Diffusion moléculaire Membranes plasmatiques de Lymphocytes primaires mesurées par Fluorescence Correlation Spectroscopy

Résumé

Une méthode de mesure de la diffusion des protéines dans les membranes des cellules immunitaires primaires à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) est décrite. Dans cet article, l’utilisation d’anticorps pour le marquage fluorescent est illustrée.

Résumé

spectroscopie de fluorescence de corrélation (FCS) est une technique puissante pour étudier la diffusion des molécules dans les membranes biologiques avec une résolution spatiale et temporelle. FCS peut quantifier la concentration et le coefficient de diffusion moléculaire des molécules marquées par fluorescence dans la membrane cellulaire. Cette technique a la capacité d'explorer les caractéristiques de diffusion moléculaire de molécules dans la membrane plasmique des cellules immunitaires à l' état d' équilibre (ie, sans processus affectant le résultat pendant la durée de la mesure réelle). FCS est adapté à l'étude de la diffusion des protéines qui sont exprimées à des niveaux typiques pour la plupart des protéines endogènes. Ici, un procédé simple et robuste pour déterminer le taux de protéines de la membrane cellulaire sur les lymphocytes primaires de diffusion est démontrée. Un moyen efficace d'effectuer des mesures sur des cellules vivantes d'anticorps tachés et observations qui se produisent souvent après acquisition sont décrits. Les récents progrèsdans le développement des colorants fluorescents photo-stable peut être utilisé en conjugant les anticorps d'intérêt pour les colorants appropriés qui ne sont pas largement décolorent lors de la mesure. En outre, cela permet la détection d'entités à diffusion lente, ce qui est une caractéristique commune des protéines exprimées dans les membranes cellulaires. La procédure d'analyse pour extraire des paramètres de concentration et de diffusion moléculaire à partir des courbes d'auto-corrélation générée est mise en évidence. En résumé, un protocole de base pour la mesure FCS est fourni; elle peut être suivie par des immunologistes avec une compréhension de la microscopie confocale, mais sans autre expérience préalable des techniques de mesure des paramètres dynamiques, tels que les taux de diffusion moléculaire.

Introduction

De nombreuses fonctions des cellules immunitaires reposent sur la diffusion et les interactions au sein des membranes moléculaire. Les membranes biologiques sont complexes et nombreux facteurs qui peuvent être importants pour la fonction des cellules immunitaires peuvent influencer la vitesse de diffusion translationnelle des protéines dans les membranes cellulaires ^1. Nous avons récemment montré que tueuses naturelles (cellules NK), les lymphocytes appartenant au système immunitaire inné, présentent la diffusion différentielle de deux protéines étudiées à la membrane cellulaire en fonction de l'état de l' activation des cellules NK ^2.

