détection de la<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variant de glycoprotéine de surface par magnétique tri cellulaire activé et cytométrie de flux

Résumé

Les trypanosomes africains cultivés in vitro subissent une variation antigénique à un faible taux, de sorte que les populations sont constituées de parasites exprimant un variant dominant de type glycoprotéine de surface (VSG) et d’une petite population de variants « commutés ». Ce protocole décrit une méthode rapide de détection et de quantification de ces populations.

Résumé

Trypanosoma brucei, un parasite protozoaire qui provoque à la fois la trypanosomiase africaine humaine et animale (connue sous le nom de maladie du sommeil et de nagana, respectivement) circule entre un vecteur de tsé-tsé et un hôte mammifère. Il échappe au système immunitaire de l’hôte mammifère en changeant périodiquement la glycoprotéine de surface dense et variante (VSG) qui recouvre sa surface. La détection de la variation antigénique chez Trypanosoma brucei peut être à la fois lourde et laborieuse. Ici, nous présentons une méthode pour quantifier le nombre de parasites qui ont « changé » pour exprimer une nouvelle VSG dans une population donnée. Les parasites sont d’abord colorés avec un anticorps contre le VSG de départ, puis colorés avec un anticorps secondaire attaché à une bille magnétique. Les parasites exprimant la VSG de départ sont ensuite séparés du reste de la population en faisant passer les parasites sur une colonne attachée à un aimant. Les parasites exprimant la VSG dominante et initiale sont conservés sur la colonne, tandis que la circulation contient des parasites qui expriment une nouvelle VSG ainsi que certains contaminants exprimant la VSG de départ. Cette population est à nouveau colorée avec un anticorps marqué par fluorescence contre le VSG de départ pour marquer les contaminants, et de l’iodure de propidium (PI), qui marque les cellules mortes. Un nombre connu de billes de comptage absolu visibles par cytométrie en flux est ajouté à la population à flux continu. Le rapport entre les billes et le nombre de cellules collectées peut ensuite être utilisé pour extrapoler le nombre de cellules dans l’échantillon entier. La cytométrie en flux est utilisée pour quantifier la population de commutateurs en comptant le nombre de cellules PI négatives qui ne se colorent pas positivement pour le VSG dominant de départ. La proportion de commutateurs dans la population peut ensuite être calculée à l’aide des données de cytométrie en flux.

Introduction

Le parasite protozoaire, Trypanosoma brucei, est un agent causal de maladies qui affectent les humains (via Trypanosoma brucei gambiense et Trypanosoma brucei rhodesiense) et les animaux (via Trypanosoma brucei brucei) dans toute l' Afrique sub-saharienne. Elle est transmise à l'hôte de mammifère par la salive du vecteur de la mouche tsé-tsé. Les deux humains et de la trypanosomiase animale africaine causent un fardeau économique sévère dans les régions endémiques, et peu de médicaments sont disponibles ou en développement pour traiter soit la maladie. mécanismes d'évasion immunitaire Comprendre est critique pour le développement de médicaments pour la trypanosomiase. La variation antigénique du dense, la variante glycoprotéine de surface (VSG) manteau qui couvre le parasite est l' un des principaux moyens par lesquels T. brucei soustrait la réponse d'anticorps de mammifère. Environ 2,000 variants du gène de VSG existent dans le génome du trypanosome, mais un seul est transcrit à un moment donné de l' une des ~ 15 expressites sion. «Switching» de la VSG exprimée peut se produire soit par copie d' un gène de VSG dans le site actif d'expression, soit par activation de la transcription d'un site d'expression précédemment silencieux (passé en revue dans ^1).

