Une méthode efficace pour la synthèse de Peptoïdes avec Monomères / Arginine type de type Lysine mixte et de l'évaluation de leur activité anti-leishmaniose

Résumé

Un protocole de synthèse de peptoïdes à fonctionnalité cationique mixte dans la même séquence est présenté (monomères de type lysine et arginine). Des essais ultérieurs de ces composés contre Leishmania mexicana, les parasites protozoaires qui causent la leishmaniose cutanée, sont également décrits.

Résumé

Ce protocole décrit la synthèse manuelle en phase solide de peptoïdes linéaires contenant deux monomères cationiques fonctionnalisés différemment. Dans cette procédure, les monomères peptoïdes « lysine » fonctionnalisés par amino et « arginine » fonctionnalisés par le guanido peuvent être inclus dans la même séquence peptoïde. Cette procédure utilise une protection sur résine (N-(1-(4,4-diméthyl-2,6-dioxocyclohexylidène)éthyl) ou Dde, conditions orthogonales à la protection Boc des monomères de lysine. La déprotection ultérieure permet une réaction efficace de guanidinylation sur la résine pour former les résidus d’arginine. La procédure est compatible avec la méthode de synthèse des peptoïdes par sous-monomère couramment utilisée, ce qui permet de fabriquer des peptoïdes simples à l’aide d’équipements de laboratoire courants et de réactifs disponibles dans le commerce. La synthèse, la purification et la caractérisation représentatives de deux peptoïdes mixtes sont décrites. L’évaluation de ces composés en tant qu’anti-infectieux potentiels dans les essais de dépistage contre Leishmania mexicana est également décrite. Le parasite protozoaire L. mexicana est un agent causal de la leishmaniose cutanée, une maladie tropicale négligée qui touche jusqu’à 12 millions de personnes dans le monde.

Introduction

Peptoïdes (ou poly- composé N -substitué glycines) sont une classe de peptides mimétiques qui offrent des propriétés similaires à des peptides et en tant que tels , sont de plus en plus étudiées pour des applications médicales et des matériaux. Dans les peptides dont la chaîne latérale de chaque acide aminé est connecté à l'α-carbone du squelette amide; peptoïdes dans les chaînes latérales sont décalées sur l'atome d'azote du squelette. Fondamentalement, ce qui donne une plus grande résistance peptoïdes à la protéolyse.

Les peptoïdes sont généralement synthétisés en utilisant la méthode de sous - monomère mis au point par Zuckermann et al., Où les monomères peptoïdes peuvent être construits par haloacetylation séquentielle d'une fonctionnalité amine liée à un support solide et le déplacement ultérieur de l'atome d' halogène en utilisant une amine primaire. ¹ Notre groupe a développé récemment une adaptation à cette méthode de sous-monomère pour permettre lysine et l'arginine de type résidus peptoïdes à inclure dans la même séquence peptoïde pour le first temps. ² Cette approche manuelle en phase solide à peptoïde synthèse utilise des réactifs disponibles dans le commerce et l' équipement de laboratoire commun, le rendant accessible pour la majorité des laboratoires. Peptoïdes se sont révélés avoir des activités prometteuses contre une large gamme de bactéries Gram - négatives, les espèces bactériennes et fongiques Gram positives qui sont comparables à de nombreux peptides antimicrobiens connus ^3-9.

Dans notre travail, peptoïdes ont été utilisés comme composés anti-infectieux nouveaux pour le traitement de la leishmaniose les maladies tropicales négligées. ^5,10 leishmaniose est endémique dans plus de 80 pays à travers le monde et on estime que plus de 12 millions de personnes sont infectées dans le monde. ¹¹ La la maladie est causée par des parasites protozoaires qui sont transmis par la piqûre d'un phlébotome. espèces de Leishmania peuvent causer la leishmaniose cutanée, une maladie qui conduit à des cicatrices et des lésions des muqueuses, ou leis viscérale menaçant le pronostic vitalhmaniasis, ce qui provoque des dommages aux organes mortels. Aucun vaccin est actuellement disponible pour cette maladie et les traitements existants reposent sur un petit nombre de médicaments qui ont des effets secondaires graves. En outre, la résistance aux médicaments existants est un problème grave et émergents afin que les nouveaux traitements sont absolument nécessaires pour traiter efficacement la leishmaniose dans l'avenir. ^12-16

Dans ces applications antimicrobiennes, les peptoïdes sont souvent conçus pour être amphipathiques avec un mélange de monomères cationiques et hydrophobes. Cela peut donner ^3,4 peptoïdes un degré de sélectivité vis à vis des cellules bactériennes, de réduire la toxicité pour les cellules de mammifères, et d'améliorer leur activité en tant que transporteurs moléculaires . ^17-20 la majorité des peptoïdes anti-infectieux dans la littérature contient des chaînes latérales cationiques qui sont exclusivement composés soit d' acides fonctionnalisés monomères de type lysine ou des résidus de type arginine. chimères Peptide-peptoïdes, où les chaînes cationiques sont constituées de l'unmino acides lysine ou l' arginine, ont également été synthétisés pour examiner l'effet des groupements cationiques sur l' activité et la toxicité. ^21-25

peptoïdes Poly-lysine peuvent être facilement synthétisés en utilisant des amines disponibles dans le commerce Boc-protégées. Les peptoïdes poly-arginine rapporté peut être fait en utilisant une méthode qui utilise pyrazole-1-carboxamidine comme agent de guanidinylation. ¹⁸ Toutefois, cela ne peut se faire après la peptoïde a été clivé de la résine et de la protection Boc sur les chaînes latérales enlevées, de sorte chaque résidu de type lysine dans la séquence est transformé en un résidu arginine. Dans un effort pour affiner les propriétés chimiques et biologiques des composés, nous avons développé une méthode qui permet la fonctionnalité cationique double (par exemple, N Lys et N Arg) à inclure dans toute séquence peptoïde donnée pour la première fois. ²

