Détermination de la surface de la cellule relative et d'expression totale de Recombinant Canaux ioniques par cytométrie en flux

Résumé

les arythmies cardiaques héréditaires sont souvent provoquées par des mutations qui modifient la distribution de surface d'un ou plusieurs canaux ioniques. Ici, on adapte les essais de cytométrie en flux pour fournir une quantification de l'expression de la protéine totale et de la surface cellulaire relative des canaux ioniques recombinants exprimés dans des cellules 201 TSA.

Résumé

Des mutations héréditaires ou de novo dans les canaux sélectifs cationiques peuvent conduire à une mort cardiaque subite. On postule souvent que l’altération du trafic de la membrane plasmique de ces protéines transmembranaires multi-étendues, avec ou sans changement de la porte des canaux, contribue de manière significative à ce processus. Il est donc devenu essentiel de développer une méthode permettant de quantifier le changement de l’expression relative de la surface cellulaire des canaux ioniques cardiaques à grande échelle. Dans le présent document, un protocole détaillé est fourni pour déterminer l’expression totale relative et l’expression de surface cellulaire des canaux calciques cardiaques de type L Ca_V1.2 et des sous-unités associées à la membrane dans les cellules tsA-201 à l’aide de tests de cytométrie fluorescente bicolore. Par rapport à d’autres méthodes qualitatives basées sur la microscopie ou l’immunoblottage, les expériences de cytométrie en flux sont des tests rapides, reproductibles et de grand volume qui fournissent des points finaux quantifiables sur de grands échantillons de cellules vivantes (allant de 10⁴ à 10⁶ cellules) avec des caractéristiques cellulaires similaires en un seul flux. Les constructions ont été conçues pour exprimer constitutivement mCherry à l’extrémité C-terminale intracellulaire (permettant ainsi une évaluation rapide de l’expression totale de la protéine) et exprimer un épitope d’hémagglutinine (HA) face extracellulaire pour estimer l’expression à la surface cellulaire des protéines membranaires à l’aide d’un anticorps conjugué à fluorescence anti-HA. Pour éviter les faux négatifs, des expériences ont également été menées dans des cellules perméabilisées pour confirmer l’accessibilité et l’expression correcte de l’épitope HA. La procédure détaillée fournit : (1) la conception de constructions d’ADN marquées (acide désoxyribonucléique), (2) la transfection médiée par les lipides de constructions dans les cellules tsA-201, (3) la culture, la récolte et la coloration de cellules non perméabilisées et perméabilisées, et (4) l’acquisition et l’analyse de signaux fluorescents. De plus, les principes de base de la cytométrie en flux sont expliqués et la conception expérimentale, y compris le choix des fluorophores, le titrage de l’anticorps HA et les expériences de contrôle, est discutée en profondeur. Cette approche spécifique offre une quantification comparative objective de l’expression totale et de la surface cellulaire des canaux ioniques qui peut être étendue à l’étude des pompes ioniques et des transporteurs de membranes plasmiques.

Introduction

Ce document fournit un test fiable pour signaler l'expression relative de la surface cellulaire des protéines membranaires telles que des canaux ioniques exprimés dans les cellules recombinantes en utilisant la technologie de cytométrie de flux existant. Les canaux ioniques sont des protéines membranaires porogènes qui sont responsables de la commande des signaux électriques par gating le flux d'ions à travers la membrane cellulaire. Ils sont classés par le mécanisme d'activation, la nature et la sélectivité des espèces d'ions qui transitent à travers le pore où ils sont localisés. Au niveau cellulaire et tissulaire, les flux ioniques macroscopiques à travers les can....

Protocole

1. constructions Doublement ADN Tagged

1. Insérer l'épitope HA (YPYDVPDYA) dans le segment de liaison extracellulaire du Ca _V α2δ1 entre D676 et R677 par mutagénèse dirigée (figure 3B) ^20. Utilisez gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC Amorce et Reverse acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC primer.
2. Sous - cloner la séquence d'ADNc de HA _V Ca α2δ1 étiqueté dans le vecteur d'expression de mammifère pmCherry-N1 conçu pour exprimer la protéine fusionnée à l' extrémité N-terminale de mCherry entre les sites Sacl et Sali (figure 3B) ^20.
   REMARQUE: La fonction de canal app....

