Automated Quantification et analyse des procédures de comptage cellulaire Utilisation ImageJ Plugins

Summary

Cet article décrit la quantification des micrographies d’hémocytomètre et de migration/invasion à l’aide de deux nouveaux plugins ImageJ open-source : le calculateur de concentration cellulaire et le compteur de tests de migration. En outre, il décrit les protocoles d’acquisition et d’étalonnage des images et discute en détail des exigences d’entrée des plugins.

Abstract

L'Institut national de ImageJ de santé est un puissant disponible gratuitement suite logicielle, de traitement d'image. ImageJ dispose d'algorithmes complets d'analyse de particules qui peuvent être utilisés efficacement pour compter diverses particules biologiques. Lorsque l'on compte un grand nombre d'échantillons de cellules, le hémocytomètre présente un goulot d'étranglement en ce qui concerne le temps. De même, le comptage des membranes à partir d'essais de migration / invasion avec le plug-in ImageJ compteur de cellules, bien que précise, est le travail exceptionnellement intensive, subjective, et infâme pour causer des douleurs au poignet. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé deux plugins au sein de ImageJ pour la seule tâche de hémocytomètre automatique (ou volume connu) et la migration / invasion cellulaire comptage. Les deux plugins reposent sur la capacité d'acquérir des micrographies de haute qualité avec un fond minimal. Ils sont faciles à utiliser et optimisé pour le comptage rapide et l'analyse des échantillons de grande taille avec des outils d'analyse intégrés pour aider à l'étalonnage des comptages. En combinant le principe de bases de compteur de cellules avec un algorithme de comptage et de post-comptage analyse automatisée, ce qui augmente considérablement la facilité avec laquelle les essais de migration peuvent être traités sans aucune perte de précision.

Introduction

Dans le comptage des cellules in vitro est une technique de base importante dans une large gamme d'expériences de culture tissulaire. Déterminer avec précision le nombre de cellules dans une culture est essentielle pour la reproductibilité expérimentale et la normalisation ^1,2. Le comptage des cellules peut être effectuée manuellement en utilisant un hémocytomètre ainsi que l' utilisation d' une variété de méthodes automatisées, chacun avec leurs propres avantages et inconvénients ^3,4,5. La plupart des méthodes automatisées pour le comptage des cellules appartiennent à l'une des deux classes, ceux qui utilisent ....

Protocol

Microscope 1. Composé et configuration de la caméra (Calculatrice de concentration cellulaire)

1. Augmenter ampoule luminosité complète avec le bouton de réglage de la lumière, passer à l'objectif 4X, et assurer les filtres de contraste de phase sont sélectionnés.
   NOTE: Tout inversé microscope à contraste de phase pour la culture de tissus avec un fond sombre, par exemple, PhP contraste de phase, peuvent être utilisés suivant les procédures de microscope et de la caméra standard.
2. Dans le logiciel du microscope, définir les paramètres de capture d'image aux valeurs par défaut.
   REMARQUE: Reportez-vous au manuel d'uti....

Results

Calculatrice cellule de concentration

La figure 1 présente le processus global de la CCC étalonnage et l' acquisition d'images dénombrable. Figure 1A et 1B représentent l'image d'étalonnage P-carré et le calcul de P-carré en pixels. La CCC détermine la concentration des cellules dans un volume donné par la formule:

Discussion

Les étapes critiques, le dépannage et Limitations

La nature même des méthodes de calcul automatiques, en particulier celles de l'analyse des particules, nécessite la capacité mathématique pour définir ces particules. Par conséquent, la précision de la fois Calculatrice cellule de concentration et de détermination de la migration compteur est majorly dépend fidélité d'image, qui est, à quel point l'image capturée ressemble à la membrane échantillon de cellules ou de test de migration.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Milieu liquide classique HyClone : RPMI 1640 - Avec L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Milieu de culture cellulaire
Sérum fœtal bovien (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Supplication médiatique
Lignée cellulaire HTR8/SVneo trophoblaste	Les cellules ont été obtenues auprès du Dr Charles Graham (Queen' Le		logiciel est conçu pour fonctionner avec n’importe quelle lignée cellulaire.
Trypsine	GIBCO BRL	27250-018	Préparée à 0,20 % (p/v) en 10 & micro ; M EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Plaques de culture cellulaire de 10 cm	SARSTEDT	833902	Toutes les plaques traitées pour la culture tissulaire seront appropriées
Inserts de membrane en polyester Transwell - 8.0  ; et micro ; m Taille des pores	Costar 3422 commandée à Fisher Scientific	7200150	Pour plaques à 24 puits ; Taille des pores : 8,0 & micro ; m; 6,5 mm de diamètre ; 0,33 cm2 surface
de croissance HARLECO Hématologie Colorants et réactifs, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore et commandé auprès de VWR	65044A, B, & C	L’ensemble de coloration Hemacolor se compose de trois flacons en polyéthylène de 500 ml (16,9 oz) et comprend un fixateur de méthanol (Solution 1), un colorant à l’éosine ou à l’acide (Solution 2) et un colorant au bleu de méthylène ou basique (Solution 3)
Applicateur à pointe de coton	Puritan Medical	806-WC
Lames de rasoir industriel à un tranchant	VWR	55411 - 055	Épaisseur : 0,30 mm (0,012")
Lames de microscope - Prénettoyées/Unies	Fisher Scientific	12550A3	Dimensions : 25 mm x 75 mm x 1,0 mm
Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles n° 1	Fisher Scientific	12-545E	Épaisseur : 0,13 à 0,17 mm ; Taille : 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Montage Moyen	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo Dissection	Leica Microsystems		Le microsope est équipé d’une caméra de microscope Leica Modèle MC170 HD et le logiciel de la caméra est Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build : 490]. Pièces de microscope :  ; LED3000 modèle d’éclairage ponctuel : MEB126, Leica M80 modèle de support optique M80, objectif achromat 1.0X, WD=90  ; mm Modèle : MOB306 & Objectif achromat 0,32X, WD=303  ; mm Modèle : MOB315, Objectif vidéo 0.5X Modèle : MTU-293
d’hémacytomètre	Allemagne  ;		0,100 mm Profondeur - 0,0025 mm2
Microscope à lumière inversée Olympus	Corporation CKX41SF		Le microsope est équipé d’une caméra couleur CMOS Lumenera Infinity 1-2 2.0 mégapixels et le logiciel de la caméra est Infinity analyze Version 6.5.2
Armoire à flux laminaire 1300 Series A2	Thermo Scientific  ;	Modèle : 1375	N’importe quelle armoire à flux laminaire pour les travaux de culture cellulaire conviendra.
Incubateur de culture cellulaire	Thermo Scientific  ;	Modèle : 370	N’importe quel incubateur de culture cellulaire conviendra - Les cellules ont été cultivées dans un environnement humide, 5 % CO2, 37 ° ; C  ;
ImageJ	NIH	Version 1.50e	Version minimale requise
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Version minimale requise