La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) est une technique qui est capable de quantifier les vitesses de diffusion moléculaire dans les membranes biologiques. Il rend compte de la vitesse de diffusion moyenne de molécules marquées par fluorescence dans un volume fixe, généralement l'objet d'un microscope confocal. Elle est basée sur la mesure des fluctuations de fluorescence qui se produit lors d'un mouvement moléculaireun système dans l'état d'équilibre. FCS a été largement utilisé pour l'étude de la diffusion des colorants et des protéines fluorescentes, à la fois en solution et dans des membranes lipidiques. D' autres paramètres de sortie qui affectent la vitesse de diffusion peuvent également être étudiés indirectement de cette manière (par exemple, des changements de conformation des protéines ou des interactions des molécules sur les membranes cellulaires) ^{3, 4.} FCS se distingue par rapport aux autres techniques en raison de sa haute sensibilité, ce qui permet la possibilité pour la détection de molécule unique. Cela fonctionne bien pour les concentrations moléculaires dans la gamme nanomolaire à millimolaire, ce qui est typique pour des niveaux d'expression endogènes de la plupart des protéines ^5. En outre, FCS peut donner une approximation du nombre absolu de protéines dans le volume étudié, alors que la plupart des autres techniques donnent seulement des informations relatives au sujet des niveaux d'expression de protéine. D'autres méthodes pour mesurer les taux de diffusion moléculaire dans les membranes comprennent fluorécupération rescence après photoblanchiment (FRAP), seul le suivi des particules (SPT), multiple sténopé FCS, et l'image de corrélation méthodes. Méthodes de FRAP et de l' image de corrélation sont des techniques d' ensemble, qui généralement ne donnent pas d' informations sur le nombre absolu de molécules ^10. Par rapport à SPT, le débit de FCS est plus élevé en ce qui concerne la caractérisation de la moyenne de la population. L'analyse est moins exigeant étant donné que la vitesse de diffusion moyenne des molécules présentes à l'intérieur de la focalisation du laser est mesurée, plutôt que le taux de molécules uniques. Aussi, à moins que des microscopes spécialisés sont disponibles ^11, SPT ne peut donner aucune information sur les concentrations, puisque l' étiquetage SPT standard doit être très faible pour permettre l'identification de molécules simples. D'autre part, FCS exige que les molécules à l'étude pour être mobile. Il sera tout simplement pas détecter d'éventuelles fractions ou molécules immobiles putatifs se déplaçant très lentement. Le taux de molécules de diffusion quirésider dans le foyer plus longtemps que d' environ un dixième du temps d'acquisition ne sera pas correctement représentée dans les mesures de FCS ^{3, 12.} Par conséquent, les coefficients de diffusion enregistrés par FCS ont tendance à être plus rapide que les vitesses de diffusion signalés par des techniques comme FRAP et SPT, où les fractions proches à immobile et très lents sont pris en compte. SPT donnera également une description plus détaillée de la variabilité des taux de diffusion au sein de la population moléculaire que FCS sera.

FCS quantifie la fluctuation d'intensité de fluorescence au fil du temps dans le volume excité. Dans le cas des mesures de la membrane, cela se traduit par la zone éclairée de la membrane. Dans cet article, nous utilisons le fait que de telles fluctuations sont induites par des molécules présentant la diffusion brownienne et se déplacent donc dans et hors du volume d'excitation. Il y a aussi plusieurs autres sources possibles pour la fluctuations du signal de fluorescence, comme clignotant ou la présence d'un état de triplet dans les fluorophores, des effets sur l'environnement, la liaison-déliaison du ligand, ou le déplacement de la membrane de la cellule entière. Ces sources d'erreur putatifs doivent être prises en considération lors de la conception d' une expérience FCS afin d'interpréter correctement les résultats ^{12, 13.} En règle générale, les taux de diffusion latérale dans les membranes biologiques sont faibles en raison de l'encombrement et des interactions entre les deux protéines de membrane et entre les protéines et le cytosquelette. Historiquement, l'utilisation de FCS dans les membranes a ainsi été entravée par le manque de fluorophores photo-stable, qui sont nécessaires pour éviter le blanchiment pendant les temps de transit prolongés à travers la mise au point d'excitation ^14. Cependant, aujourd'hui, il y a beaucoup d'options pour les colorants photo-stables appropriés. Des améliorations significatives dans les détecteurs et autres matériels permettent également la détection de prote fluorescentins et colorants de luminosité plus faible. Ici, un protocole de base pour l'application du FCS à l'aide de lymphocytes primaires murins, où la protéine d'intérêt est marqué avec un anticorps étiqueté par fluorescence, est décrite. Une approche pour adapter les courbes d'autocorrélation afin d'en extraire le coefficient de diffusion et la densité moléculaire est également représentée. Le protocole vise à être facilement suivie par immunologistes sans expérience préalable des techniques pour étudier la diffusion des molécules. Cependant, une compréhension de base de la microscopie confocale devrait (d'acquérir cette connaissance de base, voir la référence ^15). Ce protocole peut assez facilement être adapté à d'autres cellules en suspension, les deux lignées cellulaires et des cellules primaires. Pour les utilisateurs plus expérimentés FCS, des méthodes d'analyse plus raffinées existent, dont certains sont décrits dans la discussion.