Résultats

Cet article décrit un protocole fiable pour quantifier la surface totale et cellulaire des canaux ioniques recombinantes exprimées dans Tsa-201cells par un flux à deux couleurs cytométrie dosage. A titre d'exemple, la surface de la cellule par rapport et une expression de protéine totale a été quantifiée pour le _V Ca α2δ1subunit. Afin d'effectuer le flux en deux couleurs cytométrie test, Ca _V α2δ1 a été doublement marqué à exprimer une HA épitope non fluorescent ext.......

Discussion

Cet essai à base de cytométrie de flux a été appliqué avec succès à la mesure des niveaux relatifs totale et la surface des cellules des sous - unités marquées par fluorescence porogène et associé à des canaux calciques voltage-dépendants ^14,22,26. Il est préférable d'utiliser lors d'enquêtes sur l'impact des mutations génétiques et exige donc que l'intensité de fluorescence intrinsèque du type sauvage construction marqué par fluorescence marqué soit au moins 10 à 100 fois plus grande que pour.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Q5 Kit de mutagénèse dirigée	England Biolabs	E0554S	Peut être remplacé par le kit de mutagénèse dirigée QuickChange (Agilent, #200523).
Tubes 1,5 ml	Sarstedt	72-690-001
Tubes 15 ml  ;	Sarstedt	; 62-554-002
Pipettes de transfert graduées jetables  ;	VWR	160001-192  ;
Boîte de culture de 100 mm	Corning	430167	Pour la culture standard de cellules HEKT.
Boîte de culture de 35 mm	Falcon	353001	Pour la culture standard de cellules HEKT.
Pipette sérologique 1 ml	Sarstedt	86.1251.001
Pipette sérologique 5 ml	Sarstedt	86.1253.001
Pipette sérologique 10 ml	Sarstedt	86.1254.001
Pipette sérologique 25 ml	Sarstedt	86.1285.001
Milieu à haute teneur en glucose de Dulbecco	Life Technologies	12100-046	Warm in 37 & Deg; C bain-marie avant utilisation.
Sérum fœtal de bovin, qualifié, inactivé par la chaleur, origine américaine	Life Technologies	16140-071
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)	Life Technologies	15140-122
Lipofectamine 2000  ;	Life Technologies	11668-019	Pour la transfection liposomale. Peut être remplacé par la transfection de phosphate de calcium.
Opti-MEM I Sérum Réduit Medium	Life Technologies	31985-070	Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation.
Trypsine-EDTA (1x) 0,05 %, rouge de phénol	Life Technologies	25300-062
1,5 ml microtubes	Sarstedt	72.690.001
; Saline tamponnée au phosphate 1x	Fisher	BP661-10	Peut être « fait maison ».
Anticorps conjugué anti-HA FITC	Sigma	H7411
IgG1&minus ; FITC Isotype Control anticorps	Sigma	F6397
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Perméabilisation Kit de solution	BD Biosciences	554714	Fixation/Perméabilisation. Solution de perméabilisation/lavage, conserver à 4 °C.
Hémacytomètre	Fisher	49105161
Trypan Blue	Fisher	15250061	Pour accéder à la viabilité cellulaire.
Microcentrifugeuse réfrigérée, 5430R	Eppendorf  ;
Forma Steri-Cycle CO2 Incubateur	Fisher	370
Plate-forme de laboratoire à bascule	Fisher	545034
Bain-marie	VWR	89032-216
BD FACSARIA III  ;	BD Biosciences	648282	Cytomètre en flux.
FlowJo Software v10	FlowJo	FlowJo v10 Dongle	Pour l’analyse des données.