Automated Quantification et analyse des procédures de comptage cellulaire Utilisation ImageJ Plugins

Résumé

Cet article décrit la quantification des micrographies d’hémocytomètre et de migration/invasion à l’aide de deux nouveaux plugins ImageJ open-source : le calculateur de concentration cellulaire et le compteur de tests de migration. En outre, il décrit les protocoles d’acquisition et d’étalonnage des images et discute en détail des exigences d’entrée des plugins.

Résumé

L'Institut national de ImageJ de santé est un puissant disponible gratuitement suite logicielle, de traitement d'image. ImageJ dispose d'algorithmes complets d'analyse de particules qui peuvent être utilisés efficacement pour compter diverses particules biologiques. Lorsque l'on compte un grand nombre d'échantillons de cellules, le hémocytomètre présente un goulot d'étranglement en ce qui concerne le temps. De même, le comptage des membranes à partir d'essais de migration / invasion avec le plug-in ImageJ compteur de cellules, bien que précise, est le travail exceptionnellement intensive, subjective, et infâme pour causer des douleurs au poignet. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé deux plugins au sein de ImageJ pour la seule tâche de hémocytomètre automatique (ou volume connu) et la migration / invasion cellulaire comptage. Les deux plugins reposent sur la capacité d'acquérir des micrographies de haute qualité avec un fond minimal. Ils sont faciles à utiliser et optimisé pour le comptage rapide et l'analyse des échantillons de grande taille avec des outils d'analyse intégrés pour aider à l'étalonnage des comptages. En combinant le principe de bases de compteur de cellules avec un algorithme de comptage et de post-comptage analyse automatisée, ce qui augmente considérablement la facilité avec laquelle les essais de migration peuvent être traités sans aucune perte de précision.

Introduction

Dans le comptage des cellules in vitro est une technique de base importante dans une large gamme d'expériences de culture tissulaire. Déterminer avec précision le nombre de cellules dans une culture est essentielle pour la reproductibilité expérimentale et la normalisation ^1,2. Le comptage des cellules peut être effectuée manuellement en utilisant un hémocytomètre ainsi que l' utilisation d' une variété de méthodes automatisées, chacun avec leurs propres avantages et inconvénients ^3,4,5. La plupart des méthodes automatisées pour le comptage des cellules appartiennent à l'une des deux classes, ceux qui utilisent le principe de Coulter ou de cytométrie de flux. compteurs Coulter profitent de cellules résistance électrique afin de déterminer le nombre de cellules et la taille. Ils sont rapides, précis et moins coûteux que les cytomètres de flux. Cependant, ils sont rarement utilisés que pour le comptage des cellules en raison de leur coût considérable par rapport au comptage manuel ^3. Cytomètres de flux, d'autre part, sont chers, mais ils ont de nombreuses applications telles que le comptage des cellules, l'analyse de la forme des cellules, de structure et la cellule de mesure interne marqueurs de ^4,5. Les machines qui utilisent l'une de ces deux principes sont disponibles auprès de nombreux fabricants. Comptage manuel est abordable , mais beaucoup de temps et sujettes à des biais tandis que les méthodes automatisées viennent avec une fraction du temps nécessaire pour le comptage manuel , mais en utilisant des machines coûteuses ^6.

D' autres procédés de culture de cellules communes sont tests in vitro de la motilité cellulaire, à savoir, la migration cellulaire et l' invasion ^7. Migration et l'invasion des tests sont communément utilisées pour étudier la motilité cellulaire et l'invasivité en réponse à une réponse chimiotactique. En outre, ils sont largement utilisés pour étudier le développement embryonnaire, la différenciation, la réponse inflammatoire, et les métastases de plusieurs types de cellules ^7-11. Les cellules qui ont migré ou envahies à travers la membrane poreuse d'un test de migration peuvent être quantifiés de deux façons différentes. En premier lieu, par coloration des cellules avec un colorant fluorescent, de la dissociation from la membrane et la quantification en utilisant un lecteur de fluorescence ^12. Une limitation de cette méthode de quantification est qu'aucun enregistrement peut être retenu des membranes et il n'y a aucune possibilité pour une analyse ultérieure ^13. La deuxième méthode de quantification est pour la migration / cellules à fixées et colorées par un colorant fluorescent ou plus communément, avec des colorants cytologiques tels que le cristal violet, toluidine colorant bleu ou hématoxyline envahi; puis les cellules sont quantifiées manuellement à l' aide des images microscopiques inversées de ces membranes qui est une tâche de longue haleine très ^12,13.

