Article de méthode

Utilisation d'une cartouche filtrante pour la filtration de l'eau et des échantillons d'extraction de l'ADN de l'environnement

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DOI :

10.3791/54741

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25 novembre 2016

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1Department of Ecology and Environmental Sciences, Natural History Museum and Institute, Chiba, 2Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 3Faculty of Science and Technology, Ryukoku University, 4Okinawa Churashima Research Center, 5Graduate School of Simulation Studies, University of Hyogo

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un protocole pour la filtration d’échantillons d’eau avec une cartouche filtrante et l’extraction de l’ADN environnemental (ADNe) sans avoir à ouvrir le boîtier pour retirer le filtre. Ce protocole est développé pour le métacodage à barres de l’ADNe des poissons, mais s’applique également à l’ADNe d’autres organismes.

Résumé

Des études récentes ont démontré que l’utilisation de l’ADN environnemental (ADNe) des poissons était appropriée comme outil de surveillance non invasif. La plupart de ces études ont utilisé des filtres à fibres à disque pour collecter de l’ADNe à partir d’échantillons d’eau, bien qu’un certain nombre d’études microbiennes en milieu aquatique aient utilisé des cartouches filtrantes, car la cartouche a l’avantage de contenir de grands volumes d’eau et d’être généralement facile à utiliser. Nous fournissons ici un protocole pour la filtration des échantillons d’eau à l’aide de la cartouche filtrante et l’extraction de l’ADNe du filtre sans avoir à ouvrir le boîtier. Les principales parties de ce protocole consistent en 1) la filtration des échantillons d’eau (volumes d’eau ≤4 L ou >4 L) ; (2) l’extraction de l’ADN sur le filtre à l’aide d’un agitateur à rouleaux placé dans un incubateur préchauffé ; et (3) la purification de l’ADN à l’aide d’un kit commercial. Grâce à l’utilisation de ce protocole et des protocoles précédemment utilisés, nous effectuons une analyse de métabarcoding d’ADNe prélevé dans un immense bassin d’aquarium (7 500 m3) avec une composition d’espèces connue, et montrons le nombre d’espèces détectées par bibliothèque à partir des deux protocoles comme résultats représentatifs. Ce protocole a été développé pour le métacodage à barres de l’ADNe des poissons, mais il est également applicable à l’ADNe d’autres organismes.

Introduction

ADN de l'environnement (EDNA) dans les milieux aquatiques se réfère au matériel génétique trouvé dans la colonne d'eau. Des études récentes ont démontré l'utilité de EDNA pour détecter les poissons de divers milieux aquatiques, y compris les étangs, les rivières 1-3 4-8, cours d' eau 9, et l' eau de mer 10-14. La plupart de ces études se sont concentrées sur la détection d'un seul ou de quelques invasive 1,4-6,8,14 et rares ou menacées espèces 3,9, alors que certaines études récentes ont tenté la détection simultanée de plusieurs espèces dans les communautés de poissons locales 7,9, 12,13,15 et mésocosmes 11,12.

Cette dernière approche est appelée «metabarcoding» et EdNA metabarcoding utilise un ou plusieurs ensembles d'amorces de PCR pour coamplify une région de gène à travers taxonomiquement divers échantillons. Elle est suivie par la préparation bibliothèque d'indexation et l'addition de l'adaptateur et les bibliothèques indexées sont analysées par un séquençage parallèle à haut débitPlate-forme. Récemment Miya et al. 12 ont développé des amorces de PCR universelles pour metabarcoding EDNA de poissons (appelés "MiFish"). Les amorces MiFish ciblent une région hypervariable du gène 12S ARNr mitochondrial (163-185 pb), qui contient des informations suffisantes pour identifier les poissons à la famille taxonomique, genre et espèce, sauf pour certains congénères étroitement liés. Avec l'utilisation de ces amorces dans EDNA metabarcoding, Miya et al. 12 détecté plus de 230 espèces marines subtropicales de réservoirs d'aquarium avec la composition des espèces et des récifs coralliens connus près de l'aquarium.

