Génération rapide et efficace des Recombinant pluripotentes humaines cellules souches par recombinase médiée Cassette Exchange dans le AAVS1 Locus

Résumé

Nous rapportons ici une méthode d'édition de gène rapide et efficace basée sur CREM dans le locus AAVS1 des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) qui améliore les systèmes décrits précédemment. En utilisant cette technique, les lignes isogéniques peuvent être rapidement et de manière fiable générés pour des études comparatives appropriées, ce qui facilite la recherche en transgénèse médiée avec hPSCs.

Résumé

Même avec la révolution des technologies de gènes ciblage dirigé par CRISPR-cas9, la modification génétique des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) est encore temps. Des études comparatives qui utilisent des lignes recombinantes avec des transgènes intégrés dans le port sûr loci pourrait bénéficier d'approches qui utilisent recombinases site-spécifiques ciblées, comme Cre ou FLPe, qui sont plus rapides et moins sujettes à des effets hors-cible. Ces méthodes ont été décrites, mais ils ne le font pas de manière significative le gène surperformer le ciblage dans la plupart des aspects. Utilisation de nucléases à doigt de zinc, nous avons déjà créé une lignée de cellules de maître dans le locus AAVS1 de hPSCs qui contient un GFP-hygromycine-tk exprimant cassette, flanqué par des séquences FRT hétérotypiques. Ici, nous décrivons les procédures pour effectuer FLPe échange de cassette recombinase-médiée (CREM) en utilisant cette ligne. Le maître cligne ell est transfectée avec un vecteur CREM donneur, qui contient un promoteur de résistance puromycine, et avec FLPe recombinase. Application de la fois positif (puromycine) et négatif (CARF) programme de sélection conduit à la sélection de CREM sans intégrations aléatoires. CREM génère des lignées transgéniques polyclonaux pluripotentes entièrement caractérisé en 15 j avec 100% d'efficacité. Malgré la récente décrit les limites du locus AAVS1, la facilité du système ouvre la voie à HPSC transgénèse dans les paramètres isogéniques, est nécessaire pour des études comparatives, et permet des écrans génétiques semi-haut débit pour le gain / perte d'analyse de la fonction qui autrement être très longue.

Introduction

Ciblée recombinaison du génome a permis des progrès rapides dans de nombreux domaines de recherche. Chez les souris, la synergie entre l'édition du génome et les cellules souches a permis une meilleure compréhension du mécanisme complexe de la fonction des gènes et la régulation des gènes. Ces progrès sont attendus dans les cellules humaines pluripotentes de troncs (hPSCs), ainsi, bien que depuis de nombreuses années depuis le premier isolement de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh), et humain plus tard induite par des cellules souches pluripotentes (de hiPSCs), l'édition de gènes a constitué un obstacle technique . Les progrès récents dans l'ingénierie du génome en utilisant nucléases-zinc ciblées Finger nucléases (ZFN), transcription nucléases effectrices activatrices-like (Talen), ou en cluster régulièrement intercalées courte répétitions palindromiques / CRISPR-associated protein 9 (CRISPR / cas9) nous ont permis de surmonter ces difficultés, ce qui rend la recombinaison un processus efficace ciblés : ^{1 - 3.}

loci spécifiques dans le mouse génome qui permettent stable, fiable et omniprésente expression du transgène en l'absence d'effets indésirables comme Rosa26, HPRT1 ou COL1A1, sont devenus des outils essentiels dans la réalisation d'études génétiques. loci portuaires sécuritaires permettent une analyse comparable entre les différentes lignées de souris dans des contextes isogéniques. Ceci ne peut être réalisé en utilisant des méthodes d'intégration aléatoire standard, qui sont associés à des limites bien connues telles que la mutagenèse insertionnelle, les effets dépendants de la dose, ou l'expression du transgène bigarrée. Gene montage facilité et la flexibilité dans le port sûr loci est augmenté par l'utilisation de recombinases site-spécifiques ciblés comme Cre ou flippase (FLPe), qui reconnaissent spécifiquement des séquences cibles (loxP ou FRT, respectivement) et catalysent la recombinaison efficace entre des objectifs identiques. En raison de ces caractéristiques, l'édition du gène recombinase à médiation en utilisant des séquences loxP ou FRT dans préintégrées loci de refuge est un outil couramment utilisé dans la souris transgenèse. En plus de l' insertion de la cassette ou l' excision à médiation entre des séquences cibles identiques, l'utilisation de sites loxP ou FRT incompatibles permet l'échange de cassette à médiation par la recombinase (CREM) ^4.