Pour pallier les inconvénients de comptage manuel des cellules, deux marqueurs fiables et précises cellules automatisées pour la concentration des cellules et pour l'essai de migration ont été développés. Ces contre algorithmes cellulaires automatisés ont été développés pour ImageJ comme un plugin Java en utilisant l'ordinateur de la langue d'Oracle. ImageJ est un outil de traitement d'image publique et largement utilisé développé par l'Institut national de Heanté (NIH) ^14,15; ainsi, l'écriture de ces plugins pour ImageJ facilite l'intégration dans la communauté biologique.

L'automatisation de comptage de cellules assure un débit élevé et la reproductibilité par rapport à un comptage manuel. Bien que d' autres logiciels et plugins disponibles peuvent être utilisées pour calculer la concentration de cellules par analyse d'image ^5,16,17, Concentration cellulaire Calculatrice plug - in est rapide et peut également gérer des dilutions de cellules et de traitements. En outre, tous les résultats et les calculs de ces deux compteurs peuvent être enregistrés et exportés. Les deux plugins décrits dans le présent document sont optimisés pour l'utilisation d'un microscope à contraste de phase pour l'imagerie des cellules vivantes et un grand champ de vision (ensemble de capture de la membrane) imagerie pour les membranes d'essai de migration à travers l'utilisation d'un champ de dissection. Les plugins sont disponibles gratuitement en téléchargement avec des instructions d'installation à partir de: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Protocole

Microscope 1. Composé et configuration de la caméra (Calculatrice de concentration cellulaire)

1. Augmenter ampoule luminosité complète avec le bouton de réglage de la lumière, passer à l'objectif 4X, et assurer les filtres de contraste de phase sont sélectionnés.
   NOTE: Tout inversé microscope à contraste de phase pour la culture de tissus avec un fond sombre, par exemple, PhP contraste de phase, peuvent être utilisés suivant les procédures de microscope et de la caméra standard.
2. Dans le logiciel du microscope, définir les paramètres de capture d'image aux valeurs par défaut.
   REMARQUE: Reportez-vous au manuel d'utilisation du microscope pour trouver l'emplacement de ces paramètres.
   1. Set 'éclat »,« contraste »et« saturation »à 100% et« gamma »et« gain »de 1,0.
      REMARQUE: Selon le logiciel, «luminosité» et «contraste» peut par défaut à une valeur de 0% au lieu de 100%.
   2. Set de capturer des images en noir et blanc en utilisant la plus haute résolution available (1600 x 1200 pixels (px) ou plus).
      NOTE: Une «saturation» de 0% est suffisant si un cadre noir et blanc est indisponible.
3. Placez un hémocytomètre norme sur la platine du microscope et capturer une image telle que représentée sur (figure 1A); ceci est «l'image du volume d'étalonnage». Ajuster le calendrier d'exposition au besoin.