Tout en optimisant le protocole metabarcoding pour accueillir l'eau de mer naturelle avec des niveaux de concentration de poissons EDNA différents, nous avons remarqué que les amorces MiFish parfois échoué à amplifier la région cible pour la préparation de la bibliothèque ultérieure. Une des raisons les plus probables pour cette amplification PCR échec est le manque de quantités suffisantes de la template ADN contenu dans de petits volumes d'eau filtrée (ie 1-2 L). Bien que la concentration EDNA d'un groupe taxonomique spécifique est inconnaissable avant l'amplification, la filtration de grands volumes d'eau (> 1-2 L) serait un moyen simple et efficace pour recueillir plus EDNA des milieux aquatiques avec l'abondance des poissons rares et la biomasse, tels que ouvert sur la mer et en eaux profondes des écosystèmes.

Par rapport aux filtres en fibre de disques utilisés classiquement dans un certain nombre de recherches poissons EDNA 16, les cartouches filtrantes ont l'avantage d'accueillir de plus grands volumes d'eau avant le colmatage 17. En fait, une étude récente a montré un grand volume (> 20 L) filtration des échantillons d'eau de mer côtières en utilisant des cartouches filtrantes 18. En outre, ils sont emballés individuellement et stérile, ainsi que plusieurs étapes du flux de travaux expérimentaux peuvent être réalisés dans le boîtier de filtre, ce qui réduit la probabilité de contamination du laboratoire 19. Le dernierfonctionnalité est essentielle pour EDNA metabarcoding, où le risque de contamination reste parmi les plus grands défis expérimentaux 20,21. En dépit de ces avantages techniques des cartouches filtrantes, il n'a pas été utilisé dans les études EDNA de poissons à deux exceptions près 8,15.

Ici, nous fournissons un protocole pour la filtration des échantillons d'eau avec la cartouche filtrante et l'extraction de EDNA de son filtre sans avoir à couper ouvrir le boîtier. Nous fournissons également deux systèmes de filtration d'eau de remplacement en fonction des volumes d'eau (≤4 L ou> 4 L). Pour comparer les performances du protocole nouvellement développé et un protocole précédemment utilisé à l' aide d' un filtre en fibre de verre dans notre groupe de recherche 12,14,22,23, nous effectuons EDNA metabarcoding analyse de l' eau de mer à partir d' un énorme réservoir d'aquarium (7.500 m 3 ) avec la composition des espèces connues, et indiquer le nombre d'espèces détectées provenant des deux protocoles que des résultats représentatifs. Ce protocole hcomme été développé pour metabarcoding EDNA de poissons, mais est également applicable à EDNA d'autres organismes.

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Protocole

NOTE: Ce protocole ne traite pas des méthodes d'échantillonnage de l'eau et metabarcoding. L' eau peut être échantillonné de différentes manières en fonction des fins d'étude 16 et voir Miya et al. 12 pour plus de détails sur les méthodes de metabarcoding en utilisant des amorces de MiFish. A noter que l'eau prélevée doit rester très froid et on le filtre en quelques heures pour éviter une dégradation de EdNA. A noter également que ce protocole implique l'utilisation d'un agitateur rotatif et un incubateur, et celui-ci doit être suffisamment grand pour accueillir l'ancien. En outre, une centrifugeuse qui peut accueillir les 15 ml et 50 ml tubes coniques est indispensable pour éliminer le liquide restant dans le filtre de post-filtration et de recueillir l'ADN extrait à l'intérieur de la cartouche, respectivement.

1. Traitement d'un bouchon à vis et 1 L Sac en plastique

REMARQUE: Passer cette étape si le volume de filtration est> 4 L.

  1. Percez un trou dans le centre d'une vis cap (fixé à un sac jetable en matière plastique de 1 litre) ayant le même diamètre (4,8 mm) lorsque le tube faisant saillie à partir d'un connecteur Luer mâle. En utilisant des pinces diagonales, raccourcir le tube du connecteur luer-lock mâle à une longueur appropriée (env. 3 mm) pour éviter le colmatage d'une petite quantité d'eau à l' intérieur du bouchon après filtration.
  2. Appliquer une colle adhésive spécialisée pour le polyéthylène (PE) et polypropylène (PP) à la fois le fond et la surface du connecteur Luer mâle et bouchon à vis, respectivement. Attendez quelques minutes pour une bonne collage (reportez-vous aux instructions du fabricant).
  3. Insérer le connecteur Luer mâle dans le trou du bouchon à vis. Attendre jusqu'à ce que le collage complet des deux pièces (en général> 24 h). Stériliser le bouchon fileté avec le raccord Luer mâle avec 10% d' eau de javel du commerce (env. D'hypochlorite de sodium à 0,6%) avant utilisation.
  4. Poinçonner deux trous au niveau des deux coins inférieurs du sac en plastique de 1 litre, afin de l'accrocher à mesh panneau (étape 3). Assurez-vous que le diamètre des trous est plus grande que celle des dents du panneau de grillage.