Ici, nous décrivons la synthèse, la purification et la caractérisation de two nouveaux peptoïdes qui contiennent des résidus de lysine et d'arginine de type dans le même ordre. Le procédé utilise une protection orthogonale N et N - Boc sur une résine -Dde avec pyrazol-1-carboxamidine comme réactif de guanidinylation. L'évaluation biologique de ces peptoïdes est également décrite dans les essais de cytotoxicité contre Leishmania mexicana, l'agent responsable de la leishmaniose cutanée. Ceci fournit une méthode pratique pour accéder à peptoïdes avec double fonctionnalité cationique et d'évaluer leur activité biologique. Il est prévu que cette méthode va faciliter la synthèse des peptoïdes amphipathiques par la communauté peptoïde à l'avenir.

Protocole

1. Synthèse en phase solide de peptoïdes

REMARQUE: Les peptoïdes sont synthétisés manuellement en utilisant la procédure de sous-monomère de la synthèse des peptoïdes en phase solide. Cette méthode permet un rendement de couplage élevé et un bon rendement du produit final. Synthèse sur phase solide permet également de réactifs en excès à être enlevé facilement à la fin de chaque étape et le procédé a été modifié ici pour permettre (résidus à savoir du type d'arginine et de type lysine) différents monomères cationiques fonctionnalisés à être inclus dans le même séquence ^1,2 .

1. Synthèse d'un peptoïde linéaire
   Attention: Effectuer des évaluations de sécurité avant de commencer la synthèse. Effectuer toutes les réactions dans une hotte et porter un équipement de protection individuelle adéquat comme (c. -à- gants en nitrile jetables, des lunettes de sécurité et une blouse de laboratoire) appropriés. Prenez un soin particulier lors de l'utilisation des réactifs et solvants suivants. Diméthylformamide (DMF) est un suspect tératogène et dichloromethane (DCM) est un cancérogène. N, N '-diisopropylcarbodiimide (DIC) et de la pipéridine sont dangereux pour les yeux, la peau, par inhalation respiratoire et peuvent provoquer une sensibilisation cutanée. L'hydrazine est un cancérogène suspecté, mortel en cas d'inhalation et provoque de graves brûlures à la peau ou les yeux. l'acide bromoacétique est également dangereux pour la peau, les yeux et les voies respiratoires et peut provoquer des brûlures au contact. l'acide trifluoroacétique (TFA) est un liquide volatil et peut causer des brûlures graves de façon manipuler avec précaution. Des gants robustes sont recommandés.
   1. Ajouter 0,12 g de résine Rink Amide protégé par Fmoc (0,1 mmol, chargement typique de 0,7 mmol / g) à 20 ml de polypropylène récipient de réaction coiffé avec deux frittes. Ajouter 5 ml de diméthylformamide (DMF) à gonfler la résine et quitter le navire au repos pendant au moins 60 minutes à la température ambiante. Égoutter le DMF en utilisant une plate-forme de vide d'extraction en phase solide.
   2. Déprotéger le groupe Fmoc sur la résine gonflée, ajouter 2 ml de solution de pipéridine (20% dans du DMF v / v). Placer le récipient surune plate-forme d'agitation à la température ambiante (450 rpm) et agiter pendant 5 min. Retirer la solution via la station de vide.
      1. Répéter Fmoc déprotection avec 2 ml de solution de pipéridine et agiter pendant 15 min à température ambiante. Égoutter la solution comme avant.
   3. Laver la résine par addition de 2 ml de DMF et le mélange de la résine pendant 30 sec. Égoutter le DMF et répéter trois fois.
   4. Pour l'acétylation, ajouter 1 ml de solution d'acide bromoacétique (0,6 M dans du DMF) et 0,2 ml de N, une solution -diisopropylcarbodiimide N '(DIC dans le DMF à 50% v / v). Laisser réacteur à agiter pendant 20 min à température ambiante. Égoutter la solution et laver la résine avec 2 ml de DMF à trois reprises.
   5. Pour le déplacement, ajouter 1 ml de solution d'aminé (1,5 M dans du DMF). Agiter la résine pendant 60 minutes à température ambiante. Égoutter la solution et laver la résine avec 2 ml de DMF à trois reprises.
      1. Pour ajouter un monomère de type arginine, suivez l'étape 1.7. En fonction de la séquence souhaitée peptoïde, différentes aminessera ajouté.
   6. Répétez les étapes 1.1.4 et 1.1.5.
   7. Pour inclure un monomère fonctionnalisé de guanidine (ie, N Arg), ajouter 1 ml de solution de diamine non protégé (1,5 M dans du DMF) à la résine et agiter pendant 60 min à température ambiante.
      1. Égoutter la solution et laver la résine avec 2 ml de DMF à trois reprises.
      2. Ajouter 2-acetyldimedone (0,2 g, 1 mmol dans 0,5 ml de DMF, 10 équivalents) pour ajouter le groupe Dde à l'amine primaire libre et agiter pendant 60 min à température ambiante. Égoutter la solution et laver la résine avec 2 ml de DMF à trois reprises.
   8. Continuer la synthèse sous-monomère comme dans 1.1.4 à 1.1.7 jusqu'à ce que la séquence désirée est faite. Ajouter 2 ml de DMF pour laver la résine et répéter trois fois.
   9. Pour déprotéger le groupe Dde de résine, ajouter la solution d'hydrazine 4 ml de 2% (dans le DMF v / v) et agiter pendant 3 min à température ambiante. Égoutter la solution et répéter trois fois.
   10. Égoutter la solution et laver la résine avec 2 ml de DMF trois times.
   11. Ajouter pyrazole-1-carboxamidine (6 équivalents par amine libre, soit par des monomères N Arg, dans le volume minimum de DMF) et N, N - diisopropyléthylamine ou DIPEA (6 équivalents par amine libre) et agiter à la température ambiante pendant 60 min .
   12. Égoutter la solution et laver la résine avec 2 ml de dichlorométhane trois fois. Laisser la résine sécher à l'air pendant 10 minutes, puis la résine peut être stocké jusqu'à ce clivage (section 2).
   13. Pour interrompre la synthèse, laver la résine avec 2 ml de DMF à trois reprises. Ajouter 2 ml de DMF, obturer le récipient de synthèse et laisser à température ambiante dans une hotte.
       REMARQUE: La synthèse peut être interrompue après chaque étape de déplacement (excepté la seconde étape de déplacement en tant que dicétopipérazines peut être formé).
2. Déprotection des chaînes latérales et le clivage de la résine
   1. Entreprendre une clivent de test pour vérifier l'état d'avancement de la synthèse (pureté et de masse) à tout moment au cours de la synthèse après la displamarches en ciment, ajout ou le retrait du groupe Dde-protection ou après la séquence finale a été faite.
      1. Transférer environ 10 billes de résine à partir du récipient de réaction dans une nouvelle cartouche 8 ml de polypropylène fritté.
      2. Ajouter 1 ml de trifluoroacétique clivage d'acide cocktail (contenant 95% de TFA, 2,5% H ₂ O, 2,5% triisopropylsilane) et agiter pendant 90 min à température ambiante.
      3. Filtrer le clivage cocktail de TFA de la résine en utilisant le récipient de réaction en une fritte de 10 ml ballon à fond rond.
      4. Evaporer le cocktail de clivage en utilisant un évaporateur rotatif et on redissout l'huile obtenue dans 1 ml d'acétonitrile / eau pour les soumettre à LC-MS ou par HPLC analytique.
   2. Pour le clivage final: dans la même cassette de réaction de polypropylène fritté utilisé pour la synthèse, ajouter 4 ml du cocktail de clivage TFA (95% de TFA, 2,5% de H ₂ O, 2,5% de triisopropylsilane) et le couvercle du récipient. Agiter pendant 90 min à température ambiante.
   3. Filtre ee cocktail de clivage TFA la résine en utilisant le récipient de réaction en une fritte de 50 ml ballon à fond rond.
   4. Evaporer le cocktail de clivage en utilisant un évaporateur rotatif. Après que le TFA a été éliminé, le produit doit être obtenu sous la forme d'une huile. Pour faciliter l'élimination de TFA de ce pétrole brut, ajouter de l'éther de diéthyle 2 ml anhydre et le peptoïde devrait précipiter.
      1. Soit éliminer l'éther de diéthyle via une pipette et les jeter ou évaporer l'aide d'un évaporateur rotatif. Répétition de l'éther diéthylique trois fois la précipitation.
   5. On dissout le peptoïde brut dans 10 ml de solution d'acétonitrile / eau acidifiée (50% d'acétonitrile, 0,1% de TFA dans de l'eau v / v). Transférer dans un conteneur pré-pesée, gel à 20 ° C et lyophiliser à une poudre sèche.