2. image Volume Calibration

1. Ouvrir ImageJ et dans le menu Plugins, démarrer la calculatrice cellule de concentration (CCC) de plugin, par exemple, Plugins> Analyzer> 'Calculator cellule de concentration ».
   1. Si le panneau du côté droit "Volume d'image Calibration 'est pas visible, cliquez sur« Calibrer »pour le montrer.
2. Dans ImageJ, ouvrez le «image d'étalonnage du volume" de l'étape 1.3 ( "Fichier"> "Ouvrir") et CCC, cliquez sur le bouton 'Get image Dimension'.
   NOTE: Cela remplira à la fois Largeur de l'image etzones de texte de la hauteur avec la résolution d'image en pixels automatiquement.
3. Dans ImageJ, sélectionnez l'option 'outil Ligne droite' à côté des outils de sélection et de tracer une ligne droite sur toute la longueur de l'hémocytomètre primaire (P) -carré démontré (figure 1B) en cliquant et en faisant glisser le curseur.
   1. Appuyez sur la touche «M» pour afficher la fenêtre des résultats contenant les mesures de ligne droite. Tapez la valeur de la colonne de longueur dans le 'P-carré Longueur' textbox en CCC (figure 1B).
   2. Cliquez sur le bouton 'Calculer volume Image' à la sortie du volume d'image dans le champ de volume d'image. Alternativement, si le volume de l'image est déjà connu, tapez le volume nL dans le champ du volume d'image.
4. Cliquez sur le bouton «Enregistrer».
   NOTE: Le plugin est maintenant calibré.

Exposition Calibration 3. Caméra

1. Après la récolte des cellules pourcomptage par hémocytomètre, charge 10 pi de cellules dans une chambre de l'hémocytomètre et le placer sur la platine du microscope.
2. En utilisant les mêmes paramètres de l'étape 1.2, régler le temps d'exposition de sorte que les lignes de la hémocytomètre de fond disparaissent.
   1. Ajuster la mise au point de sorte que l'intérieur des cellules est plus foncée que la membrane cellulaire, ce qui indique mise au point à l'intérieur de la section transversale centrale de la cellule et non pas des pôles.
   2. Ajuster en outre l'exposition de sorte que les cellules ne sont pas surexposés et ressemblent à celles représentées sur la (figure 1C).
      NOTE: Les lignes de hémocytomètre légèrement visibles sont acceptables. Il est recommandé d'enregistrer ou d'enregistrer ces paramètres pour maintenir la précision et la reproductibilité.

4. Image Acquisition

1. Pour chaque échantillon de cellules, charge 10 pi dans les deux chambres du hémocytomètre pour augmenter l' inférence statistique puissance ^2. Placer le hémocytomètre sur la platine du microscopepour l'imagerie.
   REMARQUE: La résolution et le grossissement de chaque image doit être le même que «l'image de calibration du volume». Le plugin compte toutes les images de tout dossier sélectionné; garder les images pour être comptées ensemble dans le même dossier.
   1. Si une fonction d'incrémentation automatique de nom de fichier est disponible, allumez-le et assurez-vous que chaque image est pas représenté après la capture pour augmenter le débit.
      REMARQUE: manuellement l'enregistrement et la fermeture de chaque image va considérablement ralentir le processus. Reportez-vous au manuel d'utilisation du microscope pour obtenir des informations sur la disponibilité d'une fonction d'auto-incrémentation.
   2. Capturez au moins trois images non-chevauchement de la région centrale de l'hémocytomètre bien plus (5-10) est recommandée pour augmenter la précision.
      REMARQUE: Éviter le dessus et les zones inférieures des chambres que les cellules ont tendance à augmenter la densité aux deux endroits. Prenez le même nombre d'images pour chaque chambre. Cela est nécessaire pour le bon fonctionnement du plug-in pendant le comptage.

