Article de méthode

Le dépistage de la Endocrine Activité en eau à l'aide disponibles dans le commerce In vitro Transactivation Bioassays

DOI :

10.3791/54725

⸱

4 décembre 2016

 ,  ,  ,  , 
1Southern California Coastal Water Research Project Authority, 2Department of Physiological Sciences, University of Florida

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un protocole de dépistage de l’activité endocrinienne dans des extraits organiques d’échantillons d’eau, y compris les effluents d’eaux usées traitées et les eaux de surface (réceptrices), a été adapté à l’aide d’essais biologiques de transactivation in vitro par arrêt de division (« congélation et dégel ») disponibles dans le commerce.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans les essais biologiques de transactivation in vitro ont montré des résultats prometteurs comme outils de surveillance de la qualité de l' eau, mais leur adoption et l' application généralisée a été entravée en partie à cause d'un manque de méthodes normalisées et la disponibilité de la technologie robuste, facile à utiliser. Dans cette étude, disponibles dans le commerce, les lignes de division cellulaire arrêtés ont été utilisés pour dépister quantitativement l'activité endocrinienne des substances chimiques présentes dans les échantillons d'eau d'intérêt pour les professionnels de la qualité de l'environnement. Un seul protocole standardisé qui comprenait assurance qualité / contrôle de la qualité (AQ / CQ) des contrôles a été développé pour l'activité œstrogène et récepteur des glucocorticoïdes (ER et GR, respectivement) en utilisant un essai Fluorescence Resonance Energy Transfer à base de cellules (FRET). Des échantillons de l'effluent traité des eaux usées municipales et de l'eau de surface des systèmes d'eau douce en Californie (USA), ont été extraits par extraction en phase solide et analysés pour l'activité endocrinienne utilisant le proto standardisécol. Contexte et dose-réponse pour les produits chimiques de référence spécifiques finaux remplies d'AQ / CQ directives jugées nécessaires pour une mesure fiable. La réponse de dépistage du bioessai pour les échantillons d'eau de surface est en grande partie non détectable. En revanche, les échantillons d'effluents des usines de traitement secondaire ont eu l'activité mesurable la plus élevée, avec des concentrations équivalentes de biodosage estimée (BEQ) jusqu'à 392 ng dexaméthasone / L pour GR et 17 ng 17β-estradiol / L pour ER. La réponse de l'essai biologique d'un échantillon d'effluent tertiaire est inférieure à celle mesurée pour les effluents secondaires, ce qui indique une faible résiduelle de perturbateurs endocriniens après le traitement avancé. Ce protocole a montré que dans les essais biologiques de transactivation in vitro qui utilisent disponibles dans le commerce, la cellule de division arrêté "kits", peut être adapté à l' écran pour l' activité endocrinienne dans l' eau.

Introduction

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Current surveillance de la qualité de l'eau repose sur la capacité à mesurer avec précision et précisément la présence de contaminants chimiques comme un proxy pour l'exposition à la faune et les humains. Cependant, cette surveillance chimique par produit chimique et de l'évaluation de paradigme ne peuvent pas suivre le rythme de l'univers chimique en constante évolution que nous sommes confrontés. Comme nous en apprendre davantage sur le sort et les effets des produits chimiques synthétiques et naturels, nous continuons à chercher des outils de mesure qui répondent attendus impacts biologiques, et que dans le même temps sont insensibles aux variations de la production chimique, l'utilisation et l'entrée de l'environnement. Ces outils sont particulièrement pertinentes pour comprendre si des produits chimiques inconnus ou nouveaux, et les produits de transformation, méritent notre attention. En outre, des mélanges complexes de produits chimiques présents dans l'eau sont mal traités par une surveillance individuelle chimique. Ainsi, nous sommes confrontés au défi de la modernisation de la boîte à outils de surveillance existants pour mieux répondre à ces questions dans les eaux de surface that reçoivent décharge des effluents traités des eaux usées et urbain / ruissellement des eaux pluviales.