2. Caractérisation et purification

REMARQUE: La synthèse peptoïde peut être contrôlée et évaluée peptoïde finale en phase inverse par HPLC analytique en utilisant une colonne C18 et electrospray liquide chromatographie spectrométrie de masse (LC-MS). Tous les solvants HPLC des solvants pour le LC-MS doivent être fraîchement préparées.

1. HPLC analytique
   1. Peser 1 mg de peptoïde dans un petit flacon en verre. Ajouter le volume minimum d'acétonitrile pour dissoudre et diluer à 1 ml avec de l'eau. Assurez-vous que le peptoïde a complètement dissous.
   2. Injecter 10 ul à une HPLC analytique (suggéré gradient 0-100% de solvant B en 30 minutes, où le solvant A = 95% d'eau, 5% d'acétonitrile, 0,05% de TFA et le solvant B = 95% d'acétonitrile, 5% d'eau, 0,03% de TFA) , conformément aux instructions du fabricant.
   3. Visualiser le spectre UV à 220 nm.
2. ESI LC-MS
   1. Faire 1 mg / ml solution peptoïde comme à l'étape 2.1.1.
   2. Injecter 1 pi à électropulvérisation CL-SM pour déterminer si le poids moléculaire du peptoïde cible est présent, en utilisant les instructions du fabricant.
   3. Vérifiez la masse cible de la séquence en utilisant un peptoïde Peptcalculatrice oid, selon les instructions de la calculatrice. ²⁶ Cet utilitaire Web permet également l'attribution de tous les produits d'addition / suppression observées dans le spectre de masse. ²⁶
3. HPLC préparatrice en phase inverse
   1. Dissoudre peptoïdes brut dans 2 ml d'eau acidifiée / acétonitrile (95% d'eau, 5% de MeCN, 0,1% de TFA) et on purifie par RP-HPLC preparative en utilisant le protocole du fabricant. Déterminer le gradient du temps d'élution obtenu à partir d'une HPLC analytique, et la quantité injectée dépendra des dimensions de la colonne.
   2. Visualiser l'aide d'un détecteur réglé à 220 nm.
   3. Collecter des fractions dans 15 ml tubes de centrifugation, le gel à 20 ° C et lyophiliser.
   4. Re-analyser les fractions en utilisant la LC-MS et HPLC analytique selon le protocole du fabricant. Combinez fractions purifiées.