Protocole

1. Coloration pour FCS

1. Isoler les cellules NK murines à partir de lymphocytes de la rate à l' aide de marquage magnétique de perles, selon le protocole du fabricant ^16. Utilisez 2-3 x 10 ⁵ cellules par échantillon pour les étapes suivantes.
   REMARQUE: Utiliser une sélection négative pour enrichir la population de cellules cibles, en laissant intact, de sorte que les cellules peuvent être marquées en utilisant des anticorps primaires seuls. Voir référence ² pour obtenir des informations plus détaillées sur l' isolement des cellules de souris ^2.
2. Pour des cellules de souris exprimant les récepteurs Fc, bloquer les récepteurs Fc avec l'anticorps clone 2.4G2 à 5 pg / ul dans 25 ul de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 1% de sérum de fœtus bovin (FBS) par échantillon. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
3. Préparation d' un mélange d'anticorps.
   1. Utilisez des anticorps directement conjugués à un fluorophore photo-stable. Si deux anticorps contre deux protéines différentessont utilisés, fluorophores d'utilisation qui ont des spectres d'émission bien séparés pour minimiser la diaphonie (par exemple, excité par les 488 et 633 lasers ^2, plus tard dans le protocole dénommé les lasers et les fluorophores "verts" et "rouges", respectivement ).
      NOTE: Si les anticorps commerciaux marqués avec des fluorophores photo-stable ne sont pas disponibles pour les biomarqueurs choisis, conjugués anticorps non marqués aux fluorophores selon les instructions du fabricant. Voir le tableau des matériaux pour les anticorps utilisés dans cette étude.
   2. Préparer un mélange d'anticorps par dilution d'anticorps marqués par fluorescence contre la protéine ou des protéines d'intérêt dans du PBS + 1% de FBS. Ajouter le mélange d'anticorps de chaque échantillon à un volume final de 50 ul par échantillon. Incuber sur la glace pendant 45 min dans l'obscurité.
      REMARQUE: Optimisation de la concentration des anticorps à l'avance pour faire en sorte que l'anticorps est utilisé à une concentration saturante, typiquement1 à 10 pg / ml.
4. Après incubation, laver les cellules en ajoutant 250 pi de PBS et centrifuger les à 150 g pendant 3 min. Jeter le surnageant.
5. Répétez l'étape 1.4.
6. Remettre en suspension les cellules dans 200 pi de PBS + 1% de FBS. Gardez sur la glace et dans l'obscurité jusqu'à l'acquisition.
   NOTE: les cellules NK murines peuvent être conservés sur la glace pendant jusqu'à 10 heures.

2. Préparation du microscope Chambered coverglass Diapositives

REMARQUE: Utilisez des diapositives ou des plats de lamelle chambré avec l'épaisseur du verre de couverture que le microscope a été optimisé pour, soit # 1 ou # 1.5. Si le microscope est pas aligné pour une certaine épaisseur, ou si elle est inconnue, l'anneau microscope collier doit être optimisé pour l'épaisseur de la lamelle ¹⁷ actuelle.

1. Diluer la poly-L-lysine avec de l'eau distillée dans un rapport de 1:10. Ajouter 200 ul de dilution de poly-L-lysine dans les chambres et mettre à incuber pendant 20 min.
2. Retirer lepoly-L-lysine par aspiration et laisser la chambre d'air sec en le laissant sans couvercle à la température ambiante pendant au moins 20-30 minutes.

3. Démarrage du système FCS

NOTE: Ce protocole se réfère à un système de microscope spécifique et logiciel (voir Matériaux / Réactifs Table), bien que d' autres configurations de microscopie et de logiciels peuvent également être utilisés.

