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DOI :

10.3791/54697

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25 octobre 2016

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1Department of Immunology, University of Toronto, 2Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour produire des récepteurs de cellules T spécifiques de l'antigène (TCR) par couplage du TCRa ou TCRβ d'un TCR existant, possédant l'antigène de la spécificité d'intérêt, avec hemichain complémentaire du répertoire des récepteurs des cellules T périphériques. Les TCR de novo générés conservent l' antigène de spécificité avec une affinité variable.

Résumé

Les récepteurs des cellules T (TCR) sont utilisés cliniquement pour diriger la spécificité des lymphocytes T à cibler des tumeurs en tant que modalité prometteuse de l'immunothérapie. Par conséquent, le clonage des TCR spécifiques de divers antigènes associés à des tumeurs a été l'objectif de nombreuses études. Pour provoquer une réponse efficace des lymphocytes T, le TCR doit reconnaître l'antigène cible avec une affinité optimale. Cependant, le clonage tel TCR a été un défi et beaucoup disponibles TCR possèdent une affinité sous-optimale pour l'antigène correspondant. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode de clonage de novo TCR spécifiques de l'antigène à haute affinité en utilisant des TCR existants en exploitant hemichain centricity. Il est connu que pour certains TCR, chacun TCRa ou TCRβ hemichain ne contribuent également à la reconnaissance de l'antigène, et le hemichain dominant est désigné sous le nom hemichain centrée. Nous avons montré que par l'appariement du hemichain centric avec des contre-chaînes différentes de la contre-chaîne d'origine, nous sommes en mesure de maintenir l'antigène specificity, tout en modulant sa force d'interaction pour l'antigène correspondant. Ainsi, le potentiel thérapeutique d'un TCR donné peut être améliorée en optimisant l'appariement entre les centriques et la contre-hemichains.

Introduction

Les récepteurs des cellules T (TCR) sont des récepteurs immunitaires adaptatives hétérodimères exprimés par les lymphocytes T, constitués d'une chaîne TCRa et TCRβ. Elles sont produites par un réarrangement somatique de V (D) des segments de gène J, qui produit un répertoire très diversifié capable de reconnaître des configurations pratiquement illimitées de complexes HLA / peptide. Cliniquement, les cellules T modifiées pour exprimer clonotypique spécifiques des TCR pour des antigènes associés à une tumeur ont montré une efficacité dans une variété de cancers 1. Cependant, de nombreux clones de TCR à cet effet, ne disposent pas une affinité suffisante pour l'antigène d'intérêt, ce qui limite leur application thérapeutique.

Ici, nous décrivons une méthode pour surmonter cette limitation pour les TCR existants en exploitant la chaîne Centricity. Il a été rapporté que l' un hemichain TCR pourrait jouer un rôle plus important dans la reconnaissance de l'antigène cible 2, appelé ici centricity. analyses structurales de Crystal ont montré que l'une centréehemichain d'un TCR pourrait représenter la majorité de l'empreinte sur le CMH / peptide complexe 3,4. En utilisant ce concept, nous avons déjà démontré que le SIG35α TCRa peut jumeler avec un répertoire varié de chaînes TCRβ et maintenir la réactivité contre le peptide MART1 27-35 présenté par HLA-A2 5. Des résultats similaires ont été obtenus avec le RCT TAK1, où le hemichain TCRβ centré sur apparié avec différentes chaînes TCRa et maintenu la réactivité du peptide 235-243 WT1 présenté par HLA-A24 6. Deux MART1 et WT1 sont des antigènes associés aux tumeurs. Chain-centricity a également été appliquée à l' étude reconnaissance de l' antigène des cellules tueuses naturelles (iNKT) TCR invariants CD1d-restreintes, en associant l'invariant chaîne Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRa des TCR iNKT humaines avec différentes chaînes Vβ11 TCRβ 7.

Dans tous les cas, nous avons été en mesure de générer un répertoire de novo de TCR par transduction du TCR hemichain centrée sur les cellules T du sang périphérique, où le hemichain introduit jumelé avec le TCRa endogène ou TCRβ contre-chaînes. En substance, la hemichain centrée sert d'appât qui peut être utilisé pour identifier les contre-chaînes appropriées, qui forment ensemble une fois appareillé TCR qui maintiennent la spécificité de l'antigène d'intérêt, mais variant d'affinité. De ces nouveaux répertoires, nous avons été en mesure d'isoler TCR clonotypiques avec une meilleure résistance à l'interaction contre l'antigène cible par rapport à TCR pré-existantes. Par conséquent, nous croyons que cette méthode permettra d'accélérer le pipeline d'identifier les TCR optimales pour l'application clinique.

