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A Fluorescence Assay simple pour Quantification de Canine neutrophiles extracellulaires Piège sortie

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DOI :

10.3791/54726

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21 novembre 2016

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1Department of Veterinary Microbiology and Preventative Medicine, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, 2MRC Centre for Inflammation Research, University of Edinburgh, 3Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Iowa State University

Dans cet article

Résumé

pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont des réseaux d'ADN, les histones et les protéines de neutrophiles. Bien qu'une composante de la réponse immunitaire innée, TNE sont impliqués dans l'auto-immunité et de la thrombose. Ce protocole décrit une méthode simple pour l'isolement des cellules neutrophiles canins et la quantification de TNE en utilisant un dosage de fluorescence de microplaque.

Résumé

Les pièges extracellulaires neutrophiles sont des réseaux d’ADN, d’histones et de protéines neutrophiles libérés en réponse à des stimuli infectieux et inflammatoires. Bien qu’elles fassent partie de la réponse immunitaire innée, les TNE sont impliquées dans une gamme de processus pathologiques, notamment l’auto-immunité et la thrombose. Ce protocole décrit une méthode simple d’isolement des neutrophiles canins et de quantification des TNE à l’aide d’un test de fluorescence sur microplaques. Le sang est prélevé à l’aide de techniques conventionnelles de ponction veineuse. Les neutrophiles sont isolés à l’aide d’une sédimentation dextran et d’un gradient de densité en utilisant des conditions optimisées pour le sang de chien. Après avoir laissé le temps de se fixer aux puits d’une plaque de 96 puits, les neutrophiles sont traités avec des agonistes inducteurs de TNE tels que le phorbol-12-myristate-13-acétate ou le facteur d’activation plaquettaire. La libération d’ADN est mesurée par la fluorescence d’un colorant d’acide nucléique imperméable aux cellules. Ce test est une méthode simple et peu coûteuse pour quantifier la libération de TNE, mais la formation de TNE plutôt que d’autres causes de mort cellulaire doit être confirmée par d’autres méthodes.

Introduction

Il y a plus de 70 millions de chiens de compagnie aux Etats - Unis seuls 1. En tant que membres de la famille d'une valeur, ces animaux reçoivent souvent la fine pointe des soins médicaux. De même , car ils partagent notre environnement, les chiens peuvent fournir des indications sur la pathogenèse et le traitement des maladies humaines 1. Cependant, si la traduction des découvertes pour la médecine humaine dans les traitements vétérinaires ou vice-versa, il est important de caractériser complètement les espèces des variations, même dans des systèmes hautement conservés, tels que la réponse immunitaire innée. Des exemples de différences entre la canine et le système immunitaire inné humain comprennent une forte expression de CD4 sur les neutrophiles de chien 2; l'absence d'un homologue fonctionnel du capteur de flagelline cytoplasmique chez les chiens IPAF 3 et l'expression d'un hybride caspase 4/1 chez les carnivores 4.

Pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont une composante relativement récemment découvert de l' immunité innée 5. TNE sont réseaus de l' ADN, des protéines nucléaires et granulaires libérés en réponse à un large éventail de stimuli inflammatoires ou infectieuses 6. Structures NET comme il a été démontré dans de nombreuses espèces , y compris les poulets, les poissons 7 8, 9 et mollusques acoelomates 10, mais il y a des variations d'espèces. Par exemple, les neutrophiles murins réagissent plus lentement aux stimuli NETosis que les neutrophiles humains, et forment les TNE moins diffuses 11. Il y a un grand nombre de preuves à partir de plusieurs espèces TNE piègent microbes, et plus controversée peut être directement impliqué dans tuer les agents pathogènes 12,13. Cependant, les composants NET augmentent également des dommages aux tissus, favorisent la thrombose et d' agir comme autoantigènes 14,15. L'équilibre entre les effets bénéfiques et néfastes de TNE peuvent varier entre les différentes maladies et d'espèces différentes, ce qui suggère qu'il est important d'étudier les TNE tant dans les espèces et l'état de l'intérêt.

ici, nousdécrire un protocole simple pour induire et mesurer la libération de TNE par les neutrophiles canins. Cette méthode est similaire à celles utilisées pour isoler les 16 neutrophiles et d' induire NETosis chez d' autres espèces, mais les conditions telles que la concentration de l' agoniste et le temps d'incubation ont été optimisés pour les neutrophiles canins. Un essai de libération similaire d'ADN de quantification NET a également été décrit dans d' autres espèces , mais la méthode présentée ici est également optimisé pour les chiens 8,17,18.