1. Allumer le microscope confocal à balayage laser avec le corrélateur de FCS. Ouvrez le logiciel en mode "Expert". Sélectionnez le 40X lentille d'immersion dans l'eau.
2. Sous l'onglet "Acquisition", appuyez sur la "Config" et les boutons "Scan" pour ouvrir la "Configuration Control" et les fenêtres "Scan Control" (fenêtres A et B sur la figure 1, respectivement). Sous l'onglet "ConfoCor", appuyez sur "Mesure" pour ouvrir la fenêtre "Mesure" (fenêtre de C dans la figure 1).
3. Créez un dossier pour enregistrer le FCSdes mesures. Démarrer une nouvelle base de données de l'image en cliquant sur "Nouveau" sous l'onglet "Fichier".
4. En utilisant le bouton "Laser", allumer la lampe halogène et les lasers pertinents pour exciter les fluorophores (par exemple, 488 nm pour le laser d'excitation "vert" et 633 nm d'excitation pour le "rouge" laser d'excitation).
5. Sélectionnez les filtres d'excitation et d' émission appropriés et activer les détecteurs correspondants.
   1. Spécifiez les paramètres pour la capture d'image, y compris les lasers d'excitation, d'excitation et d'émission des filtres, chemin de lumière et des détecteurs à utiliser, dans la fenêtre "Configuration Control".
   2. De même, spécifiez les paramètres correspondants pour les mesures FCS dans la fenêtre "Mesure", sous l'onglet "Configuration du système". Utiliser les paramètres aussi semblables que possible pour l'imagerie et FCS.
   3. Activer les canaux de détection pour les enregistrements de FCS en cochant la case "Ch1" pour la channe vertel et "Ch2" pour le canal rouge dans la fenêtre "Mesure".
      REMARQUE: Les paramètres doivent être optimisés pour le fluorophore (s) utilisé, comme dans une expérience d'imagerie confocale standard. Dans des expériences ultérieures, les mêmes paramètres FCS peut être réutilisé par l'ouverture d'un ancien fichier FCS, en utilisant le menu "ConfoCor" déroulant en haut de l'interface utilisateur, et en choisissant "Ouvrir le fichier." Appuyez sur "Réutilisation" dans la fenêtre émergente d'acquisition. De même, les paramètres d'acquisition d'image peuvent être chargés par l'ouverture d'une image enregistrée et en appuyant sur "Réutilisation."
6. Attendez jusqu'à ce que le laser est stable avant d'effectuer des mesures FCS. Cela peut prendre jusqu'à 30 minutes pour les lasers à gaz, tandis que les diodes lasers stabilisent plus rapidement. Ajuster le sténopé en attendant.

4. sténopé Ajustement

1. Préparer 0,2-0,5 uM solutions de fluorophores ou des colorants fluorescents correspondant à l'excitation et d'émission des spectres des étiquettes sur les anticorps. lefluorophores doivent avoir connu des coefficients de diffusion ^{18, 19.}
2. Mettre une goutte de 50 pi de solution avec le fluorophore excité par le laser vert dans le centre d'un puits dans une diapositive coverglass chambré. Mettre une goutte d'eau distillée sur l'objectif de l'eau 40X et positionner la glissière. Appuyez sur le bouton "Afficher" pour démarrer la lumière visible et utiliser l'oculaire de trouver et de mettre l'accent sur la chute de fluorophore.
   REMARQUE: Utilisez la même diapositive que pour les mesures de cellules plus tard, étant donné que de légères variations putatifs dans l'épaisseur du verre entre les diapositives peuvent affecter l'alignement du microscope.
3. Placer l'accent bien à l'intérieur de la goutte de liquide (10-100 um à partir du bas).
4. Dans la fenêtre "Mesure", sélectionnez l'onglet "Acquisition". Appuyez sur "Position actuelle" sous les "Positions" (fenêtre de C dans la figure 1).
5. Retour à l'onglet "Configuration du système" dans la même fenêtre. Définir une haute peurs pour le laser vert.
   REMARQUE: un laser à haute puissance fait référence à la puissance de saturation ( à savoir, le signal fluorescent ne pas augmenter de façon linéaire si la puissance du laser est augmentée plus loin). Autour de 1 mW de réglages système de puissance, ou 5-10% de la puissance du laser max, est généralement suffisant.
6. Tester la stabilité du signal en appuyant sur "Démarrer". Cela va ouvrir une fenêtre séparée affichant la trace du temps et de la courbe d'autocorrélation pour la mesure de courant. Vérifiez que le signal fluorescent est élevé, stable dans le temps, et montrant les fluctuations du kHz plutôt que la gamme de Hz.
7. Sélectionnez le bouton "O Ajuster" dans la fenêtre "Mesure". Vérifiez si le canal de détection droite (Ch1 ou Ch2) est sélectionné. Appuyez sur "AutoAdjust X." Si la courbe résultante ne montre pas un maximum clair, ou le maximum est à la pointe, marquer l'option "grossier" et appuyez sur "AutoAdjust X" à nouveau. Lorsque l'écran résultant dans la direction x est terminé, procédez comme samoi Y en appuyant sur "AutoAdjust Y."
8. De-sélectionner "grossier" et alterner entre le réglage X et Y en appuyant sur "AutoAdjust" jusqu'à ce que les deux ont des maxima clair et les valeurs ne changent pas entre les mesures.
9. Si les cellules sont marquées avec deux fluorophores différents, passer à une chambre dans laquelle la solution de fluorochrome rouge a été ajouté. Sélectionnez une forte puissance de laser pour le laser rouge et répétez les étapes 4,6-4,8 pour le canal d'excitation et de détection rouge.
   NOTE: Si les valeurs X et Y dévient entre les canaux dans les systèmes où un seul sténopé est utilisé pour les deux canaux de détection, sélectionner des valeurs intermédiaires et appuyez sur OK pour accepter les modifications. Ici, pour le laser à 488 nm avec des maxima à X = 79 et Y = 189 et le laser de 633 nm avec des maxima à X = 80 et Y = 188, les valeurs X = 80 et Y = 189 ont été sélectionnés. La combinaison des 488 nm et 633 nm pour l'excitation des lasers des deux anticorps marqués avec des fluorophores excités par 488 nm ou 633 nm, est un bon choix car lerisque de diaphonie est réduite si les spectres d'émission ne se chevauchent pas ^2.