2. Assemblée du système de filtration

  1. Fixer le tube à vide poussé au raccord d'une pompe d'aspiration d'entrée et fixer l'autre extrémité du tube à un collecteur. Assurez - vous que les trois rouges t-vannes du collecteur sont en position "off" (c. -à- horizontal).
  2. Le port d'un ensemble propre de gants, insérer un raccord luer femelle et un connecteur à vide au niveau des extrémités supérieure et inférieure du tube en caoutchouc sous vide pour la filtration, respectivement.
  3. attacher soigneusement le raccord Luer femelle à un orifice de sortie de la cartouche filtrante et fixer le raccord à vide un bouchon en silicone.

3. Filtration des échantillons d'eau (≤4 L) à l'aide de la cartouche filtrante

REMARQUE: Passer cette étape si le volume de filtration est> 4 L. Ce système de filtration nécessite un panneau f autonomeou accrocher le sac en plastique rempli de 1 L d'eau. Un panneau en treillis, plusieurs dents, et un support pour le panneau, tous disponibles dans les magasins en ligne, seraient utiles pour assembler cet appareil. Autoclaver l'entrée et la sortie bouchons Luer pour la cartouche filtrante avant utilisation.

  1. Versez l'eau échantillonnée 1 L dans le sac en plastique et fermer le bouchon à vis avec le connecteur luer-lock mâle.
  2. connecter avec soin un orifice d'entrée de la cartouche de filtre assemblé avec le connecteur luer-lock mâle du sac en plastique. Ne pas trop serrer le connecteur luer-lock; sinon l'appareil risque de fuir une fois que le pompage commence. Assurez-vous que toutes les connexions sont sécurisées avant d'accrocher le sac en plastique à partir d'un panneau de mailles.
  3. accrocher soigneusement le sac en plastique avec la cartouche de filtre à partir de deux branches sur le panneau de treillis et insérer un bouchon en silicone dans un orifice d'entrée du collecteur.
  4. Allumez l'aspirateur. Ouvrez les t-vannes rouges pour la filtration. Exécutez le collecteur jusqu'à ce que la cartouche filtrante est sèche, tpoule tourner le t-valve rouge à la position d'arrêt.
  5. Répétez 3.1-3.4 étapes jusqu'à ce que la quantité désirée d'eau est filtrée.
    NOTE: Pour 1 litre d'eau prélevée dans les récifs coralliens subtropicales, il faut environ trois minutes pour la filtration.
  6. Retirez délicatement la cartouche filtrante du sac en plastique et le connecteur à vide.
  7. Coiffer les deux extrémités de la cartouche à l'entrée et à la sortie bouchons Luer.
  8. Étiquette de la cartouche et entrée luer bouchon en utilisant de manière appropriée un stylo résistant aux solvants pour séchage rapide et l'étiquetage non-maculage.
  9. Conservez la cartouche filtrante à -20 ° C avant l'extraction de l'ADN.

4. La filtration de l'eau (> 4 L) Les échantillons à l'aide de la cartouche filtrante

Remarque: Ignorez cette étape si le volume de filtration de l'eau est ≤4 L. Ce système de filtration nécessite une bouteille de livre de 10 L équipé d'une valve et une pointe de pipette 10 ml jetable. Un diamètre intérieur de 10 ml pointe de pipette (15,0 mm) et un cône de la pointefin doit correspondre à un diamètre extérieur de la soupape (15,0 mm) et l'orifice d'entrée de la cartouche filtrante, respectivement. Les deux connexions sont conservées en toute sécurité pendant la filtration dans un ajustement à friction. Stériliser la pointe de la pipette avec 10% de l' eau de Javel commerciale (environ 0,6% d'hypochlorite de sodium) avant utilisation.