Chez l'homme, les tentatives pour identifier les loci de la sphère de sécurité ont été effectuées. Le HPRT orthologue de la souris, en dépit de son association avec le syndrome de la perte de fonction de Lesch-Nyhan et ROSA26 ont été ciblés en hPSCs. HPRT a été signalé pour faire taire rapidement l' expression du transgène dans ESC et, comme ROSA26, sa capacité à maintenir l' expression du transgène dans terminale des cellules différenciées n'a pas été étudiée ^5-7. Parce qu'une mutation nulle homozygote du gène CCR5 semble être bien toléré chez l' homme, sa valeur refuge a été évaluée. CCR5 a été ciblé et rapporté pour soutenir l' expression du transgène stable dans différentes lignées cellulaires humaines, y compris ^8,9 CES. cependant,ce dernier n'a pas été prouvé au niveau clonal pendant la culture à long terme, et l' expression du transgène omniprésente n'a pas été démontrée dans la descendance différenciée des trois couches germinales. AAVS1, le site d'intégration naturelle de l'Adeno Associated Virus de type 2 (AAV), a été testé en CSEh ainsi, en raison de la résistance rapportée à transgène taire ^10. Par la suite, de nombreux groupes ont utilisé le locus AAVS1 et décrit l' expression stable du transgène dans hPSCs indifférenciées, ainsi que leur descendance différenciée de l' ensemble des trois couches germinales, à la fois in vitro et in vivo ^2,8,11,12. Les résultats récents nuancent néanmoins ces résultats, comme le lieu AAVS1 a été trouvé pour exercer une inhibition de transgène variables in vitro dans CSEh indifférenciées et hépatocytes descendance ^13.

études de dépistage supplémentaires utilisant des approches et des méthodes d'intégration aléatoires pour déterminer l'intégration à copie unique visant à trouver des génosites d'intégration micro résistantes aux transgène silencieux pendant hPSCs l' expansion et la différenciation ^14,15. Dans l'ensemble, jusqu'à présent, aucun site génomique a été entièrement validée comme un port sûr dans hPSCs et leur progéniture; l' identification d'un site approprié pour l' expression du transgène stable omniprésente, non seulement en hPSCs mais aussi dans leurs descendances différenciées in vitro et in vivo, reste à résoudre. Parmi tous les loci étudiés et malgré ses limites, AAVS1 reste le mieux caractérisé et le plus utilisé dans la recherche sur les cellules souches.

CREM a été réalisé avec succès en hPSCs dans certains de ces loci ^6,7,14,16, en utilisant la plupart du temps Cre recombinase, même s'il y a des indications que FLPe est plus efficace que Cre ^17. Dans tous ces cas, une cassette de résistance à la drogue positive a été utilisée pour la sélection de colonies recombinantes. Malgré son succès, ces procédures ne constituent pas un progrès technique sur la norme géné-procédures d'édition en utilisant ZFNs, TALENs ou CRISPR / cas9, comme une seule procédure de sélection antibiotique ne permet pas d'exclure des intégrations aléatoires et exige le dépistage des colonies pour identifier les clones correctement ciblés.

Dans cette procédure, on décrit des méthodes pour effectuer CREM en hPSCs dans le locus AAVS1 utilisant une combinaison de positif (à l'intérieur de la cassette entrant) et négative (à l'intérieur de la cassette pré - intégrée) , les sélections qui permettent la génération de lignées transgéniques polyclonaux à ± 15 jours , avec 100% d'efficacité et sans événements d'intégration aléatoires. Par conséquent, cette méthode représente un progrès au-delà des technologies de CREM actuellement décrites dans hPSCs.

Protocole

1. Préparation du contenant FRT-HPSC Master Cell ligne pour Transfection

1. Culture CSEh / iPSC lignées cellulaires maître selon des procédures standard sur ou hors inactivés fibroblastes embryonnaires de souris (Imef) en utilisant CSEh ou moyenne iPSC sans alimentation, respectivement (tableau 1). Préparer 2 (sur les départs) ou 1 puits (sans alimentation)-de hPSCs dans une plaque de 6 puits pour chaque condition expérimentale.
2. Observer les cultures, et lorsque les cellules atteignent 60-70% de confluence, plaque résistante aux médicaments Imef (iDR4). En bref, revêtir les puits nécessaires d'une plaque de 12 puits avec 0,5 ml d'une solution de gélatine à 0,1% et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. Plate 125.000 iDR4s par puits et incuber O / N avec un milieu Imef (tableau 1).