5. Mesurer le temps de transit du fluorophore gratuit

REMARQUE: par la détermination du temps de transit à travers le foyer (taud) d'un fluorophore ayant un coefficient de diffusion connu, la taille du volume de détection, et par conséquent la surface de la membrane cellulaire qui est à l'intérieur du foyer, peuvent être calculés. Le calcul de taud est décrite à l'étape 7.2.

1. En utilisant les mêmes solutions utilisées pour le réglage sténopé, régler le temps d'acquisition à 30 secondes x 2 répétitions sous l'onglet "Acquisition" dans la fenêtre "Mesure" (figure 1, la fenêtre C).
2. Démarrer une mesure en cliquant sur "Démarrer" dans la fenêtre "Mesure" (figure 1, la fenêtre B).
   1. Effectuer une série de puissance laser pour chaque laser d'excitation et le fluorophore correspondant en solution, en commençant à ou près desaturant la puissance et la diminution de moitié pour chaque mesure. Changer la puissance du laser dans l'onglet "Configuration du système" de la fenêtre "Mesure" (figure 1, la fenêtre C). Appuyez sur le bouton "Démarrer" pour démarrer une mesure.
      NOTE: Inclure la puissance du laser pour les prochaines mesures de cellules dans la gamme inférieure (par exemple, mesurer à 16, puissance 8, 4 et 2 uW, avant l'objectif) ^20. les paramètres du laser du système sont en général plus élevée que l'excitation de sortie et peut varier largement en fonction du microscope et la qualité de l'alignement. Dans ce système, la gamme de puissance ci-dessus correspond à environ 60-500 uW des paramètres du système électrique. Il est conseillé d'utiliser un wattmètre pour mesurer la puissance de sortie avant l'objectif pour la première fois un nouveau microscope est utilisé. La puissance maximale actuelle du laser se trouve sous le bouton "Info" de la fenêtre "Mesure".
   2. Notez les chiffres par molecule (CPM, unité: kHz) à partir de chaque mesure de puissance laser.
   3. Si deux canaux de détection sont utilisées, vérifiez la fenêtre affichant la courbe d'autocorrélation de diaphonie. Utiliser une solution ne contenant que des fluorophores verts pour mesurer détecté autocorrélation FCS dans le canal de détection et une solution rouge avec seulement des fluorophores rouges pour évaluer la détection dans le canal de détection vert. En règle générale, garder le CPM détecté à partir du fluorophore "mauvais" en dessous de 5% du signal spécifique du fluorophore approprié.
   4. Vérifier que les valeurs échelle linéairement avec la puissance du laser utilisé. Saturation du CPM à la puissance du laser le plus élevé (c. -à- valeurs légèrement inférieures que prévu à partir d' une relation linéaire) est acceptable.
      NOTE: CPM devrait être bien au-dessus de 10 pour la puissance du laser le plus élevé pour presque tous les systèmes de microscope et fluorophores communs et peut être significativement plus élevé pour les systèmes sensibles. La première fois un anticorps fluorescent nouvellement conjugué est utilisé, effectuer unemesure FCS de l'anticorps diffusant librement en solution pour quantifier le CPM attendu. Avant la mesure, le manteau de la chambre de mesure avec 200 ul d'acide poly-L-lysine greffées avec du polyéthylène glycol (dilué à 0,5 mg / ml dans du PBS) pendant 1 heure à température ambiante. Retirer le liquide avec une pipette et permettre à la chambre à air sec. Enregistrer la solution mère dans le réfrigérateur (jusqu'à 2 semaines) et la poudre disponible dans le congélateur. Au microscope, on dilue l'anticorps à 1-10 ug / ml dans du PBS. Suivez les étapes 4,2-4,4 et 6,7 dans ce protocole. Si la surface est pas revêtue d'une solution anti-adhésive, les anticorps vont interagir avec la surface du verre et être appauvri rapidement à partir de la solution.