5. Comptage et Dilutions image

1. En CCC, cliquez sur "Count cellules" et observer la boîte de dialogue Choisir un répertoire. Sélectionnez un dossier pour être compté.
2. Observez la zone de saisie du numéro d'échantillon après avoir sélectionné un dossier. Entrez le nombre d'images prises par chambre, soit, 4.1.2, et cliquez sur 'Ok'. Le plugin va maintenant compter tous les jpg, tiff, et des images de png dans le dossier sélectionné dans l'ordre alphabétique.
   NOTE: En cliquant sur le bouton 'Viewer Sample' fera apparaître la fenêtre de la visionneuse d'échantillons affichant des informations sur les échantillons comptés. la concentration des échantillons est la concentration moyenne de toutes les images prises par chambre. Des échantillons avec des concentrations sans unité peuvent être ajoutés à cette liste, comme l'ajout d'un médicament ou une petite molécule traitement.
   1. Recount les échantillons de cellules si les concentrations varient de manière significative dans les comptes des mêmes échantillons (section 4).
      REMARQUE: Pour calculer les dilutions pour tout til comptait-échantillons, la CCC utilise automatiquement la formule C ₁ V ₁ = C ₂ V _2.
3. Utilisez le scénario de l'ensemencement de 15.000 cellules par 200 ul dans 30 puits d'une plaque à 96 puits + 1 supplémentaire:
   1. Réglez le champ à droite de l'étiquette de C2 à 15.000 et le volume textbox de concentration à 200, en changeant l'unité de zone de liste déroulante à côté de 'ul'.
      NOTE: Le plugin sera finalement calculer la concentration dans les cellules / mL.
   2. Assurez-vous que la zone de liste déroulante de volume a V2 sélectionné (volume final) et dans la zone de texte à la droite entre 6200 (200 pi x (30 + 1)), en sélectionnant «ul» dans la zone de liste déroulante de l'unité de volume.
4. Cliquez sur «Calculer Dilution» pour ajouter la dilution actuellement entré à la zone de liste en bas à gauche.
   NOTE: Pour chaque dilution supplémentaire, seront résolus pour chaque échantillon et affichées dans le diagramme d'arbre à droite. Double-cliquez sur chaque entrée pour se développer.
5. Cliquer sur til bouton 'Enregistrer' sous le bouton 'Viewer Sample' écrire à déposer toutes les données et les dilutions d'échantillon.
6. NOTE: Ces données peuvent être récupérées à tout moment en cliquant sur "Load" et en sélectionnant le fichier enregistré.

6. Migration et Invasion (Counter)

1. Effectuer les essais de migration et d' invasion en utilisant la méthode de la chambre de Boyden norme ^7-9.
2. Après que les cellules ont migré / envahi, retirez soigneusement les médias au sein de l'insert en inversant et en tapotant doucement. Wick loin des médias en excès ont adhéré au fond de la membrane en touchant le bord d'une serviette en papier.
   NOTE: Ne touchez pas la membrane elle-même à la serviette, cela peut déloger les cellules adhérentes.
3. Fixer et colorer les cellules comme rapporté ^7-9 dans une plaque de 24 puits mis en place avec chaque rangée contenant ~ 500 ul d'une solution différente, par exemple, fixatif, Teinté 1, Teinté 2, et de l' eau distillée deux fois (ddH ₂ O). Remplir une seconde plaque avec PBS 1x to placer les inserts en avant de couper.
4. Laver les inserts en les plaçant dans des puits remplis de ddH ₂ O et remplir l'insert avec ddH ₂ O. Videz l'eau avant pistonnage élimine les cellules par inversion.
5. Utilisez un coton propre pour éliminer les cellules non migrés / non envahie par le haut de la membrane en prenant soin de ne pas endommager la membrane. Être complet autour des bords de la membrane.
6. Couper la membrane à l'aide d'un rasoir ou un scalpel et transférer soigneusement la membrane (côté fond vers le haut) sur une lame de verre propre.
7. Ajouter une petite goutte de solution de montage au-dessous et au-dessus de la membrane et recouvrir d'une mince couverture de glissement.
   REMARQUE: Évitez de piéger des bulles au sein de la solution de montage pour préserver l'exactitude des chiffres.

