adapter la méthode expérimentale aux questions biologiques plutôt que l'inverse.
Introduction
Depuis Karl von Frisch élucidé leur langue de danse 1, les abeilles sont restés une espèce d'étude populaire pour les chercheurs dans le comportement des animaux et de la neurobiologie. Ces dernières années , une myriade de nouvelles disciplines ont vu le jour à l'intersection de ces deux domaines, et plusieurs autres disciplines (par exemple, la biologie moléculaire, la génomique et l'informatique) se sont posés à côté d' eux. Cela a conduit à un développement rapide de nouvelles théories et des modèles pour comprendre comment le comportement résulte de l'activité au sein des systèmes nerveux. En raison du mode de vie unique, riche répertoire comportemental, et la facilité de manipulation expérimentale et pharmacologique, les abeilles sont restés à l'avant-garde de cette révolution.
Les abeilles sont utilisées pour étudier les questions neurobiologiques de base telles que celles d' apprentissage sous - jacente et de la mémoire 2,3, la prise de décision 4, olfactive 5 ou traitement visuel 6. Au cours des dernières années, le députéey abeille a même été utilisé comme modèle pour l' étude des sujets généralement réservés pour la recherche médicale, tels que les effets des drogues toxicomanogènes 7 - 11, le sommeil 12, le vieillissement 13, ou les mécanismes sous - jacents anesthésie 14.
Contrairement aux modèles génétiques classiques organismes (par exemple, D. melanogaster, C. elegans, M. musculus), il existe très peu d' outils génétiques disponibles pour manipuler les fonctions neurales dans les abeilles, bien que cela soit en train de changer 15. Au lieu de cela, des études d'abeilles ont surtout compté sur des manipulations pharmacologiques. Cela a été un grand succès; toutefois, la diversité de la recherche d'abeilles est telle que toute une gamme de procédés pour une administration pharmacologique sont nécessaires. La recherche avec des abeilles mellifères aborde très diverses questions, est étudiée par des chercheurs de différentes disciplines et d'horizons, et utilise une variété d'approches expérimentales. Beaucoup reseles questions arc exigent des abeilles à être soit en vol libre, interagir librement dans leur colonie, ou les deux. Cela peut rendre difficile de garder la trace des animaux de laboratoire individuels, et rend retenue ou cathétérisme irréalisable.
Pour tenir compte de la diversité de la recherche du miel d'abeille, une variété de méthodes d'administration de médicaments sont nécessaires, permettant une administration robuste et flexible tout en assurant que les profils pharmacocinétique et pharmacodynamique, invasivité de la méthode, et sa fiabilité, conviennent le paradigme en question. En raison de ces divers besoins, la plupart des groupes de recherche ont mis au point leurs propres méthodes d'administration de médicaments uniques. Jusqu'à présent, cela a été une force de la communauté de recherche des abeilles; elle a conduit au développement de réseaux de méthodes permettant l'administration du même médicament dans des circonstances différentes. Notre but ici est de ne pas développer une seule méthode normalisée pour les manipulations pharmacologiques des abeilles, mais plutôt de mettre en évidence les méthodes quise sont avérés particulièrement efficaces, et aider les chercheurs à adopter ces. Nous discutons des principes de base de la façon dont ils travaillent, ainsi que leurs avantages et leurs inconvénients.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
1. Drug Administration pour Bees harnachés
- Le traitement oral
- Préparer une solution 1,5 M de saccharose en mélangeant 257 g de saccharose par 500 ml d'eau (il est plus facile à dissoudre cette quantité de saccharose dans de l'eau bouillante). Stockez solution de saccharose à 4 ° C jusqu'à utilisation.
REMARQUE: solution sucrose fournit un environnement très accueillant pour certains micro-organismes, et devient ainsi facilement contaminés et désagréable pour les abeilles. une solution de saccharose en vrac peut être aliquote et stocké à -20 ° C jusqu'à utilisation. - Décider d'une dose de médicament approprié (comment y parvenir, est abordée dans la section de discussion ci - dessous), et préparer une solution telle que la dose préférée de médicament est dissous dans 20 ul solution de saccharose (par exemple, pour délivrer 20 ug, diluer la drogue à un raison de 1 mg / ml). abeilles Harnais selon Felsenberg et al. (2011) 16. Effectuez cette opération au moins 12 heures avant le traitement de la drogue pour faire en sorte que les abeilles ne sont plus stressés out de tirer parti lorsque la solution de médicament est présenté.