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Protocole

1. Préparation de rétrovirale codant pour TCR Hemichain d'intérêt

  1. Linéariser pMX vecteur pour permettre l'insertion d'un gène de TCR dans des étapes ultérieures. Digérer l'ADN du plasmide avec EcoRI et Notl enzymes de restriction à 37 ° C pendant 3 heures ( voir le tableau 1) 8.
  2. Effectuer une électrophorèse du plasmide digéré sur un gel d'agarose à 1,2%. Bande d'accise d'environ 4500 paires de bases (pb), et éluer dans 30 ul d'eau stérile en utilisant des kits disponibles dans le commerce d'extraction de gel 9.
  3. Design 5 'et 3' des amorces pour le gène TCR d'intérêt qui codent également 15-20 pb chevauchant le site de digestion EcoRI et Notl du vecteur pMX, respectivement 8.
  4. Amplifier gène TCR avec des amorces. Effectuer l'électrophorèse du produit de PCR et la bande éluat d'environ 1000 bps comme décrit dans l'étape 1.2.
  5. Clone gène TCR dans le vecteur digéré en combinant chaque fragment linéaire avec le plasmide disponible dans le commerceEnsemble maître de réactifs de mélange et incubation à 50 ° C pendant 1 h.
    REMARQUE: Se reporter au protocole du fabricant pour les volumes relatifs de chaque composant. Ce procédé d'assemblage est basé sur la technique décrite à l' origine par Gibson et al. , 10.
  6. (Facultatif) gène Tag TCR pour marquer les cellules transduction avec la forme tronquée du récepteur du facteur de croissance nerveuse humaine (ANGFR, acides aminés 1-277) 11 séparés par furine site de clivage, la sérine-glycine linker, et 2A séquences 12,13. Concevoir des amorces codant pour des séquences qui se chevauchent les extrémités du fragment et assembler le plasmide comme décrit dans les étapes 1,3-1,5.
    REMARQUE: Ces séquences peuvent être trouvées dans les références 11-13.
  7. Transformer E. chimiquement compétente coli avec le plasmide assemblé suivant le protocole du fabricant 14. Semences transformées bactéries sur des plaques d'agar (20 mg / ml de bouillon de lysogénie (LB), 15 mg / ml d'agar et 1 pg / ml d'ampicilline) et on incube à 37 ° C pendant 18 h.
  8. Culture une colonie bactérienne unique dans 50 ml de milieu LB (20 mg / ml LB et 1 pg / ml d'ampicilline) pendant 16 heures dans un incubateur à agitation à 37 ° C et 200 tours par minute.
  9. On purifie les plasmides en utilisant des kits de midiprep disponibles dans le commerce en suivant le protocole du fabricant. Diluer le plasmide à une concentration d'environ 1 ug / ul.
    NOTE: Le protocole de purification de plasmide est basé sur la méthode d'extraction alcaline 15.

2. Génération Stable Packaging Cell Line

NOTE: les cellules deux 293GPG et PG13 sont adhérentes. les cellules de culture en milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de foetus de veau (FCS) et 50 pg / ml de gentamicine. Culture des cellules 293GPG avec 1 pg / ml de tetracycline avant la transfection. Incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2 entre toutes les étapes.

  1. Transfecter 293GPG cellules d' encapsidation 16 cultivées en flacon T75 avec le vecteur hemichain-encodage obtenu à l' étape 1.9, using disponible dans le commerce réactif de transfection en suivant le protocole du fabricant 1 7. REMARQUE: les cellules Transfecter 293GPG à 50-60% de confluence.
  2. milieu de Aspirer pour 293GPG cellules et ajouter 10 ml de frais DMEM 1 jour après transfection.
  3. La récolte produite transitoirement virus à partir de cellules transfectées 293GPG 2 jours après l'étape 2.2 en transférant le milieu de culture à la seringue et passant à travers le filtre de 0,45 um.
    REMARQUE: Le virus peut être utilisé immédiatement ou conservés à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.
  4. Culture 1 x 10 5 PG13 cellules T25 flacon. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Après un jour, le milieu de culture par aspiration et ajouter 1,5 ml de virus-293GPG issu de l'étape 2.3 et 1,5 ml de milieu DMEM avec 8 pg / ml de polybrène.
  5. Changer le support comme décrit dans l'étape 2.4 une fois par jour pendant 4 jours, pour établir la ligne PG13 cellulaire d'emballage stable retrovirus produisant codant pour la hemichain TCR d'intérêt.
  6. Aspirer moyen et remplaceravec un milieu DMEM frais pour PG13 lignées cellulaires 24 heures après la dernière infection pour plus de la culture.
    REMARQUE: Gel ou sous-culture des cellules en détachant avec une solution de trypsine-EDTA 0,05%.
  7. Pour produire un virus à partir de lignées cellulaires transduites de PG13, culture 2 x 10 6 cellules dans T75 flacon avec 10 ml de milieu DMEM, et le virus de la récolte , comme décrit à l' étape 2.3 trois jours après l' ensemencement des cellules.
    NOTE: Le virus est mieux utilisé immédiatement mais peut être conservé à -80 ° C pendant jusqu'à deux mois.