7. Dissection Portée et Caméra Setup

1. Allumez la source et la caméra lumière du microscope.
   REMARQUE: Reportez-vous au manuel d'utilisation du microscope pour obtenir des instructions détaillées.
2. Esprithin logiciels, définir les paramètres de capture d'image du microscope aux valeurs par défaut.
   REMARQUE: si une fonction d'étalement existe, une valeur de quatre est recommandée. Ceci est un bon compromis entre le degré de la moyenne et l'acquisition de l'image du temps. De même, un faible degré de netteté peut augmenter la fidélité des images.
   1. Set 'éclat »,« contraste »et« saturation »à 100% et« gamma »et« gain »de 1,0.
      REMARQUE: Selon le logiciel, «luminosité» et «contraste» peut par défaut à une valeur de 0% au lieu de 100%.
   2. Réglez l'affichage (en temps réel) et la résolution de capture à leurs valeurs maximales (1600 x 1200 px et 2.592 x 1.944 px, respectivement).
      NOTE: Résolution de l'écran peut être ajustée selon les besoins, si le taux de rafraîchissement est trop lent. Des résolutions plus faibles, il sera plus difficile de se concentrer avec précision, mais augmenter le taux de rafraîchissement.
3. Pour l'étape de la portée de dissection, utiliser un backgro solide blancund; un fond noir ou en verre est insuffisante.
4. Utilisez la source de lumière au-dessus-étape, de préférence de deux lumières flexibles LED à droite et à gauche de la scène.
   NOTE: Un dessous-stade source de lumière va éclairer les pores dans la membrane de test de migration qui peuvent influencer négativement la précision des comptages ultérieurs.
5. Placer un essai de migration membrane diapositive terminée sur la scène. En regardant l'image en temps réel affichée par le logiciel, réglez le grossissement avec le bouton de réglage du zoom de telle sorte que les bords d'une seule membrane ne sont que dans le champ de vision de la caméra.
   REMARQUE: Placer la lame sur une plaque de verre overtop le blanc scène de fond, il est plus facile à manoeuvrer la glissière pour l'imagerie.
6. Ajustez les positions des sources lumineuses (7.6.1) et le temps d'exposition à reproduire aussi fidèlement que possible l'image idéale représentée sur la figure 2A. Selon la luminosité, temps d'exposition de 5-60 ms devrait être suffisant.
   REMARQUE:L'objectif est de produire une image avec aussi peu de couleur de fond que possible et une membrane éclairée uniformément sans réduire la fidélité d' image, à savoir, la surexposition conduisant à une perte de cellules visibles.
   1. Positionner les sources de lumière gauche et droite à un angle faible par rapport à la diapositive. Cela aidera à éliminer fond tache et les aberrations chromatiques. Essayez de garder chaque source de lumière directement en face de l'autre.
      REMARQUE: Pendant la manoeuvre de chaque source de lumière en position, tourner l'autre au large. Cela contribue à centrer la zone d'illumination sur la membrane elle-même plus facilement et avec précision.
7. Retirer la lame et la balance des blancs de l'image à l'aide d'un seul clic dans le logiciel de microscope.
   NOTE: Le microscope est maintenant calibré. Enregistrer autant de paramètres que possible pour une utilisation future et de prendre note des positions de source de lumière et de l'intensité.