2. HPSC Transfection par Nucléofection

1. Le lendemain, pré-incubation CSEh / cultures iPSC avec des milieux frais, y compris 10 uM de la protéine kinase Rho-associé (ROCK) inhibiteur (Y-27632), pendant 1 h à 37 ° C. Nposte, prendre la solution de transfection CSEh du réfrigérateur pour préchauffer à température ambiante.
2. Préparer 1 ml de milieu de nucléofection placage (tableau 1) par condition de nucléofection. Prenez moyen Imef hors puits, laver avec 1 ml de la température ambiante du PBS, et ajouter 500 pi de nucléofection placage moyen. Transférer les 500 autres uL dans des tubes stériles de 1,5 mL et de les stocker à 37 ° C jusqu'à ce que le placage. NOTE: Une expérience de CREM typique contient trois conditions différentes avec des rapports moléculaires de CREM donneur: vecteurs pFLPe de 2: 0, 2: 1 et 0: 1.
3. Détachez CSEh / iPSC dans une suspension cellulaire unique.
   1. Enlever les médias, le laver avec 2 ml de PBS RT, et ajouter 1 ml de trypsine 0,05% ou Accutase sur nourricières ou sans alimentation-cultures HPSC, respectivement. Incuber 7 (trypsine) ou et 2-5 (Accutase) min à 37 ° C. Pour le traitement Accutase - cellules doivent rester lâche, mais attaché.
   2. Retirez délicatement la plaque de l'incubateur et sansllowing les cellules pour détacher, enlever l'agent de dissociation par aspiration. Ajouter 1 ml de CSEh médias et dissocier les cellules lâches en rinçant doucement les médias sur la surface de la plaque, ce qui évite le moussage. Assurez-vous que les cellules sont dans une suspension cellulaire unique.
   3. Recueillir les cellules dans un 15 ou 50 ml tube propre et stérile. Laver les puits avec 1 ml de médias CSEh et recueillir les cellules dans le même 15 ou 50 ml tube. Prélever une partie aliquote de 50 pi de comptage (au cours de l'étape suivante) à l'aide d'un dispositif de comptage de cellules. Notez le volume de collecte et de calculer le nombre total de cellules. Isoler les cellules à 300 xg pendant 5 min à température ambiante.
4. Remettre en suspension le culot de cellules à une suspension de 10 ⁶ cellules / ml avec du PBS en utilisant une pipette sérologique de 5 ml et pipetage doux. Éviter de faire mousser. Transfert 2 mL par condition expérimentale (environ 2 x 10 ⁶ cellules) à nettoyer, des tubes stériles de 15 ml.
5. Alors que la centrifugation, prépare CREM plasmides pFLPe mélanges par des donateurs dans un volume maximum de 10 pi.
   1. Transfert 2,5 pg de pFLPe (6,5 Kb) à un environnement propre, stérile tube de 1,5 ml. Ajouter un rapport de 2: 1 moléculaire du vecteur CREM donneur ¹³ au vecteur pFLPe. Par exemple, environ 10 ug d'un vecteur donneur Kb CREM 12.
6. Procéder à nucléofection, en évitant la formation de mousse dans toutes les étapes.
   NOTE: Certains protocoles de transfection HPSC appliquent une étape d'épuisement Imef supplémentaire avant l'étape 2.4. Cependant, dans la pratique, Imef est une fraction mineure de cellules dans la suspension unique qui ne modifie pas de manière significative l'efficacité de transfection, ni ne crée des cellules recombinantes qui contaminent car ils sont non proliférative. En outre, il est essentiel de procéder rapidement au cours du processus de transfection pour augmenter la viabilité. Pour ces raisons, l'épuisement Imef est pas appliquée.
   1. Retirer la plaque iDR4 et les tubes de 1,5 ml avec le milieu de placagede l'incubateur. Un tube à la fois, pipeter au large de la PBS avec soin sans perturber le culot cellulaire. Enlever autant que possible. Remettre en suspension le culot avec 100 ul de solution de transfection par pipetage. Transférer la suspension cellulaire au tube de 1,5 ml contenant les mélanges de plasmides et mélanger doucement.
   2. Transférer le mélange cellule-ADN à la cuvette de transfector, en accordant une attention à ne pas introduire des bulles. Introduire la cuvette dans le dispositif de Nucleofector et appliquer le programme A13 (cellules cultivées sur les départs) ou F16 (chargeur-libre).
      NOTE: Les appareils autres méthodes de transfection ou Nucleofector peuvent nécessiter l'optimisation de ces programmes ou les conditions de transfection.
   3. Reprendre la cuvette et, en utilisant les pipettes de transfert jetables disponibles dans le kit de nucléofection, de recueillir son contenu par l'application de 0,5 ml du milieu de placage et aspirer tout le volume. Effectuer cette étape rapidement, mais en douceur et en un seul mouvement.
   4. Plate goutte à goutte dans le 12-wplaque ell contenant le iDR4 et 500 pi de milieu d'étalement. Répétez les étapes 2.6.1 - 2.6.4 pour la prochaine condition expérimentale.
7. Placez la boîte de culture sur une étagère dans l'incubateur et le déplacer lentement en arrière et côté à l'autre pour répartir uniformément la suspension cellulaire. Incuber pendant 24 h avant le prochain changement de support pour permettre aux cellules de récupérer en présence d'un inhibiteur de ROCK uM 10 (Y-27632).