Bien que beaucoup de travail a été consacrée à la compréhension de la variation antigénique de T. brucei, les facteurs qui influent sur la fréquence de commutation sont encore mal compris. Les études menées à ce jour ont été entravés par le fait que , bien que la commutation se produit stochastiquement in vitro, des fréquences de commutation sont très faibles, de l'ordre de 1 à environ 10 ⁶ cellules ^2. Cela rend difficile de mesurer si une augmentation de facteurs donnés ou diminue la fréquence de commutation, étant donné que la commutation est difficile à détecter en premier lieu. Avant 2009, les méthodes d'isolement switchers dans une population donnée étaient longues et de main-d'œuvre. Ces cellules repiquage trypanosomes par des souris immunisées contre la VSG dominante et récolte inclusun jour plus tard ^3, ou de compter des centaines de cellules par immunofluorescence ^4,5. Une autre stratégie repose sur la sélection pour la résistance aux médicaments pour isoler switchers ^6. Parce que les trypanosomes africains cultivées in vitro sont généralement constitués d'une grande population exprimant une variante importante, et une population beaucoup plus petite de switchers exprimant des variantes alternatives, nous nous référons à la principale variante dans le présent document comme, VSG à partir dominante. Ce faisant, nous voulons en aucun cas impliquer que cette variante majeure a une plus grande remise en forme que d'autres variantes dans la population.

Nous décrivons ici une méthode qui peut mesurer de manière fiable le nombre de trypanosomes exprimant une VSG non dominante dans une population donnée dans 3 - 4 h. Cette méthode est particulièrement utile lorsque l'on veut déterminer si une manipulation génétique donnée ou un traitement médicamenteux augmente le nombre de cellules commutées dans une population. Au lieu de se débarrasser de la population de cellules exprimant le dominant, à partir VSG par des médicaments ou par des moyens immunologiques, ces cellules sont éliminées en premier les enrobant avec des billes magnétiques couplées à un anticorps dirigé contre la VSG dominante, puis de les isoler dans une colonne magnétique. La population commuté est ensuite recueillie dans le flux continu et coloré à nouveau avec un anticorps marqué anti-VSG fluorophore pour identifier les contaminants. La quantification est obtenue en ajoutant un nombre défini de billes de comptage absolu de chaque échantillon de telle sorte que le rapport des billes aux cellules peut être déterminée et utilisée pour quantifier le nombre de commutateurs dans la population ^7.

Protocole

NOTE: Tout au long de la procédure, il est nécessaire de garder les cellules sur la glace. les médias froids doivent également être utilisés tout au long.

1. Récolte de l'échantillon

1. Cultivez Lister 427 trypanosomes souche de la circulation sanguine à une densité de 0,5 - 1 million / ml. Il est préférable de commencer les cultures avec un petit nombre de parasites. Isoler 50 x 10 ⁶ cellules / échantillon pendant 10 min à 1500 x g. Assurez - vous de laisser 1 x 10 ⁶ cellules en culture pour une utilisation ultérieure des contrôles d' anticorps positifs et négatifs.
   NOTE: Ce protocole peut également être utilisé sur les trypanosomes isolés à partir du sang d'animal (voir la discussion pour plus de détails).
2. Pipette ou videz la majeure partie du surnageant (laisser environ 750 pi). Transférer les cellules dans un tube de 1,5 ml.
3. Spin cellules à 4 ° C pendant 4 min à 5200 xg dans une microcentrifugeuse et retirer le surnageant.