8. Image Acquisition et Flatfield

1. Dans le logiciel, réglezl'emplacement du dossier de capture, et la capture d'une image par membrane. Nommez les images suivant le modèle général de: Nom - ###, par exemple, contrôle - 001.tif, Contrôle - 002.tif, Test médicament - 001.tif, et ainsi de suite.
   NOTE: Pour obtenir les meilleurs résultats d'image, enregistrez le type de fichier d'image tiff sur les autres formats lossy tels que jpeg.
   REMARQUE: Les images ne suivent pas le modèle général sera toujours compté, mais ne seront pas soumis à groupement automatisé et Fielding plat.
   1. Si la correction Flatfield est souhaitée, pour chaque diapositive trouver une zone vide et prendre une image vierge après la convention de nommage: Nom - Blank.
      NOTE: Une ébauche est une zone sur la diapositive qui ne contient pas de membrane et représente l'éclairage de fond.
   2. Immédiatement avant l'imagerie, aplatir chaque membrane en appliquant une pression sur la lamelle et enlever autant de bulles piégées que possible.
2. Dans ImageJ, aller à Plugins et ouvrir le plugin TC; par exemple, Plugins> Analyse> & #39; Transwell contre.
3. Dans TC, cliquez sur le bouton 'Flatfield' et observer la boîte de dialogue Choisir un répertoire. Sélectionnez le dossier dans lequel les images de la membrane ont été sauvées.
   NOTE: Seules les images enregistrées avec le modèle général ci-dessus sera automatiquement Flatfield corrigée et enregistrée dans un nouveau dossier appelé Flatfield dans le dossier choisi. Voir la figure 2B pour un exemple d'une image flatfield corrigée.

9. Paramètres de configuration

1. Ouvrez une image de membrane de test de migration dans ImageJ ( 'Fichier'> 'Ouvrir') et sélectionnez Image> Réglages> 'Seuil de couleur ... ». Observez la fenêtre Seuil de couleur pour ajuster les couleurs qui seront filtrés de l'image.
   1. Au bas de la fenêtre, définir la méthode de seuillage à 'Shanbhag', couleur Seuil pour «Blanc», et de l'espace couleur à «RGB» (bleu vert rouge); Fond sombre décochez si elle est sélectionnée.
   2. Réglez le hautcurseurs en cliquant et en faisant glisser les marqueurs à 0 et les curseurs inférieurs à 255 (laisser les curseurs inférieurs à 255). Assurez-vous que l'image est entièrement blanc.
2. Ajuster les meilleurs curseurs verts et rouges jusqu'à ce que seuls les noyaux sont visibles.
   REMARQUE: Les paramètres sélectionnés varieront entièrement sur la tache cellulaire utilisée. Voir la figure 2C.
3. Dans le plugin TC, saisissez les valeurs des principaux curseurs RGB en RGB de seuil »des champs de saisie des paramètres de configuration associés. Cliquez sur le "Ajouter / Modifier" bouton et remplacer la configuration.
   1. Laisser la taille Range Lower et Upper valeurs à 1 - Infinity.
4. Dans le panneau Paramètres de configuration, cliquez sur "Enregistrer" pour écrire les paramètres sur le disque dur.