Au cours des dernières années, les techniques bioanalytiques ont montré des résultats prometteurs comme outils de dépistage pour l'évaluation de la qualité de l'eau. En particulier, les bioessais in'vitro qui répondent à des produits chimiques agissant par l' intermédiaire connu, les modes d'action spécifiques 1,2 sont d' un grand intérêt pour la communauté de surveillance de l' environnement 3. De nombreuses enquêtes ont utilisé dans des essais biologiques in vitro pour quantifier l'activité endocrinienne de l' eau potable, de surface et les eaux usées 4 -6. En outre, un certain nombre d'essais biologiques cibles événements initiateurs moléculaires (par exemple, l' activation du récepteur) qui peut potentiellement être liée à des effets délétères par voie de résultat défavorable des analyses 7,8.

L'évolution de la bioscreening pour l' évaluation de la qualité de l' eau a été relativement rapide, avec des centaines de différents paramètres dans les essais biologiques in vitro ayant été évalués pour leurutilitaire 9,10. Actuellement, seule une poignée d'essais biologiques a été démontré que pour obtenir une bonne précision de mesure (dans les laboratoires) tout en démontrant la capacité de différencier les qualités d'eau 5,6. Pour traiter les effluents d'eaux usées , en particulier, l'apparition d'oestrogènes et de glucocorticostéroïdes a bien été pris en compte pour l' utilisation dans des tests de transactivation in vitro 11,12. bioessais Cependant, la plupart des études à ce jour ont employées dont lignées cellulaires sont propriétaires (et donc pas largement disponibles), nécessitent des soins continus et de manipulation, ou les deux. En conséquence, la capacité de normaliser les protocoles, effectuer inter-laboratoires d'étalonnage des exercices, et, finalement, de transférer cette technologie de criblage pour les ressources en eau communautaire reste entravée.

Au moins un fournisseur de tests biologiques in vitro sélectionnés à travers le programme US ToxCast est disponible dans le commerce 13 facile à utiliser "gel et de dégel4; formats. Ces divisions arrêté de cellules "kits" ont été montré pour être robuste dans la mesure de l'activité des produits chimiques extraites de l' eau représentant différents niveaux de traitement 14. Bien que les protocoles du fournisseur sont disponibles pour cribler la bioactivité des composés chimiques ou des mélanges de certains d'entre eux doivent être modifiés avant qu'ils puissent être appliqués à des échantillons d'eau. Effluent traité des eaux usées 15, les eaux de ruissellement 16, les eaux réceptrices 17,18 et plus récemment recyclé 19,20 d'eau sont d' excellents exemples de milieux aqueux qui sont d'intérêt pour la communauté de la qualité de l' eau.

Cette étude présente un seul protocole standardisé pour mesurer l'activité du système endocrinien dans des échantillons d'eau à l' aide disponible dans le commerce, division arrêté en bioessais de transactivation in vitro. Nous avons démontré la robustesse du protocole par le biais d'une évaluation complète de fond, la réceptivité de la dose et la répétabilité de réponse pour two les effets particulièrement Estrogen d'intérêt et récepteur des glucocorticoïdes transactivation (ER et GR, respectivement). Le protocole a été appliqué à des échantillons d'écran de traitement des effluents des eaux usées et des eaux de surface des systèmes d'eau douce en Californie.

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Protocole

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1. Recueillir et échantillon Processus d'eau (Modifié à partir de Escher et al. 9)

  1. Remplir une bouteille de 1 L en verre ambré propre contenant 1 g d'azoture de sodium et 50 mg d'acide ascorbique au sommet avec l'échantillon d'eau d'intérêt. conserver les échantillons à 4 ° C et le processus dans les 72 h.
    NOTE: L'azoture de sodium est très toxique et doit être manipulé avec précaution. Utiliser un équipement de protection (yeux / du visage, gants, vêtements) et peser dans un hottes fonctionnant correctement. Ne pas utiliser une spatule en métal pour le pesage.
  2. Faire passer l'échantillon à travers un filtre en fibre de verre de 1,6 pm et puis à travers une cartouche d'extraction en phase solide préconditionnés (SPE) à un débit de 5-10 ml / min. Régler la pression de la pompe à vide pour contrôler le débit.
  3. Vacuum sécher la cartouche pendant 15 min.
  4. Éluer la cartouche avec 10 ml de methanol, suivi par 10 mL d'acétone: hexane (1: 1, v / v).
  5. Concentré éluat à ~ 1 ml sous un léger courant d'azote de haute pureté. Solvantéchange par addition de 500 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO) et évaporer l'extrait jusqu'à 500 ul.
  6. Transférer l'extrait à un échantillonneur automatique flacon de verre ambré. Conserver à -20 ° C.