2. Étiquetage magnétique

1. Resuspendre les cellules dans 150 ul du milieu de culture (HMI-9 wie sérum par exemple) + anticorps anti-VSG primaire à la dilution appropriée.
   NOTE: L'anticorps anti-VSG est faite dans la maison et utilisé à une dilution de 1:50. Il est important d'utiliser un anticorps primaire anti-VSG qui ne sont pas marqués avec un fluorophore.
2. les cellules de vortex en utilisant un vortex adaptateur 60 à la vitesse de 6 - 8 dans une chambre froide à 4 ° C pendant 10 min. Laver avec 800 - 1000 pi HMI-9 à froid avec du sérum.
3. Spin à 4 ° C pendant 4 min à 5200 xg et aspirer le surnageant. Laver avec 1 ml HMI-9 avec du sérum et de spin comme ci-dessus. Aspirer le surnageant. Resuspendre le culot dans 100 ul de HMI-9 avec du sérum.
4. Ajouter 110 ul de cellules magnétique activé tri (MSC) microbilles. Utiliser anti-souris et anti-lapin ou des billes anti-biotine comme il convient pour l'anticorps anti-VSG primaire. Bien mélanger. les cellules de vortex dans une chambre froide à 4 ° C pendant 10 min.
5. Alors que les cellules sont vortex, mis en place une colonne de séparation / échantillon magnétique activé sur un aimant de séparation. Assurez-vous d'avoir un reréceptacle (on utilise un tube de centrifugation de 15 ml) dans la colonne pour recueillir l'écoulement. Mettre en place l'appareil dans une chambre froide.
6. Ajouter 2 ml de HMI-9 avec du sérum à la colonne principale. Après amorçage place un tube de centrifugation de 15 ml dans la colonne pour recueillir l'écoulement à travers chaque échantillon.
7. Après 10 minutes d'incubation à l'étape 2.4, ajouter 800-1000 ul HMI-9 à froid avec du sérum. Spin à 4 ° C pendant 4 min à 5200 xg et retirer le surnageant pour éliminer l'anticorps non lié. Laver avec 1 ml de HMI-9 avec du sérum et répétez laissant 100 pi du surnageant.
8. Flick le tube de centrifugation vigoureusement et inspecter visuellement le tube pour faire en sorte que la pastille est complètement remis en suspension. Ajouter 1 ml de HMI-9 avec du sérum et la pipette de haut en bas pour vous assurer que les cellules sont bien remises en suspension.

3. Séparation magnétique

1. Faire en sorte que les colonnes sont amorcées, comme décrit ci-dessus. Appliquer les cellules à la colonne. Collecter accréditives avec des cellules exprimant la VS non-dominanteG. 1 ml de milieu + trypanosomes prend généralement de 6 - 7 min à circuler à travers la colonne.
2. Laver 2x avec 1 ml de HMI-9 avec du sérum et de recueillir accréditives dans le même tube que dans l'étape 3.1.
3. Diviser écoulement (3 ml) dans deux tubes de 1,5 ml de microcentrifugation.
   REMARQUE: Ceux - ci peuvent être combinés ou plus tard moitié peuvent être utilisées pour isoler l' ARN, etc.
4. Retirer la colonne de l'aimant. Ajouter 3 ml de HMI-9 avec du sérum à la colonne et plonger colonne dans un tube de 15 ml de centrifugeuse pour obtenir des cellules qui expriment le départ, dominante VSG. Retirer 300 pi de matériel élue pour une analyse ultérieure. Gardez ces cellules sur la glace.
5. Pour une utilisation comme un positif et un contrôle négatif, prendre environ 1 million de cellules provenant de la culture à partir de cellules de contrôle de plus en plus à 37 ° C (ceux qui ne devraient changer fréquemment) et la pipette eux dans un tube de 1,5 ml.
   REMARQUE: Les cellules témoins positives seront colorées avec un anticorps marqué par un fluorophore à l'étape 4.1. Négatif cellules témoins remadans souillures dans le reste du protocole.
6. Des échantillons de Spin accréditives et positif échantillon témoin d'anticorps à 4 ° C pendant 4 min à 5200 xg et retirer le surnageant.
   Remarque: une autre partie aliquote de 300 ul de cellules éluées peut être utilisé comme témoin positif pour l'anti-coloration VSG.