10. Comptage Images et Calibration

1. Ouvrez le plugin TC (8.2) et cliquez sur «Count Folder» et observer la boîte de dialogue Choisir un répertoire. Sélectionnez le dossier à compter unnd attendre qu'elle se termine.
2. Chaque échantillon compté est automatiquement ajouté à la table principale. Les colonnes clés sont «comte», «Qualité» et «Calibrer?».
   NOTE: Le comte de non-étalonné est le nombre de particules par membrane dans la zone affichée dans la colonne «Plage de la région».
   NOTE: La qualité varie d'environ -0,8 à 1,7; Q ≥ 0,5 est acceptable.
   1. Observer une coche dans la «Calibrer? colonne si une image est en position de calibration en fonction de sa ressemblance avec les paramètres idéaux.
      REMARQUE: la qualité et d'étalonnage peuvent suggérer que les paramètres actuels sont peut-être insuffisantes. Si, après une bonne 'Color Thresholding' et 'Taille Ranges' ont été sélectionnés et l'étalonnage est toujours suggéré, l'inspection de l'original et compté les images devraient être le déterminant final d'un compte valide.
3. Sélectionnez Tous les échantillons du tableau Signalé pour le calibrage.
   1. Faites un clic droit dans til table et sélectionnez Recount> 'Taille suggérée. Cela recompter les images avec une zone de particules minimum suggéré.
   2. Faites un clic droit et sélectionnez 'Show Plot'. Observer la parcelle fréquence de dispersion des zones de particules. Une image idéale aura un graphique ressemblant à une longue distribution normale unilatérale à droite, à savoir, la courbe en cloche. Voir la figure 3B.
   3. Régler la gamme de taille inférieure, si nécessaire, en sélectionnant l'échantillon, clic droit, et en sélectionnant Recount> «Réglages manuels». Observez la boîte de dialogue d'installation manuelle. Entrez les paramètres souhaités et cliquez sur le comte de raconter l'image avec les nouveaux paramètres.
4. Pour régler les comptes manuellement, sélectionner les échantillons, en cliquant droit sur la table, et sélectionnez «Ouvrir l'image avec des comptes». Observez l'image originale avec des marqueurs rouges représentant chaque particule comptée par le plugin.
   NOTE: Recount> 'Show compté image binaire »peut être utile de vérifier à quel point iertaines cellules sont résolus par le seuillage couleur.
   1. Pour ajouter un compte, maintenez 'Ctrl' et le clic gauche. Observer un marqueur à l'emplacement du curseur qui sera ajouté aux échantillons de comptage totale. Pour supprimer un marqueur, cliquez droit sur l'image. Le plugin va supprimer le marqueur le plus proche du curseur.
   2. Pour supprimer un groupe de marqueurs, utilisez un outil de sélection dans ImageJ pour sélectionner une région d'intérêt (ROI). Tout en maintenant "Ctrl", cliquez droit sur l'image et tous les marqueurs à l'intérieur du retour sur investissement seront supprimés. Observez le nombre de cellules dans la colonne «Count».

11. Enregistrement / Résultats d'ouverture et exportation au format CSV

1. Dans TC, aller à la barre de menu et cliquez sur "Fichier"> "Enregistrer les résultats". Observer la boîte de dialogue Résultats Enregistrer. Choisissez un nom et de destination et cliquez sur «Enregistrer».
   1. Utilisez 'Fichier'> 'Ouvrir les résultats »pour charger un fichier contenant toutes les données affichées dans le tableau principal, including la parcelle.
      REMARQUE: Le fichier de résultats enregistre les répertoires les images sont enregistrées dans Si les images d'origine sont déplacés après la sauvegarde, la «image originale ouverte" et "Ouvrir l'image avec des comptages de fonctions échoueront..
   2. Pour réinitialiser le répertoire de l'image, sélectionnez les échantillons, cliquez à droite de la table, et sélectionnez «Réinitialiser le répertoire d'image». Observer la boîte de dialogue Choisir un répertoire. Sélectionnez le nouveau dossier et si les images existent, les répertoires seront réinitialisés. Re-enregistrer le fichier de résultats.
2. Pour enregistrer un fichier Comma Separated Values ​​(CSV), dans la barre de menu Aller à la "Fichier"> "Exporter au format .csv. Cela produit un fichier avec des échantillons organisés en groupes statistiques avec la moyenne compter et erreur standard de la moyenne; sa mise en page est conçu pour la représentation graphique rapide dans les programmes graphiques communs.
   NOTE: Les groupes statistiques sont basées sur les groupes créés au sein de TC.
   1. Si les échantillons suivent le modèle de nom général, sélectionner les échantillons à être grouped, clic droit et sélectionnez «regroupement automatique». Cela ajoute des échantillons avec le même "Nom" au même groupe. En utilisant l'exemple de contrôle - 1, Contrôle - 2, Traitement - 1, Traitement - 2: les deux contrôles seraient ajoutés au groupe «contrôle» et des traitements pour 'Traitement'.
   2. Ajouter des échantillons manuellement à des groupes en double-cliquant «Groupe» la cellule et en tapant de l'échantillon dans le nom du groupe. Sélectionnez les échantillons à être ajoutés à ce groupe, cliquez à droite et sélectionnez «Ajouter au groupe».