2. Préparer la dilution du dosage spécifique des produits chimiques de référence et de l'extrait de l'eau

  1. Préparer des dilutions 9 pour la courbe d'étalonnage.
    1. Faire une solution stock de spécifique chimique de référence d'essai dans 100% de DMSO. La concentration finale doit être de 2 uM 17β-oestradiol pour le dosage du RE, et 100 uM de dexaméthasone pour l'essai GR. Stocker les solutions mères à -20 ° C.
    2. Ajouter 15 ul du stock de produits chimiques de référence appropriée à 285 pi de milieu d'essai dans un tube stérile (tube n ° 1). Mélanger l'échantillon par pipetage de haut en bas.
    3. Ajouter 200 ul d'une solution de 5% de DMSO dans le milieu d'essai dans 8 tubes supplémentaires (tubes # 9/2).
    4. Transférer une partie aliquote de 100 pi du tube n ° 1 pour le tube n ° 2 à baine # 9 pour effectuer une série de dilutions de 3 fois. Chaque échantillon dilué doit être mélangé soigneusement avec une pipette avant la prise d'une aliquote et l'ajouter au tube suivant.
  2. Préparer un échantillon témoin de solvant en mélangeant 10 ul de DMSO dans 190 ul de milieu d'essai.
  3. Préparer quatre dilutions pour chaque extrait de l'eau.
    1. Dans le premier tube, ajouter 5 ul d'extrait de l'eau dans 95 pi de milieu d'essai et bien mélanger. Ajouter 50 ul de 5% de DMSO dans le milieu d'essai dans trois autres tubes.
    2. Effectuer une dilution d'un facteur 2 en transférant 50 ul de solution à partir d'un tube à l'autre.

3. Préparer la suspension cellulaire pour effectuer les FRET bioessai

  1. Préparer le milieu d'essai spécifique selon les instructions du fabricant. un milieu d'essai doit être conservé à 4 ° C et réchauffé à 37 ° C dans un bain d'eau avant utilisation.
  2. Prenez un flacon de cellules de division-ER arrêté ou GR de la cryogénique librezer et décongeler les cellules rapidement en plaçant le flacon dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 2 minutes sous agitation douce. Décontaminer le flacon avec 70% d'éthanol et le placer dans une enceinte de sécurité biologique de classe II.
  3. Ouvrir le flacon en utilisant des techniques aseptiques et transférer les cellules dans 10 ml de milieu de dosage.
  4. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min.
  5. Aspirer le surnageant à l'aide d'une pipette en verre stérile et remettre en suspension le culot cellulaire dans 6 ml de milieu de dosage.
  6. Mélanger 5 ul de suspension cellulaire avec 5 ul d'une solution de colorant vital, et ajouter une fraction aliquote dans une chambre de comptage.
  7. Compter le nombre de cellules vivantes à l'aide d'un microscope optique ou d'un compteur de cellules automatisé et l'estimation de la densité de cellules vivantes dans la suspension cellulaire. Diluer si nécessaire pour obtenir une densité finale de 550.000 cellules vivantes par ml de milieu de dosage.

4. Les cellules en plaques dans un 96 puits plaque noire mur Clear-fond et Ajouter l'extrait de l'eau diluée

  1. Créer une plaquemise en page qui inclut un test courbe 9 points d'étalonnage spécifique, AQ / CQ des échantillons et des dilutions multiples pour chaque extrait de l'eau. Un exemple d'agencement d' une plaque de 96 puits est représenté sur la figure 1.
  2. Ajouter 90 ul de milieu d'essai pour les réplicats des puits témoins sans cellules.
  3. Verser la suspension de cellules dans un réservoir de pipetage stérile et ajouter 90 ul de suspension cellulaire dans les autres puits en utilisant une pipette à canaux multiples.
  4. Ajouter 10 pi des échantillons dilués préparés lors de l'étape 2 dans les puits appropriés. La concentration finale de DMSO dans chaque puits doit être de 0,5% au maximum.
  5. Couvrir la plaque avec un couvercle et le placer dans un incubateur à CO 2 de 5% à 37 ° C pendant 16 heures.