3. L'activation et la transduction des cellules T humaines

NOTE: Les échantillons humains sont obtenus et utilisés en conformité avec les comités d'éthique institutionnels protocoles approuvés. cellules humaines Culture primaires à Roswell Park Memorial Institute (RPMI) supplémenté avec 10% de sérum humain au lieu de FCS et 50 pg / ml de gentamicine. Incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2 entre toutes les étapes.

  1. Isoler les cellules humaines mononucléaires du sang périphérique (PBMC) par la densitéla séparation de gradient suivant le protocole du fabricant 18.
  2. Activer les cellules T pour induire la prolifération nécessaire pour une infection rétrovirale. Culture 2 x 10 7 PBMC fraîches ou décongelées par puits dans une plaque à 6 puits dans 5 ml de milieu RPMI avec 100 UI / ml d'interleukine-2 humaine recombinante (rhIL-2) et 50 ng / ml d'anticorps monoclonal anti-CD3 (clone OKT3).
  3. Trois jours après la stimulation, recueillent les cellules T par pipetage et centrifuger à 350 g pendant 4 min. Rejeter le surnageant et épépiner 0,5-1 x 10 6 cellules T par puits dans une plaque à 24 puits remis en suspension dans 1 ml de virus de l' étape PG13 2,7 et 1 ml de milieu RPMI supplémenté avec 200 UI / ml de rhIL-2. plaque Centrifuger à 1000 xg et 32 ​​° C pendant 1 heure.
  4. Après 24 h, recueillir des cellules T par pipetage et centrifuger à 350 g pendant 4 min. Se débarrasser des cellules de surnageant et remettre dans 1 ml de virus de l'étape PG13 2,7 et 1 ml de milieu RPMI supplémenté avec 200 UI / ml de rhIL-2. Répétez cette étape pour un total de 6 infections.
    REMARQUE: le nombre d'infections doit être optimisée en fonction de titre du virus produit par la lignée cellulaire d'emballage. Si nécessaire, le passage des cellules T par l'élimination de 20 à 30% des cellules chaque jour pour prévenir la prolifération.
  5. 24 heures après la dernière infection, recueillir des cellules T par pipetage et centrifuger à 350 g pendant 4 min. Jeter les cellules surnageant et remettre en suspension dans un milieu RPMI avec 100 UI / ml de rhIL-2 pour la poursuite de la culture.
  6. 2-3 jours après l'étape 3.5, les cellules T avec des taches de HLA multimère à 4 ° C pendant 30 min, puis CD3 anti-humain et des anticorps monoclonaux co-récepteurs (mAb) à 4 ° C pendant 15 min. Analyser par cytométrie de flux. Utilisez multimère hors de propos et / ou des cellules non transduites comme témoins négatifs (Figure 1 - 3) 19.
  7. Si le hemichain centric introduit est une chaîne TCRa, analyser l' utilisation Vß des cellules positives de novo multimère utilisant disponibles dans le commerce panel d'anticorps Vß spécifique par cytométrie en flux 20.