3. Sélection positive et négative de cellules Subissant CREM

1. médias Changement de culture quotidienne (1 ml / puits), et 2 - 3 d post-transfection, commencent sélection avec 100 ng / ml de puromycine.
   NOTE: Les concentrations optimales de réactifs de sélection positifs et négatifs doivent être déterminées expérimentalement pour chaque lignée cellulaire maître HPSC nouvellement généré. Effectuer une courbe kill ^13, en utilisant la lignée cellulaire maître pour déterminer la dose faible (concentration à laquelle la toxicité visuelle minimale est apparente après 7d de la sélection, mais la culture ne sont pas envahis), la dose optimale (la plus faible concentration à laquelle toutes les cellules sont mortes après 7 jours de la sélection), et à haute dose (concentration qui a provoqué une toxicité manifeste, tuant les cellules après 2 - 3 d) à la fois la puromycine et la fialuridine (FIAU).
   1. Aspirer le moyen CSEh. Laver avec 1 ml de PBS. Ajouter moyen de CSEh avec 100 ng / ml de puromycine.
2. Observer la croissance des cellules de sorte que la mort et la croissance sont équilibrés. Changer les médias avec la puromycine quotidienne, suite à l'étape 3.1.1. Lorsque le taux de croissance dépasse la mort cellulaire, augmenter la concentration de puromycine dans des blocs de 25 - 50 ng / mL jusqu'à un maximum de 250 ng / mL. Continuer la sélection puromycine pendant 5 - 7 d.
3. 3 - 4 d après le début de la sélection de la puromycine, autour du jour 6 post-transfection, commencer sélection avec 0,5 uM CARF. Changer les médias par jour et maintenir CARF pour pas plus de 7 jours consécutifs.

4. Expansion et caractérisation de CREM Lines

1. Après la fin de la sélection, autour de D14 - 15, les colonies de CREM résistants sont présents et constituent la nouvelle ligne de CREM. Diviser en vrac dans un rapport 1: 2 en suivant les procédures standard (passage 1, P1).
2. Plate 2 puits d'une plaque de 12 puits (ou désactiver les mangeoires, en fonction des conditions de culture normales de la lignée cellulaire maître d'origine). Utilisez un puits d'expansion, le stockage ou expérimental (aucune description supplémentaire de ces procédures est fait dans ce protocole), et l'autre pour la caractérisation.
3. Lorsque les cellules de P1 sont prêtes à se fendre, se dissocier du puits pour la caractérisation dans une suspension à cellule unique, comme décrit dans 2.4 et recueillir les cellules dans un tube de 15 ml. REMARQUE: Utiliser des cellules du HPSC WT (pas de modification génétique) et la lignée cellulaire de maître comme témoins négatifs et positifs, respectivement, pour la caractérisation.
4. Isoler à 300 xg pendant 5 min à température ambiante. Remettre en suspension dans 1 ml de PBS et on divise l'échantillon en deux par cytométrie de fluxet analyse de l' ADN ^13.
5. Analyse par cytométrie en flux ¹³ (300 ul):
   1. Ajouter du sérum de foetus de veau aux cellules dans du PBS jusqu'à une concentration finale de 5%. Transférer les cellules dans un tube de FACS propre avec un tamis cellulaire et les garder sur la glace.
      NOTE: La viabilité des cellules est élevé dans ces conditions, il est donc possible, mais pas nécessaire, d'utiliser un colorant fluorescent pour les cellules non viables (par exemple, 7-AAD ou PI).
   2. Procéder immédiatement à l'analyse dans un cytomètre de flux analyseur de cellules et enregistrer 20.000 - 30.000 événements. Pour l'analyse, définissez les portes ci-dessus GFP ou TDT fond florescence utilisant le WT échantillon témoin négatif.
6. Analyse de l' ADN ¹³ (700 ul):
   1. Transférer les cellules à un propre tube de 1,5 ml. Isoler à 300 xg pendant 5 min à température ambiante et aspirer le surnageant. Passez à l'extraction de l'ADN en utilisant un kit commercial et suivez les instructions du fabricant. Stocker le culot sec à -20 ° C pour latanalyse de er.
7. Mesurer la concentration d'ADN.
   1. Préparer des réactions de PCR standard en fonction des conditions de la figure 3 et le tableau 2 échantillons sur ¹³ Run PCR d' un gel d'agarose à 2% contenant 1 x gel tache d'ADN à 150 V pendant 15 -. 25 min. Analyser la course dans un analyseur de gel.