3. Test biologique contre Leishmania mexicana parasites

Caution:. Les évaluations de sécurité doivent être effectués avant de commencer la synthèse Leishmania mexicana est classé un danger groupe 2 pathogène au Royaume - Uni et des mesures de contrôle adéquates doivent être en place avant le début des essais. Tous les travaux doivent être effectués dans une armoire de classe 2 de sécurité microbiologique et l' équipement de protection individuelle adéquat porté comme ( par exemple, des gants en nitrile, lunettes de sécurité et une blouse de laboratoire) appropriés.

1. Subculture des parasites
   1. Décongeler 1 ml -150 ° C stock congelé Leishmania mexicana M379 en plaçant le flacon dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 30 sec.
   2. Transférer la solution mère à 10 ml de milieu Insect Schneider (à pH 7,0 additionné de 15% de sérum de veau fœtal inactivé à la chaleur et 1% de pénicilline / streptomycine) dans un 25 cm ³ culture cellulaire flacon avec un bouchon non ventilé.
   3. Incuber à 26 ° C pendant 72 heures.
   4. Examiner les parasites au microscope (grossissement 400X) pour vérifier l'état. they devrait être promastigotes de scène d'insectes, formes procycliques en phase logarithmique avec de nombreuses cellules en division.
   5. Maintenir promastigotes procycliques par des parasites sous-culture à une concentration de 5 x 10 ⁵ parasites / ml tous les trois jours. Nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre Neubauer amélioré.
2. La transformation de L. mexicana stade d'insecte en axénique stade mammifère forme amastigote ²⁷
   1. Jour 0: Préparer 10 ml de culture de parasites au stade rondin à 5 x 10 ⁵ parasites / ml dans le milieu d' insecte de Schneider (à pH 7,0 supplémenté avec du sérum bovin fœtal à 15% inactivé par la chaleur et 1% de pénicilline / streptomycine) dans un ³ cellules 25 cm flacon de culture avec un bouchon non-ventilé.
   2. Incuber à 26 ° C pendant 48 heures.
   3. Jour 3: Transférer 10 ml de la culture dans un tube de centrifugeuse de 50 ml et centrifuger à 447 g pendant 5 min.
   4. Décanter ancien milieu et ajouter 10 ml de milieu Insect Schneider (à pH 5,5 additionné de 20% hmanger inactivé par du sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline / streptomycine). Resuspendre doucement le culot de parasites dans le nouveau milieu à l'aide d'une pipette.
   5. Comptez le nombre de parasites à l'aide d'une amélioration de hémocytomètre Neubauer. Diluer à une concentration de 5 x 10 ⁵ parasites / ml avec un pH de 5,5 à moyen et transfert à une cellule 25 ^cm3 flacon de culture.
   6. Incuber à 26 ° C pendant environ 6 jours.
   7. Jour 9: Examiner les parasites au microscope (400X). Ils devraient être dans le non-réplication, le stade de promastigotes métacycliques infectieux.
   8. Comptez le nombre de parasites à l'aide d'une amélioration de hémocytomètre Neubauer. Diluer à une concentration de 5 x 10 ⁵ parasites / ml avec un pH de 5,5 moyenne.
   9. Prélever 10 ml de culture de cellules et le transfert à flacon de culture cellulaire. Incuber à 32 ° C pendant 5 jours.
   10. Le jour 14: Vérifiez apparition de parasites sous le microscope (400X). Ils devraient être au stade amastigote pathogène, manquant le caractère flagelleistic de promastigotes, et prêt pour le dosage.
3. Cytotoxicité test sur L. mexicana amastigotes axéniques.
   NOTE: Le test biologique de peptoïdes utilise des dosages à haut débit réalisées en plaques à 96 puits. Ce protocole décrit les essais de L. mexicana amastigotes axéniques, mais des tests identiques peuvent également être réalisées sur les parasites au stade promastigotes dans les médias appropriés. Les composés sont mis à incuber avec des parasites à des concentrations de 3 - 100 uM pendant 60 min puis incubées pendant 24 heures après une dilution de 10 fois. Les résultats sont obtenus en mesurant la fluorescence des puits après incubation avec une solution de viabilité cellulaire à base de résazurine (par exemple alamarBlue).
   1. Préparer des solutions de composés. Peser 1 mg du produit peptoïde final purifié en utilisant une balance analytique. Ajouter le volume approprié de diméthylsulfoxyde de qualité biologie moléculaire (DMSO) à une concentration de 5 mM. Faire 6 aliquotes etcongeler à -20 ° C.
   2. Préparer des solutions de composés sur des plaques à 96 puits (une disposition de la plaque recommandée peut être vu dans la section des résultats, figure 6) en triple exemplaire 100-3 uM. Ajouter 2 pi de solution à 5 mM de chaque composé dans la rangée supérieure (c. -à- A). Ajouter 48 ul de milieu Insecte frais de Schneider (à pH 5,5 et 20% de sérum de veau fœtal (FBS), 1% de pénicilline / streptomycine (P / S)) en haut de ligne à l'aide d'une pipette multi-canal. Ajouter 25 pi de milieu Insect Schneider à toutes les autres lignes (B - F).
      1. Effectuer une dilution en série par pipetage 25 solution ul de la rangée supérieure. Ajouter à la ligne ci-dessous et mélanger. Effectuer des dilutions jusqu'à ce que la dernière rangée, où la dernière solution à 25 pi doit être jeté.
      2. Utilisez amphotéricine (actions 5 mM) B comme témoin positif et le DMSO (solution à 2%) comme témoin négatif en triple.
   3. Préparer une solution du parasite: la culture de transfert dans un tube de centrifugeuse de 50 ml et centrifuger à447 g pendant 5 min. Décanter ancien milieu et ajouter 10 ml d'insectes moyen de Schneider (à pH 5,5 et 20% de FBS, 1% P / S).
   4. dissoudre doucement le culot de parasites dans le nouveau milieu à l'aide d'une pipette et compter à l'aide d'une amélioration de hémocytomètre Neubauer. Diluer la culture 8 x 10 ⁶ parasites / ml.
   5. Ajouter 25 pi L. culture mexicana à chaque puits. Incuber les plaques pendant 60 minutes à 32 ° C.
   6. Retirer la plaque de l'incubateur et éliminer la solution de 40 pi de chaque puits.
   7. Ajouter 90 ul du milieu frais et incuber pendant 24 heures à 32 ° C.
   8. Ajouter une solution de viabilité cellulaire à base de résazurine 10 pi à chaque puits. Incuber pendant 4 heures à 32 ° C.
   9. Mesurer la fluorescence en utilisant un lecteur de plaque (λ _ex = 540 nm, λ _em = 600 nm), selon les instructions du fabricant. Analyser les données en retirant fond moyen (à partir du milieu seulement des puits) et en comparant la fluorescence des puits après normalisation par rapport à til DMSO témoins.