NOTE: Pour des résultats plus cohérents, il est préférable de mourir de faim les abeilles (en plaçant les abeilles attelés dans un incubateur à 34 ° C et 70% d'humidité) O / N. - En utilisant une micropipette, touchez une baisse de 1,5 M d'eau de saccharose à l'antenne d'une abeille harnaché. Lorsque le proboscis est prolongée, touchez une gouttelette de 20 pi de 1,5 M de saccharose contenant le médicament directement à la trompe de l'abeille. Assurez-vous que l'abeille consomme tout. Comme le contrôle du véhicule en utilisant 1,5 M solution de saccharose sans médicaments ajoutés.
NOTE: La quantité de solution de saccharose peut avoir besoin d'être ajustée en fonction de plans expérimentaux. Si appétitif conditionné est destiné, nourrir les abeilles juste avant la formation va interférer avec la réactivité des abeilles. - Jeter ou mis de côté les abeilles qui ne consomment pas la totalité du saccharose.
NOTE: Si un grand nombre d'abeilles ne parviennent pas à boire la solution de saccharose, le programme d'alimentation pourrait être nécessaire d'ajuster.
- Préparer une solution 1,5 M de saccharose en mélangeant 257 g de saccharose par 500 ml d'eau (il est plus facile à dissoudre cette quantité de saccharose dans de l'eau bouillante). Stockez solution de saccharose à 4 ° C jusqu'à utilisation.
- Injection dans le thorax
- Préparer la drogue dans le miel d' abeille Ringer 17 comme suit:
- Et mélanger l' autoclave 7,45 g de NaCl, 0,448 g de KCl, 0,812 g de MgCl2, 0,735 g de CaCl2, 54,72 g de saccharose, 4,95 g de D-glucose et 2,48 g d' HEPES dans 1000 ml d'eau. Soyez prudent lors de l'enregistrement de la sonnerie comme il est facilement contaminé. Aliquoter et stocker Ringer à -20 ° C jusqu'à utilisation.
- Dissoudre le médicament dans une solution de Ringer, puis diluée de telle sorte que la quantité souhaitée est présente dans 5 ul. A titre d'exemple, si les abeilles doivent être traitées avec 5 ug d'un médicament, 1 g peut être initialement dissous dans 1 ml de Ringer, avant d'être dilué 1: 1000 dans une solution de Ringer pour une finale de 1 pg / pl.
NOTE: Vous pouvez également disponible dans le commerce PBS (Phosphate-tamponnée Salin) peut être utilisé au lieu de la solution de Ringer.
- Faire un micro-scalpel en cassant le coin d'une lame à double tranchant rasoir avecun porte-lame. Fixer le fragment de lame à un porte-lame de sorte qu'il fasse une belle lame avec un point d'extrémité pointue.
- En vertu d'un stéréomicroscope, utiliser avec précaution le micro-scalpel pour découper un trou de 2 mm au-dessus du scutellum, à côté du processus de l'aile postérieure du thorax d'une abeille. Évitez de couper trop profond car cela pourrait blesser les muscles de vol, et prendre soin d'éviter les charnières de l'aile. Idéalement, seulement couper trois côtés, de sorte que le volet de la cuticule peut ensuite être replié pour fermer le site de la lésion.
- En utilisant une micropipette, dépôt de 5 μlL Ringer (ou PBS) contenant le médicament sur le dessus du trou dans le thorax. surveiller avec soin sous un microscope afin d'assurer la totalité de goutte est absorbée dans l'hémolymphe. Utilisez Ringer (ou PBS) comme un contrôle du véhicule.
- Si possible, déplacer le volet de la cuticule en arrière sur le trou. Après 5-10 heures, il rattachez et sceller.
Remarque: Comme une alternative à cette technique, injecter 1 ul directement dans le thorax à l'aide d'une seringue en verre, après l'ouverture d'une small trou au milieu du frein (ligne transversale dans la région postérieure du scutellum) avec une aiguille de seringue (diamètre: 0,6 mm, G 23). Cela évite la nécessité de réduire d'abord le thorax avec un scalpel et le site d'injection est plus petit, mais cette méthode va quitter le site d'injection exposée.