Résultats

Utilisation de AAVS1 ZNFs spécifique de lignées de cellules maître CSEh / iPSC entièrement caractérisés contenant hétérotypiques séquences cibles FRT ont été générées et décrites ^13. Les lignées cellulaires maîtres contenant FRT maintenues pluripotence et l' intégrité du génome après le traitement ZFN et exprimés de manière stable GFP in vitro et in vivo. CREM est effectuée par co - transfection des lignées de cellules parentales avec FLPe recombinase et les vecteurs donneurs CREM (figure 1A). Vecteurs CREM contiennent des séquences FRT identiques à ceux de la lignée cellulaire maître AAVS1 flanquant le transgène Figure 1B surveille CREM en utilisant l'expression constitutivement TDT pZ:.. F3-P CAGGS tdTPH-F Après transfection, HPSC forment de petits groupes de cellules réparties uniformément sur la couche iDR4 MEF, et transfectées HPSC expriment à la fois la GFP ainsi que transitoire TDT (Figure 1B, D 2). Les cellules sont autorisés à récupérer pendant 2 - 3d post-transfection avant de commencer la sélection. La sélection positive est d'abord commencé à utiliser une faible dose de puromycine afin de favoriser l'insertion CREM des donateurs. Puromycin est appliquée doucement au début, parce que la mort initiale cellulaire massive pourrait conduire à des cellules individuelles subissant une recombinaison, ce qui les rend incapables de survivre au processus. Dans les jours suivants, la concentration de puromycine doit être soulevée par étapes jusqu'à la dose optimale afin de permettre aux cellules recombinantes de croître dans de petites colonies tandis que les cellules nonrecombined meurent progressivement.

3 - 4 d après le début de la sélection positive (environ 6 D post-transfection), la sélection négative est commencée afin de sélectionner uniquement pour les événements de recombinaison FRT-médiation. CREM provoque la perte de la thymidine kinase (TK), le gène suicide et donc la sensibilité à la fialuridine (FIAU). La sélection négative appliquée à ce stade, dans lequel de petits groupes de 2-4 GFP ^- / TDT ⁺ (CREM) , les cellules sontcapable de résister à des concentrations optimales de CARF (Figure 1B, D 6), empêche l' intégration aléatoire, parce que , dans de tels événements, le gène Tk dans le locus AAVS1 reste inchangée. Présence de simultanée FRT-médiation et de l' intégration aléatoire est hautement improbable, comme l'a démontré l'absence d'événements d'intégration aléatoires plus tard lors de la caractérisation (figure 2B).

Le CREM GFP mixte ^- / TDT ⁺ colonies continuent de croître, tout en devenant plus homogène, de sorte que par D 9 - 10 post-transfection, certaines colonies de CREM mixtes pas entièrement sélectionnés peuvent être trouvés (figure 1B). GFP ^- / TDT ⁺ CREM colonies sont présentes uniquement lorsque le donneur et les deux CREM FLPe (2: 1) sont utilisés, tandis que CREM ne se produit pas en l'absence de FLPe (2: 0). Sélection complète avec CARF jusqu'au jour 13 - 15 post-transfection donne lieu à une GFP homogène ^- / TDT ⁺ culture. CREM donne une moyenne de 12,8 ± 6,8 (= 6 n) colonies Puro ^R / FIAU ^R en 15 jours ^13. Cytométrie de flux caractérisation de la ligne de CREM nouvellement généré (les colonies de CREM Puro ^R / FIAU ^R combinés dans une population de cellules nonclonal) confirme que 100% des cellules présentent le CREM GFP ^- / TDT ⁺ phénotype (figure 2A). Lorsque les donateurs de CREM sans expression constitutive d'un rapporteur fluorescent sont utilisées, la ligne Puro ^R / FIAU ^R CREM HPSC résultant est homogène GFP ^-.