Résultats

En conséquence représentative, la synthèse et la caractérisation de deux 12 peptoïdes de résidus contenant deux monomères de type lysine et de monomères de type deux-arginine chacun sera décrit. Les résultats suivants du test de cytotoxicité sont également représentés.

Deux peptoïdes [(N NarG N spe N spe) (N ae N spe N spe)] ₂ (a) et [(N hArg N spe N spe) (N Lys N spe N spe)] ₂ (b) ont été synthétisés en utilisant résine 120 mg Rink amide chaque (charge = 0,79 mmol / g). Tous les déplacements acétylation et les étapes ont été réalisées comme décrit ci-dessus, avec tous les réactifs achetés dans le commerce. Pour ces résidus, les amines suivantes ont été utilisées dans l'étape de déplacement: N spe (S) - (-) - α-méthylbenzylamine, la N ae N - (tert - butoxycarbonyl) -1,2-diaminoethane, N Lys N - (tert - butoxycarbonyl) -1,4-diaminobutane. Pour les résidus arginine dérivés, les diamines non protégés suivants ont été couplés: N hArg 1,4-diaminobutane ou N NARG 1,2-diaminoéthane, suivie par la protection en résine avec 2-acetyldimedone (Dde-OH). Après la séquence entière avait été synthétisée, hydrazine déprotection du Dde donne des amines libres à guanidinylate.

Figure 1. Structures peptoïdes (a) [(N NarG N spe N spe) (N ae N spe N spe)] ₂ et (b) [(N hArg N spe N spe) (N ng> Lys N spe N spe)] _2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La figure 2. Le procédé utilisé pour la synthèse des peptoïdes mixtes arginine / lysine. I. pas de déplacement standard dans la méthode de sous-monomère avec une diamine; ii. Ajout de Dde-OH, 90 minutes pour protéger amine libre; iii. D'autres additions pour étendre la chaîne de peptoïde selon la méthode de sous-monomère; iv. Déprotection de Dde en utilisant 2% d'hydrazine dans du DMF; . V Guanidinylation d'amine libre sur résine avec pyrazole-1-carboxamidine et de DIPEA dans le DMF; vi. le clivage acide de la résine et déprotection des groupements Boc.large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Après le clivage de la résine et lyophilisation, les produits bruts ont été obtenus sous forme de poudres blanches: (a) 154 mg, (b) 163 mg. Les produits ont été purifiés par RP-HPLC comme décrit en relation avec un maximum de 50 mg d'injections en utilisant une pompe à cristaux liquides avec un détecteur UV-visible (λ = 250 nm) sur une colonne analytique de 250 mm x 10 mm, 5 um; débit = 2 ml / min. Les fractions correspondant à la masse de la cible ont été combinées et obtenus sous forme de poudres blanches: (a) 54 mg (b) 65 mg, rendement final d'environ 30% pour les fractions de pureté> 90%.

L'identité des composés finaux ont été confirmées après purification par LC-MS (voir la figure 3) en utilisant un spectromètre de masse triple quadripolaire équipé d'un UPLC et un détecteur à réseau de photodiodes. spectrométrie de masse précise a été réalisée en utilisant le même spectromètre t il [M + 2H] ^2+. Ce qui suit calculé et masses observées ont été trouvés en accord étroit (Figure 4): (a) calculée = 896,0026 amu, observée = 896,0038 amu; (B) calculé = 952,0691 amu, observée = 952,0730 amu.

Figure 3. LC-MS pour peptoïdes purifiées. (A) m / z = 1,792 et (b) m / z = 1,903. Lorsque le sommet est TIC, le spectre LC-MS middle, bottom chromatogramme UV à 220 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Les données de spectrométrie de masse précises pour les peptoïdes (a) et (b).cible "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig4large.jpg" = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La pureté du produit a été évaluée en utilisant une RP-HPLC (pompe LC avec un détecteur UV-vis sur une colonne analytique, 4,6 mm x 100 mm, 3,5 um; débit = 1 ml / min) analytique et visualisé à 220 nm, l'absorbance amide de squelette. la figure 5a et 5b montre que les composés sont homogènes.