6. Mesures cellulaires

1. Ajouter 125 pi de cellules dans du PBS + 1% FCS de la suspension d'anticorps marqué cellule (étape 1.5) et 150 ul de milieu Roswell transparent Institut Memorial Park 1640 (RPMI) dans un puits d'une lame de lamelle 8 puits chambré. Leave les cellules dans l'obscurité à la température de mesure pendant au moins 20 min avant de commencer les mesures FCS.
   Remarque: il est de permettre aux cellules de se déposer et fixer sur le fond des puits et pour équilibrer les cellules et la solution à la température de mesure.
2. Dans la fenêtre "Scan Control" (figure 1, la fenêtre B), réglez le zoom 1 et commencer un balayage XY rapide en appuyant sur le bouton "XY rapide". Modifier la puissance du laser de sorte qu'il soit aussi faible que possible alors que les cellules sont toujours bien visibles. Centrer l'image sur une cellule ronde de luminosité moyenne, où la membrane est clairement définie et il n'y a pas de signal fluorescent dans le cytoplasme. Zoom jusqu'à ce que la cellule couvre la majeure partie de l'image.
3. Sélectionnez une nouvelle cellule si la cellule courante est en mouvement ou affiche vrilles, extrusions, ou des taches très lumineux. Garder le même zoom et la puissance du laser pour toutes les cellules capturées au cours de la même expérience.
   NOTE: Une membrane ébouriffé peut aussi être un signe de la prochaine apoptosis.
4. Mettre l'accent sur le dessus de la membrane cellulaire. Dans l'onglet "Acquisition" de la "mesure" fenêtre (Figure 1, la fenêtre C), sélectionnez une position pour la mesure FCS en activant "Crosshair." Sinon, sélectionnez l'onglet "LSM de l'image", marquer le point de mesure voulu dans l'image de LSM, et appuyez sur "Ajouter la position."
   REMARQUE: La partie supérieure de la membrane cellulaire ne sera pas influencée par les anticorps fluorescents des fluorophores ou non spécifiquement liés à la poly-L-lysine. Cependant, il est important de vérifier que la cellule ne se déplacent pas au cours de la mesure (voir les résultats).
5. Dans l'onglet "Acquisition" de la fenêtre "Mesure" (figure 1, la fenêtre C), définissez le nombre de répétitions à 6-10, avec le "temps de la mesure" fixé à 10 secondes par répétition.
6. Retour à l'onglet "Configuration du système" de la fenêtre "Mesure". Régler la puissance du laser pour la mesure FCS sous le "Lbouton aser ". Avant l'objectif, utiliser une faible puissance pour les mesures de cellules, dans l'intervalle entre 1 et 10 uW ^20.
   NOTE: Les valeurs recommandées sont un compromis entre la détection du signal et le photovieillissement aux cellules. Voir l'étape 5.2.1 Notez le pourcentage de la puissance du laser ces valeurs correspondent à.
7. Lancer une mesure FCS en appuyant sur "Démarrer" dans la "mesure" fenêtre (fenêtre C). Si les agents de blanchiment de la cellule de façon notable au début de la mesure, détectée par une chute de la courbe d'intensité de plus de 30% au cours des 10 premières secondes (un exemple est représenté sur la figure 3A, panneau inférieur), se déplacer vers une autre cellule et inférieure la puissance du laser pour les mesures futures.
   1. Si le signal est perdu, la mise au point dans la direction Z. Après la mesure est terminée, utilisez la fenêtre "Scan Control" (figure 1, la fenêtre B) pour vérifier que la cellule est toujours centrée et que la membrane cellulaire a été mesurée. Si ee cellulaire est déplacé, défaussez la mesure.
   2. Dans la fenêtre d' auto-corrélation où la mesure est affichée, supprimer manuellement les répétitions individuelles qui contiennent des manœuvres de zoom, de blanchiment, de grandes grappes, ou d' autres objets (voir les exemples dans la figure 3). Pour ce faire, en les marquant, clic droit, et en choisissant "Supprimer". Enregistrez le fichier final au format .fcs. Faites au moins quatre répétitions par cellule.
8. Le cas échéant, d'acquérir une image de la cellule à la section médiane (avec toute la circonférence de la membrane visible) en utilisant la fenêtre "Scan Control". Capturez l'image après la mesure FCS pour éviter le blanchiment. Appuyez sur le bouton "Single" pour lancer la capture d'image.
9. Si vous utilisez "Ajouter position" pour la mise au point de positionnement FCS, cliquez sur "Supprimer position" avant de passer à la cellule suivante.
10. Passez à une nouvelle aliquote de suspension cellulaire après un maximum de 2 heures de mesure pour maintenir les cellules throughou viablest l'expérience.