Caractérisation par PCR de la ligne de CREM nonclonal démontre l'échange de la cassette complète (aucune trace de la cassette de la lignée cellulaire maître peut être détectée) et que le programme de sélection utilisé génère des lignes sans d'intégration aléatoires (à la fois du donneur de CREM et FLPe exprimant vecteur) (figure 2B). Ces résultats ont encore été prouvés par set transfert de UD, en outre, on a démontré que les lignes de CREM restent pluripotentes ^13. Cela rend plus nécessaire de réaliser soit l'évaluation de l'ensemble du génome de l'intégration aléatoire ou le test de la pluripotence au cours des expériences de CREM routine. En résumé, en utilisant ce protocole, HPSC lignées cellulaires transgéniques dans le locus AAVS1 sans intégration au hasard peuvent être facilement générés en 15 d à 100% d' efficacité et sans la nécessité d'une caractérisation.

Figure 1: Vue d' ensemble schématique du CREM (A) Chronologie du programme de sélection de CREM.. A gauche: la lignée cellulaire maître (MCL), abritant une cassette FRT flanquée (triangles) qui expriment la GFP et l'hygromycine-tk (lié par des peptides auto-cliver 2A) est transfectée par nucléofection (NF) avec le vecteur FLPe exprimant et le vecteur CREM donneur, which contient un gène de résistance à la puromycine sans promoteur (accepteur d' épissage - SA- Puro ^R) et une cassette expérimental variable (X). A droite: nouvelle ligne de CREM (RMCEL) obtenu après l'achèvement de la sélection avec la puromycine (triangle rouge) et CARF (ligne bleue). (B) CREM utilisant un constitutive TDT exprimant donneur et des rapports différents de l' ADN du donneur et FLPe ADN (0: 1, 2: 1, 2: 0) contrôlée par microscopie de fluorescence (GFP - fluorescence verte, TDT - fluorescence rouge) à différentes des points de temps. D 2 et 6: échelle barres représentent 100 um. D 10: barres d'échelle représentent 200 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2:. Caractérisation des CREM Lines (A) Détermination de CREM parcytométrie de flux. GFP et d' expression TDT est montré pour la ligne de WT, lignée cellulaire maître (MCL), et la ligne de CREM nouvellement généré au D 15 post-nucléofection utilisant un vecteur constitutif TDT-expression (CAGGS TDT), ou les bailleurs de fonds avec GFP entraînés par un promoteur goosecoid (GSCP GFP, marqueur endoderme définitif) ou un promoteur d'AAT (APOeAATp GFP, marqueur hépatocytes). (B) Confirmation du CREM (5 '/ 3' JA RMCEL), l' absence de (MCL) de la cassette de la ligne de la cellule principale (5 '/ 3' JA MCL), et le manque d'intégration aléatoire (5 '/ 3' / FLPe RI ) par PCR en utilisant les paires d'amorces décrites. L'ADN de WT, MCL, lignes de CREM (1 - 5), vecteur donneur d'CREM (+ RI), FLPe vecteur exprimant, et aucun contrôle de modèle (NTC) ont été utilisés. Figure modifiée à partir (Ordovas et al., 2015) ^13. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

dans les pages = "1">
Figure 3. Génération du Master Cell ligne et comparaison de Gene CREM-approprié Ciblage avec CREM en AAVS1 gauche. Le ciblage génique utilise des cellules WT non modifiés qui sont co - transfectées avec un donneur ( la cassette décrite dans la figure 1A pour la génération de la lignée cellulaire maître MCL) et ZFN optimisées spécifiques. Le processus pour compléter la caractérisation complète peut durer jusqu'à 3 mois. A droite: CREM est réalisée par cotransfection du donneur avec des vecteurs FLPe et une ligne pleine est généré, caractérisé en 15d. Gene efficacité du ciblage en AAVS1 est des études antérieures ^1,2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

ays "> Médias Composants La concentration finale moyen CSEh DMEM-F12, HEPES 80% moyen de remplacement de sérum 20% L-Glutamine 146 mg / mL Amino MEM non essentiels Acides Solution (100x) 1 fois 2-mercaptoéthanol 0,1 mM Pénicilline / Streptomycine 0,1% FGF basique humain 4 ng / ml milieu de culture Imef DMEM Haut Glucose sérum de veau fœtal (FBS) 15% Pénicilline- streptomycine 0,1% L-Glutamine 200 mM 4 mM Amino MEM non essentielsSolution Acides (100x de) 2x 2-mercaptoéthanol 0,1 mM Placage moyen moyen CSEh 100% inhibiteur de ROCK (Y-27632) 10 pm

Tableau 1. Composition des médias.