La figure 5. La CLHP analytique des peptoïdes purifiés (a) et (b). Il y a un gradient de 0-100% de B sur 30 minutes, la colonne four à 40 ° C (A = 95% de H ₂ O, 5% de MeCN, 0,05 % de TFA;. B = 95% de MeCN, 5% de H ₂ O, 0,03% de TFA) S'il vous plaît clbeurk ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les peptoïdes purifiées (a) et (b) ont été testés dans des essais de cytotoxicité contre L. mexicana amastigotes axéniques. Les stocks congelés de L. mexicana ont été décongelés et transformé à l'étape amastigote prêt pour l'essai. 72 heures après la décongélation, les parasites doivent être promastigotes au stade d'insectes dans leur forme procyclique, en phase logarithmique avec de nombreuses cellules en division. A ce stade , les parasites peuvent être transformés en stade amastigote en utilisant le changement de pH et de température décrit. ²⁷ Au jour 9 de la transformation, les parasites seront au stade de promastigotes métacycliques infectieux non réplicatif. Enfin au Jour 14, les parasites doivent être au stade pathogène amastigote où les parasites manquent de flagelles caractéristique des promastigotes. ²⁸

5 mM de solutions mères des composés ont été réalisées dans le grade de culture cellulaire DMSO et testés en triple exemplaire surun minimum de deux occasions pour assurer un ensemble de données robuste a été recueilli. Un plan de plaque à 96 puits représentatif est montré sur la figure 6. A la fin de l'essai, le réactif de la viabilité des cellules a été ajouté à chaque puits et la fluorescence a été mesurée comme décrit pour le calcul de la viabilité des parasites à chaque concentration testée (voir Figure 7 ). Les valeurs de _DE50 ont été calculées comme peptoïde (a)> 100 pM de peptoïde et (b) de 37 pM , respectivement. Les barres d'erreurs représentées, correspond à la variation entre les puits en tant que l'écart type et on peut constater que ceux-ci sont raisonnables pour la plupart des barres.

Figure 6. Représentant 96 plan de plaque de puits pour un test de cytotoxicité sur 2 solutions de peptoïdes (y compris les contrôles positifs et négatifs). Med + = moyen (Insect Medium Schneider, pH 5,5, 20% de FBS, 1% P / S). L. Mex. =8 x 10 ⁶ / ml parasite culture dans med +. AmphoB = 5 mM dans du DMSO. mM solution peptoïde = 5 dans le DMSO. Puits vides doivent contenir de l' eau stérile. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7. Les résultats de cytotoxicité test contre L. les parasites amastigotes de mexicana à l' aide peptoïde (a) et (b). On peut voir que le peptoïde (b) est plus efficace que le peptoïde (a) à réduire le pourcentage de parasites viables, à la fois des composés ayant un effet dépendant de la dose. Les barres d'erreur tracés montrent la variation entre les puits comme un écart - type. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Les peptoïdes sont de plus en plus étudiés dans la biologie chimique et les domaines de chimie médicinale dans des applications telles que de nouveaux agents thérapeutiques ^3-5, les agents de distribution de cellules ^18,20 et les outils de diagnostic. ²⁹ Typiquement, ces séquences sont cationiques pour fournir un degré de sélectivité pour le pathogène sur des cellules de mammifère, la capacité à pénétrer à travers les membranes cellulaires et également favoriser la solubilité dans les systèmes aqueux. Il existe de nombreux exemples de peptoïdes cationiques qui contiennent des résidus uniquement lysine ou arginine-mimétique dans la littérature. Cependant, à ce jour, la synthèse des peptoïdes qui contiennent à la fois de ces résidus cationiques dans la même séquence a été entravée par l'absence d'un procédé de synthèse approprié. Le protocole décrit ici permet peptoïdes cationiques mixtes être synthétisés d'une manière efficace et il est hautement souhaitable, car elle offre un moyen de moduler les propriétés biologiques et chimiques des peptoïdes amphipathiques.

nt "> Notre procédé utilise une adaptation à la synthèse couramment utilisée peptoïde sous-monomère et permet l'addition des deux monomères lysine et de type arginine au sein de la même séquence. Il utilise des raccords à température ambiante et on a établi chimie des groupes protecteurs de sorte qu'il est prévu que ce procédé seront utiles pour la plupart des groupes de recherche. pour ajouter une protection orthogonale pour le résidu de type arginine, une diamine protégée est ajoutée dans des conditions de déplacement classiques et ensuite protégée par un couplage de 60 minutes avec Dde-OH. une variété de diamines peut être utilisé qui permet à des chaînes latérales de 2 atomes de carbone à 6 atomes de carbone longs à installer, à savoir le 1,2-diaminoéthane à 1,6 diaminohexane , respectivement. La protection de Dde-OH se dissout bien dans le DMF et est un groupe très efficace et sélectif pour la protection des amines primaires. le groupe de protection Dde feuilles amines secondaires non affecté, par exemple l' extrémité N - terminale non protégée de la chaîne peptoïde. ³⁰ Une limitation est que tous synthèse a été réalisée manuellement; toutefois, il est prévu que les conditions de couplage développées rendent le procédé se prêtent à une utilisation avec des synthétiseurs automatiques de peptides / peptoïdes.