4. Clonage De Novo TCR Contre-hemichains

  1. Trier de novo multimère population positif à l' étape 3.6 par tri cellulaire assistée écoulement.
  2. Isoler ARN à partir de cellules T triées en utilisant le guanidinium acide thiocyanate-phénol-chloroforme méthode d'extraction 21,2 2.
    REMARQUE: L'ARN peut être stocké à -80 ° C, mais elle doit être utilisée pour générer l'ADNc le plus tôt possible.
  3. Synthétiser une banque d' ADNc à partir d' ARN extrait en utilisant des kits disponibles dans le commerce reverse transcriptase-PCR suivant le protocole du fabricant 23,24.
  4. Si le clonage TCRβ contre-chaînes, concevoir gène Vß et TCRβ amorces spécifiques de la région constante, tel que déterminé à l'étape 3.7, et clone complet TCRβ gènes tels que décrits dans les étapes 1,3-1,9. Voir l'étape 4.5 si le compteur-chaîne est TCRa, sinon passez à l'étape 5.1.
  5. Commercialement anticorps spécifiques Va disponibles sont limités, donc l'utilisation du gène Va ne peut pasdéterminée par cytométrie de flux. Clone TCRa contre-chaînes via l' amplification 5'-rapide des extrémités d'ADNc (RACE) 25, en utilisant disponible dans le commerce 5 'kits RACE 6.
    1. Synthétiser 5 'ADNc compatible RACE à partir d'ARN extrait à l'étape 4.2 en suivant le protocole du fabricant.
    2. Effectuer 1 er cycle de PCR comme décrit dans le tableau 2.
    3. Effectuer une électrophorèse du produit de PCR et éluer bande d'environ 1100 pb, comme décrit dans l'étape 1.2.
    4. Effectuer 2 ème cycle de PCR comme décrit dans le tableau 3, en utilisant 1 produit PCR round st comme matrice.
      NOTE: Les séquences des amorces indiquées dans le tableau 3 ont été conçus pour le clonage dans EcoRI et Notl digéré vecteur PMX.
    5. Effectuer une électrophorèse du produit de PCR et éluer bande d'environ 1000 pb, comme décrit dans l'étape 1.2.
    6. gènes Clone TCRa dans EcoRI et Notl digéré vecteur pMX et puriplasmides fy comme décrit dans les étapes 1,5-1,9.

Clones TCR 5. Reconstituer Novel spécifiques de l'antigène

REMARQUE: La culture des cellules Jurkat 76 et les lignées cellulaires suivantes dans un milieu RPMI additionné de 10% de FCS et 50 pg / ml de gentamicine. Incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2 entre toutes les étapes.

  1. Transduction Jurkat 76 cellules 26 (ou équivalent TCR - lignée cellulaire T humaine - /) avec hemichain TCR centrée en utilisant le virus 293GPG produit à l' étape 2.3. Pour Jurkat 76, graines 5 x 10 4 cellules par puits en plaque de 24 puits avec 1 ml de virus et de 1 ml de milieu RPMI. plaque Centrifuger à 1000 xg et 32 ​​° C pendant 1 heure.
  2. 24 heures après l'infection, recueillir hemichain transduction Jurkat 76 cellules par pipetage et centrifuger à 350 g pendant 4 min. Rejeter le surnageant et remettre en suspension dans un milieu RPMI frais destiné à la culture.
  3. Purifier cellules transduites si le hemichain est moléculairement étiqueté 2-3 jours après l'étape 5.2, par colorationing avec fluorophore conjugué anti-NGFR mAb suivi assisté écoulement ou d'une cellule magnétique assistée de tri ( en option) 27.
  4. Après les étapes 2.1 à 2.3, produire le virus 293GPG codant pour une contre-chaîne TCR clonée à partir des étapes 4.4 ou 4.5.
  5. Pour reconstituer complètement le RCT, transduire lignée de lymphocytes T exprimant de manière stable le RCT hemichain centrée généré dans les étapes 5.1-5.3 utilisant le virus de l'étape 5.4. Effectuer transduction comme décrit dans les étapes 5.1-5.2.
  6. Purifier CD3 + transfectants utilisant des anticorps anti-CD3 tri cellulaire magnétique assistée suivant le protocole du fabricant, 2-3 jours après l' étape 5.5 27.
  7. Pour valider la spécificité de l'antigène, tache transfectants exprimant le TCR clonotypiques composé du RCT hemichain centrée associé à différents contre-chaînes, avec des anti-CD3 et / ou mAb co-récepteur, et HLA multimère, 3-5 jours après la purification de CD3. Analyser les cellules par cytométrie de flux (Figure 4 - 5) 19.

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Résultats

Sans connaissance préalable de ce qui est hemichain chaîne centrée, la chaîne TCRa et TCRβ devrait être cloné séparément et transduction des cellules T du sang périphérique, qui a été fait dans le cas de HLA-A24 / WT1 réactive TAK1 TCR (Figure 1). Transduction de TAK1β a abouti à une fréquence sensiblement plus élevée de lymphocytes T spécifiques de l'antigène. A l' inverse, la transduction d'un hemichain non-centric ne donnerait pas de novo des cell...