  1. Préparer une quantité appropriée d'eau prélevée dans la bouteille de livre. insérer Étroitement la pointe de la pipette de 10 ml dans la valve de 10 L livre bouteille.
  2. insérer de façon étanche l'orifice de sortie de la cartouche filtrante dans l'extrémité de pointe de pipette et insérer le bouchon de silicone dans l'orifice d'entrée du collecteur. Allumez l'aspirateur. Ouvrez les t-vannes rouges pour la filtration. Exécutez le collecteur jusqu'à ce que la cartouche de filtre est sec, puis tournez le t-valve rouge à la position d'arrêt.
    NOTE: Pour 10 L d'eau de mer provenant des récifs coralliens extérieurs subtropicales, il faut environ 30-40 min pour la filtration.
  3. Retirez délicatement la cartouche filtrante du sac en plastique et le connecteur à vide. Cap à la foisles extrémités de la cartouche avec l'orifice d'entrée et de sortie bouchons Luer. Étiquette de la cartouche et entrée luer bouchon en utilisant de manière appropriée un stylo résistant aux solvants pour séchage rapide et l'étiquetage non-maculage. Conservez la cartouche filtrante à -20 ° C avant l'extraction de l'ADN.

5. Extraction de EDNA du filtre

NOTE: Dans les étapes 4 et 5, nous utilisons un kit commercial, en grande partie en suivant un protocole de "sang nucléé" fourni par le kit. Pour plus de simplicité, nous décrivons la procédure de traitement d'une cartouche individuelle. Dans la pratique, nous recommandons le traitement 8 (ou le nombre maximal de la centrifugeuse) ou moins de filtres à la fois.

  1. Préchauffer un incubateur à 56 ° C.
  2. Préparer un tube de 2,0 ml, en coupant le couvercle à charnière du tube. Jeter le bouchon.
    NOTE: Le tube est utilisé comme tube de collecte pour le liquide restant dans le filtre.
  3. Retirer l'entrée (PAS sortie) capuchon Luer de la cartouche du filtre et insérez l'orifice d'entrée into le tube de collecte. sceller hermétiquement une connexion entre le tube de la cartouche et de la collecte en utilisant un film auto-obturant.
  4. Insérer l'unité combinée dans un adaptateur de centrifugeuse pour un tube conique de 15 ml. Centrifuger la cartouche à 5000 g pendant 1 min pour éliminer le liquide restant dans le filtre.
  5. Retirez le tube collecteur de la cartouche du filtre et jeter le tube. Reboucher le port d'entrée de la cartouche.
  6. Préparer un mélange de solution protéinase-K 20 pi, 220 pi de PBS (tampon phosphate salin, non fournie par le kit) et 200 pi de tampon AL.
    REMARQUE: La cartouche filtrante peut accueillir jusqu'à quatre fois les volumes du mélange (. Ca 1,8 ml).
  7. Retirez le bouchon d'entrée et ajouter le mélange (440 pi) dans la cartouche de filtre à l'aide d'une pointe de pipette. Insérer la pipette complètement dans l'orifice d'entrée de sorte que la pointe de la pipette est visible à l'intérieur de la cartouche juste au-dessus de la membrane.
  8. Reboucher l'orifice d'entrée et placer la voiture de filtreTridge sur un agitateur rotatif.
  9. Placez l'agitateur rotatif dans l'incubateur préchauffé à 56 ° C et tourner sur l'agitateur à une vitesse de 20 tours par minute pendant 20 min.
  10. Pendant l'incubation, préparer un nouveau tube de 2,0 ml, étiqueter le tube en utilisant de manière appropriée un stylo résistant aux solvants et le placer dans un tube conique de 50 ml.
    Remarque: les premiers (2,0 ml), et ces derniers tubes (50 ml) sont utilisés pour la collecte de l'ADN extrait et pour maintenir le tube de 2,0 ml.
  11. Après l'incubation, enlever le bouchon d'entrée et insérez l'entrée (PAS la sortie) port de la cartouche dans le tube de 2,0 ml dans le 50 ml tube conique. Fermer le tube conique de 50 ml avec un bouchon à vis.
  12. Centrifuger le tube conique de 50 ml à 5000 g pendant 1 min pour recueillir l'ADN extrait de la cartouche. Retirez la cartouche de filtre et le tube de 2,0 ml en utilisant des pinces stérilisées et boucher le tube. Jeter la cartouche filtrante.

6. La purification de l'ADN Extrait

NOTE: Nous éluer EDNA avec 100 ul de tampon AE au lieu de 200 ul spécifiées dans le manuel du kit commercial.