- Préparer la drogue dans le miel d' abeille Ringer 17 comme suit:
- injection ocellus
NOTE: Ceci est une méthode appropriée pour délivrer des molécules à travers la capsule de la tête, dans l'hémolymphe.- Préparer les médicaments comme en 1.2.1, mais ajuster les concentrations de médicament de telle sorte que la dose souhaitée sera contenue dans 1 pl de Ringer ou PBS (moins de volume peut être absorbé par le trou ocellus que par le thorax).
- Préparer un micro-scalpel comme dans 1.2.2. En vertu d'un stéréomicroscope, verrouiller la tête d'une abeille harnaché en place en remplissant le sillon du cou avec de la cire. Utilisez à faible température de fusion de la cire (par exemple, la cire dentaire) afin d'éviter d' endommager les récepteurs olfactifs antennaires ou d' autres cellules qui peuvent être important pour évaluer le comportement (par exemple, l' apprentissage olfactif). Ensuite, retirez soigneusement la lentille de l'ocelle médian en insérant l'extrémité de la micro-scalpel sous la lentille et de briser doucement la lentille libre de la capsule de la tête.
NOTE: Il est également possible de placer la cire avec soin sur les antennes pour empêcher le mouvement. - Pipetter prudemment médicament sur le trou de ocellus. Attendez jusqu'à ce que tout est pris dans la capsule de la tête. Retirer la cire dentaire des antennes et laissez l'abeille se reposer pendant un certain temps avant de poursuivre la procédure expérimentale. Utilisez Ringer (ou PBS) comme un contrôle du véhicule.
- Injection dans le tractus ocellaire
NOTE: Le tube ocellaire contient de grandes fibres, la connexion à la plupart des régions du cerveau central 18. Cette méthode de traitement permet d'appliquer les composés au cerveau seulement, mais de ne pas cibler les sous-régions spécifiques du cerveau.- Préparer l'abeille comme dans 1.3.2. et retirer la lentille du ocelle médian avec le tip d'un micro-scalpel comme dans 1.3.3.
NOTE: Cela peut être fait jusqu'à 2 heures avant l'injection. D'après notre expérience, les abeilles nourris sont mieux en mesure de faire face à ce type de chirurgie que les abeilles affamées - Remplir une seringue en verre de 10 pi muni d'un petit calibre (par exemple, 33, diamètre: 210 pm) avec aiguille solution médicamenteuse préparée comme au point 1.3.1.
- L'utilisation d'un micromanipulateur manuel, insérez la pointe de la seringue à travers la rétine ocellaire dans la capsule de la tête à une profondeur de 50 um et injecter 250 nl de solution.
- Après utilisation, rincer la seringue 3 fois avec de l'eau distillée, puis 3 fois avec 75% d'éthanol.
- Préparer l'abeille comme dans 1.3.2. et retirer la lentille du ocelle médian avec le tip d'un micro-scalpel comme dans 1.3.3.
- Microinjection en particulier des structures cérébrales
NOTE: En plus des traitements systématiques mentionnés ci-dessus, il est possible de réaliser des micro-injections dans certaines structures du cerveau. Ceci permet une manipulation pharmacologique d'une ou plusieurs régions du cerveau, tout en laissant les autres intacts. Cela marchemieux avec les régions du cerveau qui sont faciles à reconnaître à partir de la surface du cerveau antérieur (par exemple, les lobes antennaires, champignon calices du corps ou lobes verticaux, ou les lobes optiques), mais d' autres régions ont été ciblées. S'il vous plaît noter que l'orientation (antérieure / postérieure, dorsal / ventral) se réfère à l'axe du corps, plutôt que de 19 neuraxis.- Préparer le médicament dans Ringer ou PBS de la même manière que dans 1.2.1, l' ajout d' un fluorescent (par exemple, 0,5 mg / ml de dextran, Alexa 546 ou 568 fluor) ou un colorant non fluorescent (par exemple, 1 mM de bleu de méthylène).
NOTE: L'ajout d'un colorant fluorescent permettra la vérification de l'emplacement d'injection après l'expérience est terminée (en utilisant la microscopie confocale, après dissection du cerveau), alors que les colorants non fluorescents permettent la surveillance directe pendant l'expérience. - Pour pipettes en verre pour injection, insérer des capillaires en verre de diamètre correct dans des pinces de maintien d'un extracteur d'électrode (1,0 mm pour la cale normeer inclus pour le microinjecteur mentionné dans la liste des matériaux). Régler les paramètres de traction et de la chaleur pour produire un environ 0,5 cm de long bout (paramètres seront différents pour chaque tirage, même si le même modèle est utilisé).