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Figure 1:. Exemple de mise en page de la plaque de 96 puits La plaque multi-puits est conçu pour inclure une courbe d'étalonnage spécifique de dosage, 3 typesde QA / QC contrôles (médias seulement, les cellules dans un milieu propre et les cellules dans du DMSO dopé moyenne) et 4 dilutions par extrait de l'eau. Chaque contrôle et la dilution de l' extrait de l' eau est analysée dans des puits en triple. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

5. Préparer la solution de chargement et Ajouter à chaque puits

  1. Après incubation, laisser la plaque à équilibrer à la température ambiante. Pour cet essai biologique FRET, les étapes 5.2 à 5.6 devraient être menées en l'absence de lumière directe.
  2. Préparer une solution 6x de chargement selon les instructions du fabricant.
  3. Ajouter 20 ul de la solution de chargement 6x à chaque puits.
  4. Ajouter 10 pi de réactif de viabilité cellulaire à chaque puits afin d'évaluer la cytotoxicité de l'extrait aqueux dilué.
  5. Sceller la plaque avec un film adhésif en aluminium.
  6. Incuber la plaque dans l'obscurité à température ambiante pendant 2 h.

6. Mesurer la cytotoxicité et la réponse endocrinienne Activité

  1. Mettre en place le lecteur de microplaques avec des capacités de lecture en bas en suivant les instructions du fabricant.
  2. Pour la transactivation bioessai FRET, mesurer la fluorescence dans le bleu (409/460 nm, excitation (Ex) / émission (Em) longueur d'onde) et vert (409 Ex / 530 nm Em) canaux.
  3. Pour le test de cytotoxicité, mesurer la fluorescence à 560 Ex / 590 Em nm.

7. Évaluer vérifications AQ / CQ pour déterminer la qualité des données de

  1. Comparez la fluorescence brute moyenne de la acellulaire (médias seulement) et les cellules seulement (cellules dans un milieu d'essai propre) des contrôles. La fluorescence de fond médiatique ne devrait être au moins 25% inférieure à la réponse du contrôle des cellules seulement.
  2. Traiter les données de FRET premières. Pour les deux ensembles de données «bleu» et «verts», soustraire la fluorescence moyenne des puits témoins sans cellules de toute cellule contenant bien. Calculer lableu rapport / vert pour chaque puits expérimental.
  3. Comparer bleu rapport / vert de cellules seulement et les cellules avec des commandes de DMSO. Les valeurs de fluorescence de ces contrôles devraient être dans les 15% Déviation standard relative (RSD).
  4. Tracer la courbe d'étalonnage spécifique d'essai en bleu rapport / vert contre la concentration de l'échantillon exprimée en masse moléculaire de log (log M). Calculer la pente, R 2 et log CE 50 (50% Effect Concentration). Les paramètres d'étalonnage doivent se situer dans la fourchette prévue énumérés dans le tableau 1.
  5. Calculer le RSD pour tous les puits en triple. La variabilité des répétitions doit être inférieure à 20%.
  6. Pour les données de cytotoxicité (560 Ex / 590 Em nm), soustraire la moyenne de commande sans cellule (ie fond des médias) de tous les puits contenant des cellules.
  7. Calculer la fluorescence de fond soustrait la moyenne pour chaque échantillon. Tracer les données de fluorescence résultant en pour cent du témoin de DMSO. dilutions échantillon ne doit pasexposer la mortalité cellulaire de plus de 20% par rapport aux cellules uniquement et DMSO témoins.

8. Analyse des données

  1. Calculer la limite de dosage de détection (LOD) comme la réponse d'étalonnage minimum plus de deux écarts types de la moyenne de cette réponse.
  2. Pour les échantillons montrant une réponse à la dose, tirer la CE 50   de l'extrait de l'eau en utilisant la pente de la régression linéaire de la courbe d'étalonnage entre 10 et 50 concentrations en% d'effet du produit de référence.
  3. Calculer la concentration bioanalytiques Equivalent (BEQ) en utilisant la formule: BEQ = EC 50 de produit chimique de référence / CE 50 de l' échantillon d'eau.