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Discussion

La première exigence pour une bonne application de ce procédé réalise l'efficacité de transduction suffisante de cellules T primaires avec le hemichain d'intérêt. Dans notre expérience, la combinaison de l'utilisation de PG13 comme lignée cellulaire d'emballage et pMX que les résultats de vecteurs rétroviraux dans l'expression stable et efficace du gène introduit dans les cellules T humaines primaires. les cellules d'emballage PG13 peuvent être une seule cellule clonée pour sélectionner les cellu...

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Déclarations de divulgation

Le Réseau universitaire de santé a déposé un brevet lié à cette méthodologie sur lequel N.H., M.N. et T.O. sont nommés inventeurs. Les autres auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts financier.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la subvention R01 CA148673 (NH) des NIH ; la bourse IA-039 (NH) de l’Institut ontarien de recherche sur le cancer ; Subvention catalyseur BioCanRX (NH) ; la Fondation Princess Margaret contre le cancer (MOB, NH) ; Bourses d’études supérieures des Instituts de recherche en santé du Canada ; Bourse d’études supérieures du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada ; Province de l’Ontario (TG, MA) ; et la bourse Guglietti (TO). Les monomères HLA et CD1d ont été aimablement fournis par la plateforme de tétramères du NIH.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,05 % Trypsine-EDTAWisent Bioproducts325-043-CL
293GPGcellules Générées par Ory et al. (ref 8)
AgarWisent Bioproducts800-010-CG
AgaroseWisent Bioproducts800-015-CG
Ampicilline sodium saltWisent Bioproducts400-110-IG
ChloroformBioShopCCL402
Mélange de solution de désoxynucléotide (dNTP)New England BiolabsN0447L
DMEM, haute teneur en glucose, pyruvateLife Technologies11995065
EcoRINew England BiolabsR0101S
EZ-10 Kit d’extraction de gel d’ADN à colonne de centrifugationBS353
Sérum de veau fœtalLife Technologies12483020
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-02
FiltreCorning431220Membrane SFCA à pores de 0,45 mm Anticorps
anti-humain CD271 conjugué FITC (NGFR) mAbBiolegend345104clone ME20.4
Anticorps monoclonal CD3 humain conjugué FITCBiolegend300440clone UCHT1
GentamicinLife Technologies15750078
Gibson Assembly Master MixNew England BiolabsE2611Lutilisé pour l’assemblage d’ADN en plusieurs pièces
HLA-A2 pentamerProimmunedépend du peptide antigéniqueHLA-A2/MART1 multimère utilisé ici a été acheté auprès de
monomères HLA/CD1dProimmune NIH Tetramer Core Facilitymultimériser les monomères selon le protocole fourni par le NIH tetramer core facility
Humain AB sérumValley BiomedicalHP1022
microbilles humaines CD3Miltenyi Biotec130-050-101
IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire KitBeckman CoulterIM3497
Jurkat 76 cellulesGénéré par Heemskerk et al. (ref 10)
LB BouillonWisent Bioproducts800-060-LG
LS Colonne MACSMiltenyi Biotec130-042-401
NEB 5-alpha Compétent E. coliNewEngland BiolabsC2987I
NEBuffer 3.1New England BiolabsB7203Sutilisé pour la digestion EcoRI et NotI
NewEngland BiolabsR0189S
NucleoBond Xtra MidiMacherey-Nagel740410utilisé pour la purification de plasmides
Anticorps monoclonaux CD8 humains conjugués PC5Beckman CoulterB21205clone B9.11
Cellules PG13ATCCCRL-10686
Phusion HF Buffer PackNew England BiolabsB0518S
Phusion  ; ADN polymérase haute fidélitéNew England BiolabsM0530L
pMX vecteur rétroviralCell BiolabsRTV-010
polybrèneSigma-AldrichH-9268
Proleukin (interleukine-2 humaine recombinante)Novartisby Rx seulun produit équivalent peut être acheté auprès de Sigma-Aldrich
Anticorps anti-CD3 humain purifiéBiolegend317301clone OKT3, utilisé pour la stimulation des lymphocytes T
RPMI 1640Life Technologies11875119
SA-PELife TechnologiesS866utilisé pour la multimérisation des monomères de l’installation centrale de tétramères
NIH SMARTer RACE 5'/3' ; KitClontech634858
Eau stérileWisent Bioproducts809-115-LL
SuperScript III Système de synthèse premier brinInvitrogen18080051pour synthèse d’ADNc
SeringueBD30160410 ml, embout coulissant
Chlorhydrate de tétracyclineSigma-AldrichT7660
TransIT-293Mirus BioMIR 2700utilisé pour transfecter des cellules 293GPG
TRIzol ReagentLife Technologies15596026

Références

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