NOTE: Idéalement, les deux pipettes tiré d'un verre devrait avoir la même longueur et la forme, de sorte que les deux peuvent être utilisés. - En vertu d'un stéréomicroscope, briser les conseils pour obtenir un diamètre extérieur d'environ 10-15 um, basée sur l'estimation visuelle en utilisant une échelle sur un réticule inséré dans l'oculaire. Les étapes de l'échelle sont définies par le fabricant et peuvent être corrigées pour le grossissement utilisé.
- Ensuite, remplissez les pipettes en verre avec la solution à injecter. Si capillaires en verre avec des filaments sont utilisés, remplir la pipette en plaçant la face arrière dans la solution médicamenteuse, sinon remplir des informations en utilisant des conseils microloader.
- Insérer la pipette en verre rempli dans le support capillaire d'un micro-injecteur qui est commandé par un mi manuel ou électroniquecromanipulator.
- Calibrer le micro-injecteur pour injecter le volume désiré (0,5 à 2 nl, en fonction de la taille de la structure du cerveau ciblée). Pour cela, injecter directement dans une petite boîte de Pétri contenant de l'huile minérale et de mesurer le diamètre de la gouttelette avec le réticule. Modifier les paramètres jusqu'à ce que le volume désiré soit atteint.
- Fixer la tête d'une abeille attelée à la cire dentaire douce comme dans 1.3.2, avant de couper une ouverture dans la partie antérieure de la capsule de la tête, en utilisant un micro-scalpel, avec trois coupes: un juste en dessous du ocelle médian (ventrale), un à la frontière du droit ou de l'œil gauche et l'autre au-dessus de l'antenne tiges (dorsale). Utilisez un morceau de cire dentaire pour maintenir le volet ouvert en place.
- Poussez doucement les glandes et la trachée située au-dessus du cerveau en utilisant une pince fine côté, puis faire une petite rupture dans la neurilemma (membrane très mince autour du cerveau) au-dessus de la structure du cerveau ciblée.
NOTE: Si beaucoup d'abeilles sont à traiter à la fois, cette procédurepeut être effectuée plus tôt; Cependant, attention à ne pas laisser les abeilles dans cet état trop longtemps (pas plus de 30 min), que leurs cerveaux pourraient dessécher. - Insérez la pointe dans la région du cerveau désirée, et d' ajuster la profondeur perpendiculaire à la surface du cerveau (par exemple, 60 um pour calices du corps de champignon). Injecter le volume préréglé. Pour les régions du cerveau latérales, injecter bilatéralement (ie faire une injection à chaque hémisphère). Si un colorant non fluorescent est utilisé, assurer l'injection produite dans la bonne région sur l'observation pendant l'injection. Si un colorant fluorescent est utilisé faire la même chose sous une lumière fluorescente en utilisant un stéréomicroscope avec un système de fluorescence de visualisation.
- Ensuite, placez le rabat ouvert en arrière sur la tête de l'abeille. Faire fondre un cristal de eicosane, qui est d'environ 1 mm de diamètre, en utilisant un fil mince enroulé autour de la pointe d'un fer à souder micro (température de fusion est de 35-37 ° C) et sceller les coupes. Cela permettra de réduire considérablement la mortalité.
- Relachez leabeille du harnais pour l' analyse comportementale (mais voir la discussion), ou de garder dans le harnais pour les expériences sur les abeilles sobres - par exemple, l' extension du proboscis réflexe (PER) à tester 20.
- Si un colorant fluorescent a été utilisée, s'assurer que l'injection a atteint la zone d'intérêt après que l'expérience est terminée en utilisant un microscope confocal à balayage laser (figure. 1).
NOTE: Ceci est particulièrement utile lors du ciblage des zones cérébrales profondes (où il serait difficile de voir colorant nonfluorescent pendant la phase d'injection).
- Préparer le médicament dans Ringer ou PBS de la même manière que dans 1.2.1, l' ajout d' un fluorescent (par exemple, 0,5 mg / ml de dextran, Alexa 546 ou 568 fluor) ou un colorant non fluorescent (par exemple, 1 mM de bleu de méthylène).
2. drogues Méthodes d'administration pour les abeilles en vol libre
- Le traitement oral
- Préparer des médicaments de la même manière que dans les étapes 1.1.1-1.1.2. Ajouter une solution de médicament à un dispositif d'alimentation et placer au réfrigérateur pour le stockage.