7. FCS Analyse

1. Ouvrez les fichiers .fcs dans un logiciel avec courbe capacité d' adaptation (voir Matériaux / Réactifs Table pour le logiciel utilisé dans ce protocole).
   REMARQUE: Le logiciel FCS qui vient avec le microscope est un bon endroit pour se familiariser avec montage de base, mais un logiciel supplémentaire est nécessaire pour adapter la diffusion en deux dimensions membrane.
2. Tout d'abord, déterminer la taille du volume d'excitation en analysant les mesures fluorophores libres. Mettre en place une courbe de diffusion libre en 3 dimensions aux courbes d'autocorrélation ^21.
   (Eq. 1)
   NOTE: Définition des paramètres: N: temps de corrélation, τ _D (taud): nombre d'entités fluorescentes dans le volume focal, τ (Tau) signifie le temps de séjour moyen dans le volume focal, T 1: probabilité pour que les fluorophores à être en l'état triplet, τ T: temps de relaxation pour les transitions d'état singulet-triplet, S: rapport de la hauteur à la largeur de diamètre pour le volume focal.
   1. Extrait Taud, le temps de transit pour les molécules à transférer le focus.
   2. Utiliser les coefficients de diffusion observées taud et publiées (D) de fluorophores utilisés pour le calibrage ^{18, 19} pour calculer le rayon sténopé (ω).
      (Eq. 2)
3. L' analyse des courbes d'auto - corrélation sur les membranes cellulaires.
   1. Pour visualiser la partie de la courbe représentant la diffusion moléculaire, sélectionnez le délai de départ avant la pente la plus raide de la courbe d'autocorrélation et se terminant après la courbe des convergences à 1 (par exemple, de 0,001 à 5 s pour les récepteurs de surface murins; voir la figure 4).
   2. Générer une courbe d'autocorrélation moyenne des répétitions individuelles enregistrées in étape 6.7.2.
   3. Mettre en place une courbe de diffusion de la membrane 2 dimensions pour chaque courbe d'autocorrélation en utilisant l' équation 3 ³ en moyenne.
      (Eq. 3)
      REMARQUE: les paramètres de sortie importants sont les suivants: N est le nombre moyen de molécules résidant dans la zone de membrane excité. Recalculer à la densité (N / um ^2). τ _D (taud): temps de séjour moyen dans le domaine d' intervention, limitée par la bi-dimensionnalité de la membrane (s). Recalculer le temps de séjour moyen d'un coefficient de diffusion ⁽² pm / sec) par le rayon déterminé sténopé (ω) et l' équation 2. T1 est la probabilité pour que les fluorophores soient dans l'état triplet. La luminosité (CPM) est calculé en divisant l'intensité globale moyenne de la mesure par N.
   4. Si un bon ajustement est pas atteint à la première tentative, changer les valeurs de départ et / ou les limites supérieures et inférieures pour les variables jusqu'à this est atteint.
      REMARQUE: Les limites supérieures inférieurs typiques pour les taux de diffusion de protéines dans les membranes cellulaires primaires sont 10-500 msec pour Taud, 0-100% pour les T1 et 0,1-5 msec pour TauT1. Sélectionnez des valeurs pour la mise en place à partir du milieu de ces intervalles. La partie de la courbe représentant les variations de fluorescence provenant de la diffusion est typiquement situé entre 1 ms et 1 s (voir figure 4). Selon le fluorophore, il peut parfois être un second processus actuel, qui donne lieu à autocorrélation à des échelles de temps plus courtes que le paramètre de diffusion. Ceci est causé par un état sombre transitoire (triplet) ou clignote (comme se produit souvent pour des protéines fluorescentes). Un état triplet est pris en compte dans l'équation 3, et le modèle présenté devrait donc également fournir un bon ajustement dans ces situations.