4. Coloration pour identifier les contaminants et les Switchers

1. échantillons accréditives Resuspendre et des cellules de contrôle positif dans 100 pi de HMI-9 avec du sérum + primaire, marqué par un fluorophore, un anticorps anti-VSG à la dilution appropriée.
   NOTE: L'anticorps anti-VSG marqué est fait maison et utilisé à une dilution de 1: 1000. Le fluorophore marqué, anti-VSG peut être de la même source que l'anticorps non marqué dans la séparation MACS step.There devrait être de 3 ml d'échantillon d'écoulement dans deux tubes à centrifuger suivants étape 3.5.
2. Pour analyser l'ensemble de l'écoulement par cytométrie en flux, combiner les pastilles dans les deux tubes de microcentrifugation tout re-susen attendant les échantillons dans 100 pi de HMI-9 avec du sérum d'anticorps + anti-VSG. Bien mélanger.
3. les cellules de vortex dans une chambre froide à 4 ° C pendant 10 min. Ajouter 800 - 1000 pi HMI-9 à froid avec du sérum. Des échantillons de Spin à 4 ° C pendant 4 min à 5200 xg et retirer le surnageant pour éliminer l'anticorps non lié.
4. Laver les cellules avec 1 ml de HMI-9 avec du sérum. Des échantillons de Spin à 4 ° C pendant 4 min à 5200 xg et retirer le surnageant. Au cours de cette dernière rotation, centrifuger les échantillons élues de l'étape 3.4 et l'échantillon de contrôle négatif.
5. Resuspendre tous accréditive et échantillons élues dans: solution (175 pl au total) 148,5 pi HMI-9 avec du sérum, 25 pi de comptage absolue perles et 1,5 pi l'iodure de propidium. La remise en suspension des échantillons de contrôle positifs et négatifs anticorps dans 175 pi de HMI 9 avec du sérum. Assurez-vous d'enregistrer le nombre de comptage absolu des perles / 25 pi pour le lot particulier utilisé.
6. Exécutez tous les échantillons au moyen d'un cytomètre de flux et de recueillir des données. Les cellules mortes tacher comme PI ^{+. Contaminants tachent comme PI - VSG +. Switchers tachent comme PI - VSG - 8.}
7. Calculer les fréquences de commutation en utilisant la cytométrie de flux de données.
   REMARQUE: Pour obtenir des instructions sur la façon de calculer les fréquences de commutation, s'il vous plaît se référer au fichier supplémentaire cytométrie de flux Calculations.docx et le tableau 1.

Résultats

La méthode décrite ici a été utilisé pour démontrer que les cassures double brin dans le site d'expression de VSG augmenté le nombre de switchers dans une population ^8. Ici, nous montrons des résultats représentatifs d'une population de trypanosomes qui ont été induites de manière similaire pour générer une cassure double brin au niveau du site d'expression. Nous comparons ces trypanosomes à ceux qui ne l' ont pas été amené à générer une cassure double brin. La...

Discussion

En ce qui concerne la technique expérimentale, le composant le plus critique du protocole est de garder tous les échantillons froids. Les trypanosomes intérioriser très rapidement anticorps lié à leur surface ^9, mais ce processus dépend de la motilité, et n'a pas d' influence l'essai aussi longtemps que les cellules sont maintenues à 4 ° C. Tous les échantillons doivent toujours être sur la glace, et pipetage devraient être effectués rapidement pour minimiser l'exposition à l'environnement...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
anticorps anti-VSG non marqué	n/a n	/a	L’anticorps VSG est fabriqué en maison
fluorophore Anticorps anti-VSG marqué	n/a	n/a l’anticorps	VSG est fabriqué en maison
HMI-9 support n	/a	n/a	HMI-9 est fabriqué en interne
Propidium Iodide	BD Pharmingen	556463
CountBright billes de comptage absolu	Thermofisher Scientific	C36950
LD colonnes	Miltenyi Biotech	130-042-901
Aimant MACS	Miltenyi Biotech	130-042-303
Séparateur magnétique MACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
adaptateur vortex-60	ThermoFisher scientific	AM10014
cytomètre en flux	Coulter	n/a
logiciel d’analyse de cytomètre en flux	FloJo	n/a