REMARQUE: Tout chargeur fera, comme un bouchon de la bouteille à l'envers ou un pot inversé sur papier de soie. - Former les abeilles à un dispositif d'alimentation par gravité contenant 1 M ou 0,5M solution de saccharose en plaçant un dispositif d'alimentation à proximité de la ruche. Une fois que les abeilles commencent à la recherche de nourriture à la mangeoire, se déplacer peu à peu plus loin jusqu'à ce qu'il soit à une distance confortable pour éviter d'être piqué (minimum 5 m).
- Peinture de marques abeilles afin de garder une trace des abeilles individuelles. Faites une liste de toutes les combinaisons de couleurs qui seront utilisées. Quand une abeille se pose à la mangeoire, marquent soigneusement son abdomen avec deux couleurs, et de faire une note sur la liste que la combinaison est prise.
- Remplacez le chargeur de gravité pour une alimentation contenant la solution de médicament / saccharose. Prenez note des abeilles marquées qui visitent la mangeoire. Attrapez toute abeille banalisée visitant le chargeur comme les abeilles sont les recruteurs prolifiques, et le nombre d'abeilles qui visitent le chargeur drogué peut rapidement devenir hors de contrôle. Cela est particulièrement problématique si la même expérience doit être effectuée plusieurs jours de suite, que les abeilles naïfs pourraient ne plus être naïf.
NOTE: Comme une alternative à la formation des abeilles individuelles à un dispositif d'alimentation, auteur précédentes ont alimenté avec succès l' eau de sucrose drogue lacées à toute une ruche 21 - 23.
- Préparer des médicaments de la même manière que dans les étapes 1.1.1-1.1.2. Ajouter une solution de médicament à un dispositif d'alimentation et placer au réfrigérateur pour le stockage.
- Le traitement topique
NOTE: L'objectif est de dissoudre le composé d'intérêt dans un solvant qui peut pénétrer l'insecte cuticule cireuse. Différents solvants peuvent être utilisés à cette fin. Les plus couramment utilisés comprennent l'acétone, le diméthylformamide (DMF) et le diméthylsulfoxyde (DMSO).- Évaluer ce qui fonctionne le mieux solvant pour le composé à portée de main. Si un phénotype fort est attendu d'un surdosage (par exemple, la paralysie ou la mort), les abeilles traiter (étape 2.2.2) avec une dose élevée (par exemple, 20 pg de cocaïne 7) dissous dans chacun des différents solvants et surveiller attentivement le temps jusqu'à ce que la paralysie ou la mort.
- L' utilisation d' un microcapillaire 1 pi (ou une microseringue, qui peut être monté sur un distributeur de répétition approprié) et porte-microcapillaire, tirer 1 pl de la solution de médicament (par exemple, 381, g / pl de la cocaïne) dans le capillaire. Expulser la goutte, et peindre soigneusement sur le thorax d'une abeille marquée. Couvrir aussi grande d'une zone d'un possible avec la solution, plutôt que de laisser une goutte solide, comme l'abeille est alors susceptible de le toiletter off. Veillez à ne pas permettre au composé de contacter l'aile charnières, ou cela peut soutirer le thorax et le long des ailes où il va évaporer sans être absorbé dans l'hémolymphe.
REMARQUE: En fonction de l'objectif de la recherche, cette méthode peut également être utilisé pour administrer des médicaments à l'abdomen de l'abeille. Cependant, les médicaments atteignent le SNC plus rapidement et en plus grande quantité lorsqu'il est appliqué sur le thorax méthode 24 .Cet fonctionne aussi bien avec harnaché comme avec les abeilles en vol libre.
- traitement volatilisé
- Dissoudre les médicaments (auparavant cette méthode a été utilisée pour fournir de la cocaïne pour les abeilles 10) dans 100% d' éthanol. Pour assurer la solubilité, ne pas utiliser un chlorhydrate ou d'autres formes de sel de lamédicament si possible. Lorsque vous faites une dilution préparer pour que le montant à être livré à une abeille est présente dans 100 pi. Utiliser de l'éthanol pur sous la forme d'un contrôle du véhicule.
- Pour créer un filament, utiliser la même procédure que McClung et Hirsh 25.