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Résultats

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Dans la présente étude, 4x 24 h échantillons composites de traitement des eaux usées des effluents municipaux, 6 échantillons ponctuels d'eau de surface provenant des systèmes d'eau douce dans le sud de la Californie et un champ vide constitué d'eau ultrapure ont été sélectionnés pour illustrer ce protocole. 3 des échantillons 4 effluents provenaient de centrales classiques activées de traitement des boues des eaux usées ( «effluent secondaire»), et le quatrième à partir d'une station d'...

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Discussion

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La puissance bien documenté des oestrogènes environnementaux, tels que 17β-estradiol (E2), garantit le dépistage de ces produits chimiques à ng / L concentrations 23,24. Dans cette étude, la réponse de l' urgence pour les effluents d'eaux usées (gamme BEQ: 2,3 à 17 ng E2 / L) était légèrement supérieur à celui rapporté pour l' effluent secondaire de WWTPs australiennes 20, alors que les BEQ pour l' eau de surface (<0,5 à 4 ng E2 / L ) étaient dans la plage rapportée pour la surfa...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le financement a été fourni par le Conseil national de contrôle des ressources en eau (accords n° 10-096-250 et 14-090-270). Nous remercions S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi et J. Printen. Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts, et la référence à des noms commerciaux n’implique pas une approbation.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Le kit de dosage GeneBLAzer ER alpha DALe kit ThermoFisherK1393comprend des cellules arrêtées par la division ER (DA) et un kit de chargement LiveBLAzer FRET.
Le kit de dosage GeneBLAzer GR DALe kit ThermoFisherK1391comprend des cellules arrêtées par la division GR (DA) et un kit de chargement LiveBLAzer FRET.
Réactif de viabilité cellulaire PrestoBlue  ;ThermoFisherA-13261
Bleu trypan, 0,4 % en PBSSigma-Aldrich  ;T8154Également disponible chez ThermoFisher
Corning Paroi noire 96 puits, plaque à fond transparentCorning3603Emballé individuellement, stérile avec couvercle
Filtres en fibre de verre Whatman, GF/A, 1.6 & micro ; MSigma-Aldrich  ;
Film d’étanchéité en aluminium microplaqueE& K ScientificT592100
Oasis HLB 6 cc cartouche, 200 mg d’eau absorbanteWAT106202
17&beta ; EstradiolSigma-Aldrich  ;E2758CAS #50-28-2
Acide ascorbiqueFisher ScientificA61-100Également disponible chez Sigma-Aldrich
Dexaméthasone  ;Sigma-Aldrich  ;D4902CAS #50-02-2
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Sigma-Aldrich  ;D8418Solvants de qualité moléculaire
(acétone, hexane, méthanol)Fisher ScientificAzoture de
sodiumHPLC Sigma-Aldrich  ;S2002est très toxique et doit être manipulé avec prudence. Utilisez des vêtements de protection et pesez-le sous une hotte. Également disponible chez EMD Millipore.
Compteur de cellules automatisé ou hémocytomètreDivers*Les fournisseurs incluent Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich et ThermoFisher.
Armoire de sécurité biologique de classe IIDivers*
Incubateur CO2Divers*
Congélateur cryogéniqueDivers*Le dewar de stockage de l’azote liquide est recommandé.  ;
Lecteur de microplaques à fluorescenceDivers*  ; Le lecteur doit avoir des capacités de lecture par le bas.
* Pas de source recommandée, le choix de cet équipement dépend du budget, de la fréquence d’utilisation et de l’espace de laboratoire.
WHA1820025Le produit chimique

Références

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Mots-clés

Essai biologique de transactivation in vitroCriblage de l activit endocrineSurveillance de la qualit de l eauEssai du r cepteur aux strog nesEssai du r cepteur aux glucocortico desTransfert d nergie par r sonance de fluorescenceExtraction en phase solideCellules dont la division est arr t eConcentration quivalente au bioessaiAssurance qualit et contr le qualit

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