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Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées avec la permission éthique du Comité de l'Université institutionnelle soin et l'utilisation des animaux Iowa State.

1. Collecte de sang

  1. Dessiner 9 ml de sang provenant d' un saphène, la veine céphalique ou jugulaires directement dans l' anticoagulant (par exemple, l' acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 1,8 mg de K 2 EDTA / ml de sang) vacutainers, ou dans une seringue avec un transfert immédiat des tubes de sang contenant de l' EDTA. rouler ou inverser les tubes de sang afin d'assurer un mélange adéquat du sang et l'anti-coagulant avec douceur.

2. neutrophiles Isolation

  1. Dans un tube conique de 50 ml, mélanger le sang avec un volume égal de la température ambiante, stérile, 3% de dextran-500 (composé dans une solution saline stérile à 0,9%) par inversion douce. Laisser reposer en position verticale pendant 18-20 min à température ambiante. Transférer la couleur paille couche supérieure dans un nouveau tube jusqu'à ce qu'il ne peut plus être collectées sans contamination par la couche inférieure rouge. Les érythrocytes ee tube d'origine peut être jeté.
  2. Centrifuger le surnageant à 500 xg pendant 10 min à 4 ° C. Aspirer et jeter le surnageant. Manuellement remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml température ambiante phosphate stérile saline tamponnée (PBS). Notez que tourbillonnement ne doit pas être utilisée pour remettre en suspension les neutrophiles à tout stade de ce protocole. dessin manuellement, plutôt que de verser de surnageants est également recommandé tout au long du protocole pour maximiser le rendement des cellules.
  3. Ajouter 10 ml d'une solution de séparation de cellule de polysaccharose température ambiante et du diatrizoate de sodium (par exemple Histopaque 1077) dans un tube conique de 50 ml. couche soigneusement la solution contenant des cellules au cours de la solution de séparation de cellules. On notera que en utilisant une solution de séparation de cellules qui n'a pas équilibrée à la température ambiante peut réduire le rendement des cellules.
  4. Centrifuger à 300 xg pendant 30 min à température ambiante avec le frein off.
  5. Comme les neutrophiles sont dans la couche la plus basse de la pente, aspirer et éliminer l'upper 3 couches, composé d'une couche supérieure de plasma et de plaquettes, une étroite bande blanche de cellules mononucléaires et une couche claire du milieu de gradient de densité.
  6. Lyser tous les érythrocytes restants, remettre en suspension le culot de cellules neutrophiles dans 10 ml d'eau à température ambiante.
  7. Après 30 secondes, rétablir la tonicité en ajoutant 10 ml de la température ambiante de 1,8% de chlorure de sodium stérile et mélanger par inversion douce.
  8. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant et le jeter.
  9. Si la pastille est toujours rouge, répéter l'étape de lyse. Si la pastille est blanche (ou si la lyse a déjà été effectuée deux fois), doucement remettre en suspension les cellules dans 10 ml de PBS stérile.
  10. Compter les cellules en utilisant un compteur automatisé ou un hémocytomètre. Les rendements typiques sont d' au moins 10 6 cellules par ml de sang.
  11. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant et le jeter.
  12. Remettre en suspension les cellules à la concentration désirée dans la température ambiante de PBS stérile. for le test ADN de libération décrit dans la section 2, resuspendre à 5 x 10 6 cellules par ml.
  13. Si on le désire, transférer un faible volume de cellules directement ou à l'aide d'une cytocentrifugeuse sur une lame de verre. Laisser les cellules à sécher et les taches en utilisant un kit de fixation et une coloration rapide en fonction de la fabrique 'instructions. Si l'isolement des cellules neutrophiles a été couronnée de succès, lorsqu'il est examiné au microscope au moins 95% des cellules nucléées doit être granulocytes (neutrophiles, éosinophiles, basophiles) avec une contamination minimale érythrocytaire.