- Brièvement expliqué: enrouler le fil de nichrome étroitement autour d'un clou et le joindre à deux fils électriques (un à chaque extrémité du filament). Retirer le clou. La bobine nichrome restante est désignée comme le filament.
- Enfiler les deux fils à travers des trous percés dans soigneusement le couvercle d'un tube de centrifugation de 50 ml, ce qui doit être résistant à la température choisie. Coller les fils en place avec du silicone liquide.
NOTE: Cela rendra étanche à l'air du tube. Cela est essentiel pour éviter l'exposition secondaire à l'expérimentateur et veiller à ce que les abeilles sont traitées avec la dose appropriée.
- Attacher les fils conduisant au filament à une source d'alimentation. À l'aide d'un thermocouple pour mesurer la température dele filament, l'expérience avec tension différente / combinaisons actuelles jusqu'à ce que celui qui se traduit par un profil de température approprié pour le médicament en question, idéalement, qui permet pendant 10 sec du chauffage ou moins. Ceci est très important, se référer à la documentation pertinente (par exemple, pour que la cocaïne se volatiliser , il doit être chauffé à au moins 200 ° C, mais à des températures supérieures à 350 ° C , il se décompose en composés secondaires 26).
- Pipetter prudemment 100 ul de médicament contenant une solution d'éthanol sur le filament. Passez le liquide sur la surface autant de filaments que possible car cela va augmenter l'efficacité de l'évaporation. Laisser le filament exposé à la température ambiante jusqu'à ce que tout l'éthanol est évaporé.
NOTE: Si l'éthanol est pas suffisamment évaporé, les abeilles seront traités à la fois avec le médicament de choix et de l'éthanol. Les abeilles sont extrêmement sensibles à l'éthanol, et certains médicaments ont des interactions synergiques avec de l'éthanol, ce qui polarise exles résultats expérimentaux. - Une fois que l'éthanol a complètement évaporé (médicament précipité peut généralement être vu sur le filament sec sous un microscope), attraper une abeille en vol libre dans un tube de 50 ml. Bien refermer le couvercle contenant le filament.
- Allumez la puissance pendant 10 secondes, tournez la mise hors tension et attendre un autre 50 sec (pour permettre au composé volatilisé refroidir et ainsi de condenser ou de dépôt). Relâchez l'abeille.
REMARQUE: Bien que cette méthode de traitement fonctionne très bien pour les abeilles en vol libre, il peut être utilisé tout aussi efficacement avec les abeilles attelés. Il suffit de fixer l'abeille harnaché dans un tube de 50 ml. Recharger le filament comme décrit dans 2.3.4 entre les abeilles. Pour un débit élevé, plusieurs filaments peuvent être utilisés en parallèle.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Une sélection de résultats représentatifs pour les méthodes décrites ci-dessus sont présentés, principalement pour démontrer que les méthodes permettent aux agents pharmacologiques pour atteindre le cerveau et influent sur le comportement des abeilles.
Effets spécifiques sur les processus du cerveau peuvent être facilement obtenues après l'injection thorax.
Parce q...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Les méthodes décrites ci-dessus permettent un traitement simple, efficace et robuste soit en vol libre ou les abeilles attelés. Ces méthodes sont compatibles avec de nombreux paradigmes expérimentaux et les questions biologiques (tableau 1). Toutes les méthodes de vol libre peut facilement être appliqué pour les abeilles attelés. L'inverse est moins de succès, cependant, puisque la retenue temporaire et les méthodes de traitement invasives peuvent souvent compromettre la capacité de vol des abeilles...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce projet a été financé par DP0986021 de subvention ARC et 585442 subvention NHMRC. ABB est soutenu par une bourse ARC Future Fellowship (FT140100452). JAP est soutenu par une bourse iMQRES décernée par l’Université Macquarie et par un DAAD-Doktorandenstipendium décerné par l’Office allemand d’échanges universitaires. JMD est soutenu par le CNRS et l’Université Paul Sabatier.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Saccharose | Sigma-Aldrich | S8501 | Tout fournisseur fera |
| Chlorure de sodium | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Chlorure | de potassium Sigma-Aldrich | P9333 ; | |
| Chlorure de magnésium hexahydraté | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Chlorure de calcium dihydraté | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Dextrose monohydraté | Sigma-Aldrich | 49159 | |