  1. Ajouter 200 ul d' éthanol (96-100%) pour l'ADN extrait dans le tube de 2,0 ml de l'étape ci - dessus (environ 440 pi), et bien mélanger par tourbillonnement.
  2. Pipeter le mélange dans une colonne de centrifugation dans un tube collecteur de 2 ml. Centrifuger à 5000 xg pendant 1 min. Jeter l'écoulement et le tube de collecte.
  3. Placez la colonne de spin dans un nouveau tube collecteur de 2 ml, ajouter 500 pi de tampon AW1, et centrifuger pendant 1 min à 5000 x g. Jeter l'écoulement et le tube de collecte.
  4. Placez la colonne de spin dans un nouveau tube collecteur de 2 ml, ajouter AW2 tampon de 500 pi, et centrifuger pendant 3 min à 20 000 x g. Jeter l'écoulement et le tube de collecte.
  5. Préparer un nouveau tube de 1,5 ml (non fourni par le kit) et étiqueter le tube en utilisant de manière appropriée un stylo étanche pour séchage rapide et l'étiquetage non-maculage. Transférer la colonne spin to le tube de 1,5 ml.
  6. Éluer l'ADN par addition de 100 ul de tampon AE au centre de la membrane de la colonne. Incuber pendant 1 min à température ambiante, puis centrifuger à 6000 g pendant 1 min.
  7. Jeter la colonne de centrifugation et boucher le tube. Stocker l'ADN purifié à -20 ° C.

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Résultats

Il est techniquement difficile d'isoler et de quantifier seulement EDNA de poissons de la EDNA en vrac extrait, parce que les amorces MiFish coamplify la région cible de certains vertébrés non-poissons, tels que les oiseaux et les mammifères, avec des produits de PCR de la même taille (env. 170 pb ) 12. Au lieu de quantifier les poissons EDNA, nous effectuons MiFish metabarcoding analyse de EDNA à partir d'un réservoir d'aquarium avec la composition des es...

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Discussion

Dans de nombreuses études de metabarcoding en utilisant des échantillons environnementaux tels que l' eau et le sol, le traitement post-filtration de la cartouche filtrante est généralement la suivante 24,25: 1) de coupe ouverte ou gerçures le boîtier avec des outils à main (coupe-tube ou une pince); 2) le retrait du filtre de la cartouche; et 3) la découpe du filtre en petits morceaux avec une lame de rasoir pour l'extraction d'ADN. Pour éviter de telles lourdes et longues procédures qui sont suj...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été financée en tant que recherche fondamentale par le CREST de l’Agence japonaise pour la science et la technologie (JST) et par des subventions de JSPS/MEXT KAKENHI (numéro 26291083) et de la Fondation Canon à M.M. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publication ou la préparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Panneau en mailleIris OhyamaMPP-3060-BE
Broche en métalIris OhyamaMR12F
Support pour le panneau en maillePas de marque4184-9507disponible sur Amazon Japon
Sac en plastique de 1 L avec bouchon à visYanagiDP16-TN1000
Connecteur luer-lock mâleISIS11620
Pointe de pipette de 10 mlEppendorf0030 000.765
Flacon livre de 10 L avec valveAs One1-2169-01
Filtre Sterivex-HVMilliporeSVHVL10RCdésigné comme « cartouche filtrante » tout au long du ms et utilisé dans le protocole
Raccord Luer mâleAs One1-7379-04
Raccord Luer femelleAs One5-1043-14  ;   ;
Capuchon Luer d’entréeISISVRMP6
Capuchon Luer de sortieISISVRFP6
Tube à vide pousséAs One6-590-01
Connecteur à videAs One6-663-02
Bouchon en siliconeAs One1-7650-07
CollecteurAs One2-258-01
Aspirateur-GAS-1As One1-7483-21
DNeasy Blood & Kit de tissus (250)Qiagen69506
PowerWater Sterivex Kit d’isolation d’ADNMO BIO14600-50-NFdésigné comme « kit optionnel » dans le ms
Centrifugeuse de tableKubotaModel 4000Vitesse maximale 6 000 tr
/min Rotor à angle fixeKubotaAT-508C
Adaptateur pour tube conique de 15 mlKubota055-1280
Solution de stabilisation de l’ARNlaterThermo Fisher ScientificAM7020
ParafilmPM992désigné comme « film auto-obturant »

Références

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Filtration de l eauExtraction d ADNAnalyse de m tabarcodingAgitateur rotatifProtocole d incubationConnecteur LuerFiltration sous videD tection d esp ces

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