La déprotection de résine des groupes Dde est effectuée en utilisant une solution d'hydrazine à 2% dans du DMF pour laisser les amines libres qui peuvent être guanidinylated à l'aide d'une résine pyrazole-1-carboxamidine. Six équivalents de pyrazole-1-carboxamidine et six équivalents de DIPEA sont utilisés par une amine libre sur la résine ( par exemple, six équivalents pour chaque monomère de type N Arg doit être installé). Encore une fois, cette réaction est aussi efficace et le réactif pyrazole-1-carboxamidine a une bonne solubilité dans le DMF. Achèvement de la réaction est typiquement observée par LC-MS après 60 minutes à température ambiante.

En raison de la polyvalence du procédé de sous-monomère, une grande variété d'aminés primaires peuvent être utilisés dans l'étape de déplacement si les conditions peuvent avoir besoin d'être optimisé pour augmenter le couplage efficacité et les rendements globaux de produits ou de pureté. ³¹ Pour les séquences décrites ci - dessus, pas de conditions spéciales étaient nécessaires pour des accouplements réussis. Cependant, l' allongement des temps de déplacement ou de concentrations élevées d'aminé peuvent être utilisés pour des déplacements à problèmes ( par exemple, pour les amines nucléophiles ou encombrants stériquement mal). Des amines peuvent ne pas être complètement soluble dans le DMF, auquel cas il est recommandé de les dissoudre dans la N - méthyl-2-pyrrolidone (NMP) ou d' autres solvants appropriés pour les réactions en phase solide plutôt que dans un procédé global précédent pour la synthèse de sous - monomère des peptoïdes. ³² pour incorporer des monomères qui contiennent des hétéroatomes non protégés dans les chaînes latérales, une acétylation au moyen d' acide chloracétique a été démontré que pour être efficace par d' autres groupes. ³³ en outre, d' autres résines peuvent être utilisées avec cette méthode pour produire des peptoïdes ayant différentes fonctionnalisation C terminale. Wang résines et les résines de chlorure de 2-chlorotrityle sont couramment utilisés dans lasynthèse de sous-monomère peptoïdes. Par exemple, cette méthode a été utilisée avec succès avec de la résine de chlorure de 2-chlorotrityle dans notre groupe. ² supports solides différents nécessiteront une procédure de chargement différent Rink Amide discuté ici ( en fonction de la résine spécifique utilisée) ce qui devrait être vérifié avec la littérature avant la synthèse.

Similaire à la synthèse de peptides, les conditions pour le clivage final de la résine hors peptoïde peuvent également être optimisés pour la séquence spécifique. Dans ce protocole, un clivage cocktail TFA a été utilisé (avec triisopropylsilane et de l'eau comme des charognards). Les peptoïdes présentés ici ne contenaient que la protection Boc, qui est un groupe labile acide raisonnable. Pour assurer la déprotection complète des séquences avec une plus grande proportion de résidus protégés ou moins labiles des groupes protecteurs d' acide, de plus longs temps de coupure peut être nécessaire ( par exemple, les temps de coupure au - delà de 2 heures sont recommandées pour des séquences qui contiennent Pbf ou tert-buester tyl des groupes protégés). fixateurs alternatifs peuvent également être utilisés pour les chaînes latérales spécialisées (par exemple, d'éthanedithiol ou de 2-mercaptoéthanol sont souvent utilisés dans des peptides contenant du soufre ont des chaînes latérales, comme la cystéine ou la méthionine).

Le dosage biologique présenté est un test de cytotoxicité standard qui peut être modifiée pour convenir à différentes lignées cellulaires. Il est important de noter que chaque plaque de 96 puits doit contenir des contrôles suffisants pour permettre la confiance dans les résultats obtenus. Dans ce cas, l'amphotéricine B est utilisé en tant que contrôle positif car il est un médicament connu utilisé pour traiter la maladie et du DMSO est utilisé en tant que témoin négatif comme cela est le solvant utilisé pour fabriquer des stocks de composés pour le dosage. Si d' autres lignées cellulaires sont utilisées, d' autres, des contrôles appropriés doivent être obtenus et validés avant utilisation. L. mexicana est mis en incubation avec le peptoïde à des concentrations comprises entre 100 et 2 uM pendant une heure, puis la / solution peptoïde parasite est diluée parun facteur de dix pour une nuit d' incubation (ie, puits d' abord avec 100 uM peptoïde stocks sont dilués à 10 uM).

Le réactif de la viabilité des cellules est ajouté à chaque puits (10% du volume total du puits) à la fin de l'essai. Un changement de couleur visible est visible entre les puits avec des parasites viables (roses), des puits témoins sans parasites viables (bleu) et un spectre entre des nombres intermédiaires de parasites viables. La fluorescence est proportionnelle au nombre de cellules vivantes et qui correspond à l'activité métabolique des cellules; résazurine colorant (non fluorescent) est convertie en résorufine fluorescente par des réactions de réduction dans les cellules métaboliquement actives. ³⁴ Dans cet essai, le temps d'incubation avec le réactif de la viabilité des cellules a été optimisé pour L. mexicana. Les temps d'incubation avec le réactif de viabilité variera pour les plaques ensemencées à différentes concentrations cellulaires ou avec des lignées cellulaires différentes (par exemple, ce procédé peut également être utiliséavec des cellules de mammifères). En fonction du lecteur de plaque exact utilisé, les considérations doivent être faites avant les mesures de fluorescence sont prises. Les bulles d'air dans les puits doivent être enlevés afin d'assurer des lectures précises peuvent être prises. Certains lecteurs de plaques lues à partir du fond de plaques, dans ce cas, à fond plat de 96 plaques de puits doivent être utilisés. D'autres machines peuvent lire à partir du haut de la plaque, de sorte que le couvercle de la plaque doit être retirée avant la mesure.