| Tampon phosphate salin (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Cire de protection | Dentaurum | 124-305-00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| diméthylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| 95 % Éthanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Capillaire en verre | WPI | 1B100F-3 | |
| 23 G Aiguille NanoFil | WPI | NF33BV-2 | |
| Forsceps très fin | Dumont | 0208-55-PO | |
| Électrode extracteur | SRI | 2001 | |
| FemtoJet Microinjecteur | Eppendorf | 5247 000.01 | |
| Eicosane | Sigma-Aldrich | 219274 | |
| micromanipulateur manuel | Brinkmann Instrumentenbau | MM-33 | |
| Micromanipulateur électronique | Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik | Unité junior Stéréomicroscope XYZ | |
| Leica | M80 | ||
| Fer à souder | Weller | WESD51 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546, 10 000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22911 | |
| Dextran, Alexa Fluor 568, 10 000 MW | ThermoFisher Scientific | D-22912 | |
| petite boîte de Pétri | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| Sigma-Aldrich | M5904 | ||
| 50 ml Tube à centrifuger | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| Australian Entomological Supplies Porte-lame | |||
| et brise-lames | Australian Entomological Supplies | E130 | |
| Lame | de rasoir à double tranchant en plumesThermoFisher Scientific | 50-949-135 | |
| Fil | N’importe quel fournisseur fera | ||
| Fils électriques N’importe | quel fournisseur fera Peinture | ||
| pour modèle | Tamiya USA | Dépend de la couleur | |
| Distributeur répétitif | Hamilton company | PB-600-1 | |
| Seringue en verre | WPI | NANOFIL | |
| système de visualisation par fluorescence | Nightsea | SFR-GR | |
| réticule | ProSciTech | S8014-24 | |
| microcapillaire avec support | Drummond | 1-000-0010 | |
| Silicone | Tout fournisseur fera | ||
| Thermocouple | Digitech | QM-1324 | |
| Micropipette | Eppendorf |
Références
- Frisch, K. . von B. ees Their Vision, Chemical Senses, and Language. , Cornell University Press. Itacha, NY. (1971).
- Giurfa, M. The amazing mini-brain: lessons from a honey bee. Bee World. 84 (1), 5-18 (2003).
- Giurfa, M. Behavioral and neural analysis of associative learning in the honeybee: a taste from the magic well. J. Comp. Physiol. 193 (8), 801-824 (2007).
- Perry, C. J., Barron, A. B. Honey bees selectively avoid difficult choices. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (47), 19155-19159 (2013).
- Giurfa, M., Sandoz, J. -C. Invertebrate learning and memory: Fifty years of olfactory conditioning of the proboscis extension response in honeybees. Learn. Mem. 19 (2), 54-66 (2012).
- Srinivasan, M. V. Honey bees as a model for vision, perception, and cognition. Annu. Rev. Entomol. 55, 267-284 (2010).
- Søvik, E., Cornish, J. L., Barron, A. B. Cocaine tolerance in honey bees. PLoS One. 8 (5), e64920(2013).
- Søvik, E., Barron, A. B. Invertebrate models in addiction research. Brain. Behav. Evol. 82 (3), 153-165 (2013).
- Søvik, E. Reward processing and responses to drugs of abuse in the honey bee, Apis mellifera. , Macquarie University. Australia. November (2013).
- Søvik, E., Even, N., Radford, C. W., Barron, A. B. Cocaine affects foraging behaviour and biogenic amine modulated behavioural reflexes in honey bees. Peer J. 2, e662(2014).
- Abramson, C. I., Stone, S. M., et al. The development of an ethanol model using social insects I: behavior studies of the honey bee (Apis mellifera L.). Alcohol. Clin. Exp. Res. 24, 1153-1166 (2000).
- Sauer, S., Kinkelin, M., Herrmann, E., Kaiser, W. The dynamics of sleep-like behaviour in honey bees. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 189 (8), 599-607 (2003).
- Münch, D., Kreibich, C. D., Amdam, G. V. Aging and its modulation in a long-lived worker caste of the honey bee. J. Exp. Biol. 216 (Pt 9), 1638-1649 (2013).
- Cheeseman, J. F., Winnebeck, E. C., et al. General anesthesia alters time perception by phase shifting the circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. , (2012).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. Behavioural pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (47), e2282(2011).
- Burger, H., Ayasse, M., Dötterl, S., Kreissl, S., Galizia, C. G. Perception of floral volatiles involved in host-plant finding behaviour: Comparison of a bee specialist and generalist. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 199 (9), 751-761 (2013).