3. Essai de libération d'ADN

  1. Mettre en place le test ADN de libération immédiatement après l'isolement des neutrophiles.
  2. Si l'agglutination cellulaire est présent sur l'examen de la solution mère par microscopie optique, passer la suspension de cellules à travers un filtre stérile de 70 um stérile immédiatement avant la mise en place du test.
  3. Pour chaque puits d'essai d'une plaque à 96 puits stérile, ajouter 5 x 10 4 cellules / puits; agoniste et Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI) un milieu sans rouge de phénol et supplémenté avec 0,5% de sérum foetal de veau inactivé par la chaleur à un volume final de 100-200 ul. Inclure au moins deux puits blancs par agoniste dans lequel la solution de neutrophiles de stock est remplacé par un volume égal de PBS. A noter que la mise en place des puits vides pour chaque agoniste est important pour exclure une contamination par l'ADN de l'agoniste ou de l'interférence par l'agoniste avec le dosage par fluorescence.
  4. Incuber à 39 ° C pendant 30 min dans un dioxyde de carbone (4%) incubateur.
  5. Ajouter des agonistes à des concentrations désirées et d'un colorant d'acide nucléique cellulaire imperméable. Noter que la concentration optimale de colorant imperméable aux cellules peut varier entre les différents colorants acides nucléiques. témoins non stimulés dans lesquels les agonistes sont remplacés par un volume égal de milieu devraient être inclus dans chaque expérience.
    NOTE: Il est souhaitable de diluer les agonistes des volumes similaires de milieu de culture pour maintenir des conditions cohérentes entre les puits. volumes de puits final de 200 &# 181; l ont été utilisés avec succès et si cela est altéré, bien des volumes devrait rester identique pour toutes les conditions. Phorbol-12-myristate-13-acétate (PMA) (concentration finale ≥0.1 uM) ou facteur d'activation plaquettaire (PAF) (concentration finale ≥31 uM) peut être utilisée en tant que témoins positifs. Les agonistes devraient être mesurés au moins en double.
  6. Incuber à 39 ° C. Mesurer la fluorescence en utilisant un lecteur de microplaques après 2 heures ou à des intervalles souhaités. A noter que les intervalles de temps optimaux varieront en fonction des agonistes utilisés.
    NOTE: Wavelength dépendra de colorant utilisé.
  7. Soustraire fluorescence vierge avant de calculer la fluorescence moyenne.
  8. Pour permettre une comparaison entre les individus et entre les plaques, calculer un facteur de variation de la fluorescence en divisant la moyenne de fluorescence des puits stimulés par la fluorescence moyenne des puits non stimulés.

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Résultats

En utilisant ce protocole, il devrait y avoir un changement de pli fort en fluorescence après stimulation neutrophiles avec les contrôles positifs, PMA et PAF. Comme le montre la figure 1B, la stimulation des neutrophiles canins avec 31 uM PAF pour 1 résultats hr dans une augmentation de 4,0 fois de la fluorescence moyenne par rapport aux cellules non stimulées (plage de 2,0 à 5,8, n = 5 chiens) 18. PMA à 0,1 uM (figure 1A) est un agoniste plu...

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Discussion

Le test ADN de libération présentée est un test facilement quantifiables pour l'ADN extracellulaire. La méthode a été adaptée à partir des techniques similaires utilisées pour évaluer la formation NET dans d' autres espèces, mais des vitesses de centrifugation, des concentrations agonistes et des temps d'incubation ont été modifiés afin d' optimiser le procédé pour une utilisation avec des neutrophiles canins 8,17,18. Des ajustements similaires pourraient être faits pour adapter la méthode pou...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Les auteurs remercient vivement les Drs James Roth, William Nauseef et Kayoko Kimura ainsi que M. Tom Skadow pour leur aide dans l’élaboration des protocoles pour les neutrophiles canins. RDG est soutenu par une bourse Wellcome Trust réf : WT093767MA.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube de sang total en plastique avec revêtement pulvérisé K2EDTABD 367835
Histopaque-1077Sigma-Aldrich10771
Dextran-500Précision chimique et scientifique corp.
Solution saline tamponnée au phosphateThermoFisher scientific20012043
Sérum de veau bovin fœtal, inactivé par la chaleurThermoFisher scientific10100139
RPMI Media 1640, sans rouge de phénol ni L-glutamineThermoFisher scientific32404-014Doit être exempt de rouge de phénol
96 plaque de polystyrène stérile à fond platFalcon
Phorbol 12-myristate 13-acétateSigma-AldrichP1585
Facteur d’activation plaquettaireSigma-AldrichP4904
SYTOX Teinture d’acide nucléique vertThermoFisher scientificS7020
Synergy 2 Lecteur multimodeBioTekNA
AN228410 bien en place 353072

Références

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Mots-clés

Isolement des neutrophiles caninspi ges extracellulaires des neutrophiless dimentation au dextrancentrifugation sur gradient de densitlecteur de microplaquescolorant imperm able aux cellulesagonistes de la NEToseac tate de myristate de phorbolfacteur d activation plaquettaire

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