Essai	Vers l'avant		Sens inverse		amplicon	cycle PCR
5'JA MCL	CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC		CGTTACTATGGGAACATACGTCA		1.1 Kb	95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ºC (-0,5 ºC / cycle), 1' 30 ''] X15 - [95 ºC, 30 '' - 58 ºC, 30 '' - 72 ºC, 1 '30' '] X25 - 72 ºC, 5'
3'JA MCL	TAACTGAAACACGGAAGGAG		AAGGCAGCCTGGTAGACA		1,4 Kb	95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ºC (-0,5 ºC / cycle), 1' 30 ''] X15 - [95 ºC, 30 '' - 58 ºC, 30 '' - 72 ºC, 1 '30' '] X25 - 72 ºC, 5'
5'JA RMCEL	CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC		CATGTTAGAAGACTTCCTCTGC		1.1 Kb	95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ºC (-0,5 ºC / cycle), 1' 30 ''] X15 - [95 ºC, 30 '' - 58 ºC, 30 '' -72 ºC, 1 '30' '] X25 - 72 ºC, 5'
3'JA RMCEL	TTCACTGCATTCTAGTTGTGG		AAGGCAGCCTGGTAGACA		1,5 Kb	95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ºC (-0,5 ºC / cycle), 1' 30 ''] X15 - [95 ºC, 30 '' - 58 ºC, 30 '' - 72 ºC, 1 '30' '] X25 - 72 ºC, 5'
5'RI DONATEURS	GTACTTTGGGGTTGTCCAG		TTGTAAAACGACGGCCAG		0,5 Kb	95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 60 ºC, 30' '- 72 ºC, 30' '] X25 - 72 ºC, 5'
3'RI DONATEURS	CCTGAGTTCTAACTTTGGCTC		ACACAGGAAACAGCTATGAC		0,5 Kb
RI FLPe	CCTAGCTACTTTCATCAATTGTG		GTATGCTTCCTTCAGCACTAC		0,65 Kb	95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 60 ºC, 30' '- 72 ºC, 30' '] X25 - 72 ºC, 5'

Tableau 2. jeux d'amorces utilisées pour le génotypage par PCR. Modifiée de Ordovas et al., 2015 ^13.

Discussion

édition Gene méthodes loci portuaires sécuritaires demeurent un outil essentiel pour développer la transgénèse dans hPSCs. Bien que le caractère de refuge de AAVS1 a récemment été remise en question pour certaines applications ^13,18, ce locus reste actuellement le meilleur , caractérisé en lignées cellulaires humaines dérivées. La conscience de ses limites dans hPSCs peut aider à obtenir des données fiables. Par conséquent, AAVS1 devrait encore être un site utile, par exemple, pour les études de perte et intensité forte de fonction ou inductible expression / constitutive de facteurs qui nécessitent un contexte isogénique dans et entre les milieux génétiques déterminés.

Le locus AAVS1 a été ciblé par de nombreux groupes utilisant ZFNs, TALEN ou CRISPR / cas9 ^1,2,19. Ces nucleases augmentent de façon significative l'efficacité de la recombinaison homologue dans un lieu déterminé. Cependant, le processus de dépister et de caractériser complètement clones correctement ciblés, libres de integ aléatoireration et de maintenir la pluripotence et l' intégrité du génome peut prendre jusqu'à 3 mois ( à l' aide des outils d'édition optimisés de gènes) (figure 3). Les deux derniers peuvent être causés par des mutations possibles générés par l'activité de nucléase hors cible. Le système de CREM utilisé ici, cependant, offre une méthode rapide, efficace et élégante pour atteindre cet objectif en seulement deux semaines, une fois que des séquences cibles spécifiques recombinase sont préintégrées dans le locus AAVS1. Utilisation de la sélection positive / négative et un programme de sélection approprié sont les principaux facteurs qui contribuent à la simplification de l' édition des gènes dans le locus AAVS1 par CREM.

La caractérisation génotypique des nouvelles lignées transgéniques est significativement réduite (pas de dépistage clonale est nécessaire), et la caractérisation associée à l'activité hors cible nucléase est rendue indispensable en raison de la spécificité de FLPe pour FRT. La caractérisation peut également être réduit dans des expériences de routine CREM en démontrant laperte complète de l' expression de GFP à partir de la lignée cellulaire maître (figure 2A), parce que l' échange de la cassette complète et le manque d'intégration aléatoire ont déjà été suffisamment démontrée par PCR (figure 2B) et Southern blot ^13. L'utilisation de la sélection positive / négative constitue également la principale différence avec les rapports précédents. Plusieurs groupes décrits précédemment CREM dans hPSCs, soit dans le AAVS1 ou d' autres loci, utilisés une seule étape de sélection positive ^7,14,16. Cela ne constitue pas un avantage technique sur l'édition génétique réalisée avec des nucléases, parce que le dépistage de la colonie doit être effectuée également dans le but de démontrer l'intégration correcte et l'absence d'intégration aléatoire au niveau clonal.