Enfin, à l'avenir, ce protocole peut être compatible avec les synthétiseurs automatisés qui sont capables de faire de nombreuses séquences en parallèle. En outre, la synthèse des peptoïdes cycliques est également possible d'utiliser cette méthode. Ce protocole devrait fournir aux chercheurs une procédure de synthèse pratique qui peut être utilisé pour accéder à de nouveaux échafaudages peptoïdes avec les deux monomères lysine et de type arginine, qui peuvent être utiles dans de nombreuses applications, y compris des matériaux ou des champs médicinales.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cartouches d’extraction en phase solide en polypropylène avec deux frittes	Crawford Scientific	12131017 et 12131015	cartouches de 20 ml et 6 ml utilisées dans cette préparation
Acide trifluoroacétique	Tokyo Chemical Industry (Europe)	T0431-100g	>98 %; ATTENTION : peut provoquer de graves brûlures et une irritation respiratoire
N,N'-diisopropylcarbodiimide	Sigma Aldrich	38370-100ML	98 %; ATTENTION : dangereux pour les yeux, la peau et par inhalation respiratoire, peut également provoquer une sensibilisation au
Diméthylformamide	Fischer Scientific	10346180	grade HPLC ; ATTENTION : tératogène,
acétonitrile	Fischer Scientific	10407440	qualité HPLC
	Fischer Scientific	10354263	99,8 % ; ATTENTION : cancérogène suspecté
Acide bromacétique	Sigma Aldrich	17000-100G	>99 %; ATTENTION : provoque des brûlures et dangereux pour la peau, les yeux et les voies respiratoires
(S)-(-)-alpha méthylbenzylamine	Sigma Aldrich	115568-100G	98 %; ATTENTION : nocif en cas d’ingestion, toxique au contact de la peau, provoque de graves brûlures cutanées et lésions oculaires, utilisé pour synthétiser le monomère Nspe
N-Boc 1,4-diaminobutane	Tokyo Chemical Industry (Europe)	A1373-25g	>98 %; ATTENTION : provoque de graves brûlures cutanées et des lésions oculaires, utilisé pour synthétiser le monomère NLys
N-Boc 1,2-diaminoethane	Tokyo Chemical Industry (Europe)	A1371-25g	>97 %; ATTENTION : provoque de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires, utilisé pour synthétiser le monomère Nae
1,2-diaminobutane	Sigma Aldrich	D13208-100G	à 99 % ; ATTENTION : liquide et vapeur inflammables, nocifs en cas d’ingestion ou d’inhalation, toxiques au contact de la peau, provoquent de graves brûlures cutanées et lésions oculaires, utilisés dans la synthèse du monomère NhArg
1,4-diaminoethane	Sigma Aldrich	03550-250ML	99,5 %; ATTENTION : liquide et vapeur inflammables, nocifs en cas d’ingestion ou d’inhalation, toxiques au contact de la peau, provoquent de graves brûlures cutanées et lésions oculaires, utilisés dans la synthèse du monomère NnArg   ;   ;
1H-pyrazole-1-carboxamidine HCl	Sigma Aldrich	402516-10G	sous forme de sel HCl ; ATTENTION : nocif en cas d’ingestion et peut provoquer une réaction allergique cutanée, provoque de graves lésions oculaires
Hydrazine monohydrate	Sigma Aldrich	207942-5G	qualité réactif ; ATTENTION : cancérogène suspecté, mortel en cas d’inhalation et provoquant de graves brûlures à la peau et aux yeux
2-acétyldimédone	Novabiochem	8510150005	Dde-OH
Rink Amide résine	Novabiochem	8551190005	100-200 mesh, haute charge
Piperidine	Sigma Aldrich	411027-1L	>99,5 %, une substance contrôlée, donc une autorisation adéquate doit être obtenue avant l’achat ; ATTENTION : les liquides et les vapeurs hautement inflammables, nocifs en cas d’ingestion et toxiques au contact de la peau ou en cas d’inhalation, provoquent de graves brûlures cutanées et des lésions oculaires, nocifs pour la vie aquatique avec des effets durables
Triisopropylsilane	Sigma Aldrich	233781-50G	98 %; ATTENTION : liquide et vapeur inflammables, provoque une irritation cutanée et une irritation oculaire grave
alamarBlue	ThermoFischer  ;	DAL1025	Non classé comme dangereux
Schneider’s Insect Medium	Sigma Aldrich	S9895-1L	En poudre, le milieu doit être fabriqué avant l’utilisation en suivant les instructions du fabricant ; laisser chauffer à température ambiante avant d’être utilisé dans des tests biologiques
96 plaques de puits	VWR	734-1793	Fond plat (pour permettre la mesure de la fluorescence par le bas), traité pour culture tissulaire
Réservoirs de solvants	VWR	613-1182	Utilisé avec une pipette multicanaux
Pipette multicanaux	Eppendorf	3122000043
Pointes de pipette	Starlab Group	S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810	Le volume de la pointe dépend de la pipette utilisée. 10  ; et micro ; l, 10 - 200  ; et micro ; l et 1 000  ; et micro ; l recommandé pour les dosages
25 cm3 Fioles de culture cellulaire	VWR	734-2312
50 ml Tubes à centrifuger	VWR	525-0791
diméthylsulfoxyde (qualité biologie moléculaire)	Sigma Aldrich	D8418-50ML	Non classé comme dangereux
Sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur	ThermoFischer  ;	10082139-100mL
Gibco Pénicilline/Streptomycine	ThermoFischer  ;	15140148-20mL	Abréviation : P/S
Amphotéricine B	Sigma Aldrich	46006-100mg	Amphotéricine B trihydratée, étalon analytique VetranalTM