Résultats

Calculatrice cellule de concentration

La figure 1 présente le processus global de la CCC étalonnage et l' acquisition d'images dénombrable. Figure 1A et 1B représentent l'image d'étalonnage P-carré et le calcul de P-carré en pixels. La CCC détermine la concentration des cellules dans un volume donné par la formule:

Discussion

Les étapes critiques, le dépannage et Limitations

La nature même des méthodes de calcul automatiques, en particulier celles de l'analyse des particules, nécessite la capacité mathématique pour définir ces particules. Par conséquent, la précision de la fois Calculatrice cellule de concentration et de détermination de la migration compteur est majorly dépend fidélité d'image, qui est, à quel point l'image capturée ressemble à la membrane échantillon de cellules ou de test de migration...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu liquide classique HyClone : RPMI 1640 - Avec L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Milieu de culture cellulaire
Sérum fœtal bovien (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Supplication médiatique
Lignée cellulaire HTR8/SVneo trophoblaste	Les cellules ont été obtenues auprès du Dr Charles Graham (Queen' Le		logiciel est conçu pour fonctionner avec n’importe quelle lignée cellulaire.
Trypsine	GIBCO BRL	27250-018	Préparée à 0,20 % (p/v) en 10 & micro ; M EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Plaques de culture cellulaire de 10 cm	SARSTEDT	833902	Toutes les plaques traitées pour la culture tissulaire seront appropriées
Inserts de membrane en polyester Transwell - 8.0  ; et micro ; m Taille des pores	Costar 3422 commandée à Fisher Scientific	7200150	Pour plaques à 24 puits ; Taille des pores : 8,0 & micro ; m; 6,5 mm de diamètre ; 0,33 cm2 surface
de croissance HARLECO Hématologie Colorants et réactifs, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore et commandé auprès de VWR	65044A, B, & C	L’ensemble de coloration Hemacolor se compose de trois flacons en polyéthylène de 500 ml (16,9 oz) et comprend un fixateur de méthanol (Solution 1), un colorant à l’éosine ou à l’acide (Solution 2) et un colorant au bleu de méthylène ou basique (Solution 3)
Applicateur à pointe de coton	Puritan Medical	806-WC
Lames de rasoir industriel à un tranchant	VWR	55411 - 055	Épaisseur : 0,30 mm (0,012")
Lames de microscope - Prénettoyées/Unies	Fisher Scientific	12550A3	Dimensions : 25 mm x 75 mm x 1,0 mm
Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles n° 1	Fisher Scientific	12-545E	Épaisseur : 0,13 à 0,17 mm ; Taille : 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Montage Moyen	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo Dissection	Leica Microsystems		Le microsope est équipé d’une caméra de microscope Leica Modèle MC170 HD et le logiciel de la caméra est Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build : 490]. Pièces de microscope :  ; LED3000 modèle d’éclairage ponctuel : MEB126, Leica M80 modèle de support optique M80, objectif achromat 1.0X, WD=90  ; mm Modèle : MOB306 & Objectif achromat 0,32X, WD=303  ; mm Modèle : MOB315, Objectif vidéo 0.5X Modèle : MTU-293
d’hémacytomètre	Allemagne  ;		0,100 mm Profondeur - 0,0025 mm2
Microscope à lumière inversée Olympus	Corporation CKX41SF		Le microsope est équipé d’une caméra couleur CMOS Lumenera Infinity 1-2 2.0 mégapixels et le logiciel de la caméra est Infinity analyze Version 6.5.2
Armoire à flux laminaire 1300 Series A2	Thermo Scientific  ;	Modèle : 1375	N’importe quelle armoire à flux laminaire pour les travaux de culture cellulaire conviendra.
Incubateur de culture cellulaire	Thermo Scientific  ;	Modèle : 370	N’importe quel incubateur de culture cellulaire conviendra - Les cellules ont été cultivées dans un environnement humide, 5 % CO2, 37 ° ; C  ;
ImageJ	NIH	Version 1.50e	Version minimale requise
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Version minimale requise