Résultats

Un résultat typique va générer une courbe d'auto-corrélation avec un temps de transit dans la plage de 10 ms à 400 ms pour les protéines de membrane. Le nombre de molécules peut varier entre 0,5 et environ 200 um par ² pour les protéines exprimées de manière endogène. Vérifiez soigneusement que le CPM est pas plus faible que prévu. Cela peut signifier qu'il ya une influence du signal d'arrière-plan. En règle générale, le signal de la RPC sur les cellules qui est accepté pour l...

Discussion

Ce protocole a pour FCS peut être utilisé pour l'évaluation de la dynamique moléculaire des molécules de surface sur tous les types de cellules immunitaires (murins, humains ou d'autres espèces). Mesures FCS dynamique moléculaire spatio-temporelles vers le bas à la résolution une seule molécule dans les cellules vivantes. La densité moléculaire, ainsi que la vitesse de diffusion et de regroupement dynamique des protéines d'intérêt, peuvent être extraits à partir des courbes d'auto-corrélation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
MACS NK Cell Isolation Kit souris II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	Sélection négative des cellules NK
Sérum de bovin fœtal	Sigma-Adlrich	F7524	Phosphate inactivé
Sérum salin tamponné	-	-	Fabriqué en maison  ;
Roswell Park Memorial Institute moyen 1640	PAA The Cell Culture Company  ;	E15-848	Fluide transparent
Clone d’anticorps 2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	Pour le blocage des récepteurs Fc.
Anticorps anti-Ly49A  ;			Anticorps monoclonal fabriqué en interne et conjugué en interne à l’anticorps anti-H-2Dd Alexa fluor 647
Clone JR9.318
.	BD Pharmingen	558915	Conjugué en interne à MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	Colorant fluorescent pour la conjugaison d’anticorps.
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P8920	Dilué dans de l’eau distillée (1.10)
Poly-L-Lysine (20 kDa) greffé avec du polyéthylène glycol (2 kDa)	SuSoS AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)	Dilué dans du PBS (pH 7,4) à 0,5 mg/ml.
Chlorure de rhodamine 110	Sigma-Aldrich	432202	Coefficient de diffusion connu : 3,3 × ; 10&minus ; 10 m2/s 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific  ;	A20006	Coefficient de diffusion connu : 4,4 × ; 10&moins ; 10 m2/s 20
microscope confocal  ;	Zeiss	LSM510
Logiciel : Confocor 3	Zeiss
: Matlab avec boîte à outils d’ajustement courbe	Version	R2013b
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermo-scientific  ;	155411	8 puits, fond borosilicaté 1,0