L' utilisation de ce système CREM dans plusieurs CSEh lignes / iPSC nécessite préintégration du FRT contenant la cassette décrite dans le locus AAVS1 de chaque ligne indépendante. Cependant, une fois généré,sa rapidité et de simplicité, il est possible de développer des semi-haut débit écrans génétiques dans les paramètres isogéniques définis pour les applications mentionnées ci-dessus qui, autrement, serait techniquement très coûteuse en temps. En outre, tous les vecteurs de CREM sont construits dans le vecteur de ciblage de gène pZ AAVS1 utilisé pour cibler le locus avec ZFN, mais TALENs ou CRISPR / cas9 ont également été signalés. La dualité du vecteur CREM est très utile pour générer plusieurs lignes pour un transgène déterminé hPSCs avec ou sans FRT. Par exemple, un coup a démontré avec succès dans un écran génétique déterminée effectuée par CREM serait idéalement besoin d'être testé dans plusieurs lignes HPSC pour confirmer les résultats. En l'absence de plusieurs lignées de cellules maître CREM-approprié, gène cible directe du succès en utilisant nucléases pourrait être effectuée. L'utilité du double caractère des vecteurs de CREM a été prouvé par notre groupe ^20. Dans cette étude, la correction génique a été réalisée chez le patient dérivéLa démence frontotemporale (DFT) CSPi qui portent une mutation causant progranuline (PGRN) déficit d'expression. Gène de complémentation par ZFN médiées par insertion dans le locus AAVS1 d'une cassette qui rétablit les niveaux PGRN, corrige le phénotype déficient en corticogenèse associé à la présence de la mutation. En outre, une ligne comparable a été générée par CREM en CSEh WT pour être utilisé comme témoin pour l' expression PGRN exogène.

En l'absence de colonies recombinantes, vérifier l'efficacité de transfection du vecteur CREM des donateurs. l'efficacité de transfection supérieure à 30% donnent les résultats indiqués ci-dessus. efficacités plus faibles de transfection diminuent l'efficacité de recombinaison. Enfin, le système de CREM a été généré dans le locus AAVS1, mais elle est applicable à tout autre locus.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DR4 Fibroblastes embryonnaires de souris (MEF)	AMS bio	GSC-6204G	culture hPSC sur mangeoires
CF-1 MEF, traitement à la mitomycine	AMS Bio	GSC-6001M
EmbryoMax 0,1 % Solution de gélatine	Millipore	ES-006-B	Placage iMEF
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	31330-038
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G8540	Pour hESC medium
L-Glutamine, 200	mM Gibco	25030-081	Pour iMEF medium
2-Mercaptoethanol, 50  ; mM	Gibco	31350-010
MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x)	Gibco	11140-035
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)	Gibco	15140122
Humain basique FGF	Peprotech	100-18C
Y-27632 en solution	VWR	688001-500
DMEM High Glucose	Gibco	41965-039  ;
Sérum fœtal bovin (FBS)	Sigma Aldrich	F7524
Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénol	Gibco	25300-054	hPSC culture sur mangeoires
Matrigel, hESC qualifié	VWR	734-1440
mTeSR1 kit de milieu complet	Technologies de cellules souches	05850	Pour la culture sans feeder
StemPro Accutase Réactif de dissociation	Gibco	A1110501	Pour culture sans nourrisseur
Y-27632 en solution	VWR	56726
Kit de nucléofecteur de cellules souches humaines 2	Lonza	VVPH-5022
Chlorhydrate de puromycine	Gibco	A11138-03
FIAU (Fialuridine)	ABX	2910
Hygromycine B	Sigma Aldrich	H3274
pFLPe			Modifié à partir de pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) pour éliminer les donneurs de puromycine
RMCE	-	-	Modifié à partir de donneur pZ AAVS1 vecteur puromycine (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13
5 mL Tube à essai en polystyrène à fond rond, avec crépine cellulaire	Falcon	352235
PureLink Kit d’ADN génomique	Invitrogen
GoTaq Flexi DNA polymérase	Promega	M8298
Agarose	Sigma	A9539
SYBR Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102
Nucleofector 2b Device	Lonza (Amaxa)	AAB-1001
NucleoCounter NC-100	Chemometec	NC-100
BD FACS Canto	BD Biosciences	337175
NucleoCassette	Chemometec	941-0002