- Pan, K. C., Goodman, L. J. Ocellar projections within the central nervous system of the worker honey bee, Apis mellifera. Cell Tissue Res. 176 (4), 505-527 (1977).
- Ito, K., Shinomiya, K., et al. A systematic nomenclature for the insect brain. Neuron. 81, 755-765 (2014).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schäfer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J. Comp. Psychol. 97 (2), 107-119 (1983).
- Barron, A. B., Robinson, G. E. Selective modulation of task performance by octopamine in honey bee (Apis mellifera) division of labour. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 191 (7), 659-668 (2005).
- Schulz, D. J., Sullivan, J. P., Robinson, G. E. Juvenile Hormone and Octopamine in the Regulation of Division of Labor in Honey Bee Colonies. Horm. Behav. 42 (2), 222-231 (2002).
- Schulz, D. J., Elekonich, M. M., Robinson, G. E. Biogenic amines in the antennal lobes and the initiation and maintenance of foraging behavior in honey bees. J. Neurobiol. 54 (2), 406-416 (2003).
- Barron, A. B., Vander Meer, R. K., Maleszka, J., Robinson, G. E., Maleszka, R. Comparing injection, feeding and topical application methods for treatment of honeybees with octopamine. J. Insect Physiol. 53 (2), 187-194 (2007).
- McClung, C., Hirsh, J. Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila. Curr. Biol. 8 (2), 109-112 (1998).
- Martin, B. R., Lue, L. P., Boni, J. P. Pyrolysis and volatilization of cocaine. J. Anal. Toxicol. 13 (3), 158-162 (1989).
- Lefer, D., Perisse, E., Hourcade, B., Sandoz, J. -C., Devaud, J. -M. Two waves of transcription are required for long-term memory in the honeybee. Learn. Mem. 20 (1), 29-33 (2012).
- Urlacher, E., Soustelle, L., et al. Honey Bee Allatostatins Target Galanin/Somatostatin-Like Receptors and Modulate Learning: A Conserved Function? PLoS One. 11 (1), e0146248(2016).
- Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera). J. Neurosci. 25 (18), 4485-4492 (2005).
- Barron, A. B., Maleszka, R., Helliwell, P. G., Robinson, G. E. Effects of cocaine on honey bee dance behaviour. J. Exp. Biol. 212 (2), 163-168 (2009).
- Devaud, J. -M., Papouin, T., Carcaud, J., Sandoz, J. -C., Grünewald, B., Giurfa, M. Neural substrate for higher-order learning in an insect: Mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proc. Natl. Acad. Sci. , 1-9 (2015).
- Vergoz, V., Roussel, E., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Aversive learning in honeybees revealed by the olfactory conditioning of the sting extension reflex. PLoS One. 2 (3), e288(2007).
- Henry, M., Béguin, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), 348-350 (2012).
- Søvik, E., Perry, C. J., LaMora, A., Barron, A. B., Ben-Shahar, Y. Negative impact of manganese on honeybee foraging. Biol. Lett. 11 (3), 20140989(2015).
- Farooqui, T., Vaessin, H., Smith, B. H. Octopamine receptors in the honeybee (Apis mellifera) brain and their disruption by RNA-mediated interference. J. Insect Physiol. 50 (8), 701-713 (2004).
- Guo, X., Su, S., et al. Recipe for a Busy Bee: MicroRNAs in Honey Bee Caste Determination. PLoS One. 8 (12), e81661(2013).
- Cristino, A. S., Barchuk, A. R., et al. Neuroligin-associated microRNA-932 targets actin and regulates memory in the honeybee. Nat. Commun. 5, 5529(2014).
- Vargaftig, B. B., Coignet, J. L., de Vos, C. J., Grijsen, H., Bonta, I. L. Mianserin hydrochloride: Peripheral and central effects in relation to antagonism against 5-hydroxytryptamine and tryptamine. Eur. J. Pharmacol. 16 (3), 336-346 (1971).
- Beggs, K. T., Tyndall, J. D. A., Mercer, A. R. Honey bee dopamine and octopamine receptors linked to intracellular calcium signaling have a close phylogenetic and pharmacological relationship. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Matsumoto, Y., Menzel, R., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Revisiting olfactory classical conditioning of the proboscis extension response in honey bees: a step toward standardized procedures. J. Neurosci. Methods. 211 (1), 159-167 (2012).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
