Article de méthode

Trois dimensions Super Resolution Microscopie de Filaments F-actine par interférométrique photoactive Localisation Microscopy (iPALM)

DOI :

10.3791/54774

⸱

1 décembre 2016

 , 
1Department of Biology, South University of Science and Technology of China, Shenzhen, 2Mechanobiology Institute, Singapore, 3Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore

Dans cet article

Résumé

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Nous présentons un protocole pour l'application de localisation interférométrique photoactive Microscopie (iPALM), une méthode nanoscope trois dimensions molécule unique de localisation, à l'imagerie du cytosquelette d'actine dans les cellules de mammifères adhérentes. Cette approche permet la visualisation à base de lumière des caractéristiques structurelles nanométriques qui autrement resteraient en suspens par microscopie optique à diffraction limitée classique.

Résumé

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La microscopie à fluorescence permet la visualisation directe de biomolécules spécifiques dans les cellules. Cependant, pour la microscopie par fluorescence classique, la résolution spatiale est limitée par la diffraction à ~ 200 nm dans le plan d'image et> 500 nm le long de l'axe optique. Par conséquent, la microscopie par fluorescence a longtemps été sévèrement limité à l'observation des caractéristiques ultrastructurales dans les cellules. Le développement récent des méthodes de microscopie super-résolution a surmonté cette limitation. En particulier, l'avènement de fluorophores photoswitchable permet de super résolution microscopie à base de localisation, ce qui fournit un pouvoir de résolution approcher l'échelle moléculaire longueur. Ici, nous décrivons l'application d'une méthode ultra tridimensionnelle résolution microscopie basée sur une seule molécule microscopie localisation et interférométrie polyphasique, appelé interférométrique photoactive Localisation Microscopie (iPALM). Cette méthode offre une résolution quasi isotrope sur laordre de 20 nm dans les trois dimensions. Des protocoles pour la visualisation du cytosquelette d'actine filamenteuse, y compris la préparation des échantillons et le fonctionnement de l'instrument iPALM, sont décrits ici. Ces protocoles sont également facilement adaptable et instructif pour l'étude d'autres caractéristiques ultrastructurales dans les cellules.

Introduction

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La visualisation des structures cellulaires complexes depuis longtemps partie intégrante de connaissances biologiques et de découverte. Bien que la microscopie de fluorescence peut imager des cellules ayant une spécificité moléculaire élevée, son pouvoir de résolution est limitée par la diffraction à ~ 200 nm dans le plan d'image (x, y ou dimension latérale), et> 500 nm le long de l'axe optique (z, ou dimension axiale) 1,2. Par conséquent, l'observation des caractéristiques ultrastructurales ont toujours été limitées à la microscopie électronique (EM). Heureusement, le développement récent de nanoscope a contourné cette limite, ce qui permet un....

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Protocole

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1. Préparation des échantillons d'imagerie

  1. Comme les signaux de fluorescence de fond interfèrent avec la fluorescence des étiquettes fluorophores, nettoyer les couvre - objets d'abord les rincer dans de l'eau déminéralisée (ddH 2 O), puis les séchage à l' air à l'air comprimé. Par la suite, effectuer une gravure par plasma dans un nettoyeur à plasma pendant 15 secondes, ou plus si nécessaire.
  2. Pour activer la correction de la dérive et de l'étalonnage iPALM, utilisez # 1.5 ronde (diamètre 22 mm) couvre-objets préalablement nettoyées embarqués avec des nanoparticules fluorescentes comme points repères qui servent ....

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Résultats

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exigences critiques pour iPALM sont l'alignement, l'enregistrement, et le calibrage des systèmes optiques. Ceux-ci sont nécessaires pour assurer une bonne interférence dans le 3-way diviseur de faisceau requis pour l'extraction coordonnée z. Pour permettre une surveillance continue, de sources ponctuelles constantes de fluorescence sont nécessaires. Ceci peut être réalisé en utilisant des nanoparticules fluorescentes Au ou bimétalliques 23 dont la photoluminescence provenir de.......

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Discussion

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Le système optique de iPALM est basé sur une conception à double objectif opposé 4-π, comme illustré sur la figure 1A. La configuration est construit en utilisant des pièces opto-mécaniques à la fois sur mesure usinées et commerciales, comme décrit plus haut 23 et énumérés dans le tableau 1. En plus de notre configuration, le Howard Hughes Medical Institute (HHMI) héberge un système qui est accessible à la communauté scientifique au Centre d'imagerie avan.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

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YW et PK remercient le soutien financier de la Fondation de recherche national de Singapour, décerné à PK (NRF-NRFF-2011-04 et NRF2012NRF-CRP001-084). Nous remercions également les laboratoires et de base de microscopie ouvertes installations MBI pour le soutien de l'infrastructure.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
table optiqueNewport, CARS4000iPALM, installée sur 4 Newport Stabilisateur
isolateur de vibrations Isolateur de vibrations pour table optiqueNewport, CAS-2000
laser-642Newport, CA1185055puissance de sortie=100 mw
laser-561Newport, CA1168931puissance de sortie=200 mw laser-488
Newport, CA1137970puissance de sortie = 200 mw
laser-405Newport, CA1142279puissance de sortie = 100 mw
miroirs diélectriques à large bandeThorlabs, NJBB1-E02combinateur laser
séparateur de faisceau dichroïqueSemrock, NYLM01-427-25
acousto-optique filtre accordableAA Opto-Electronic, FranceAOTF-vis-tn
Linéaire polariseurNewport, CA05LP-VIS-B
plaque de baselocal atelier
(22.5° ;)Reynard Corpporation, CApersonnalisé22.5° ; miroir
monturesoptiques New Focus, CA8816
platine de traduction XYZ motoriséeThorlabs, NJMT3 / M-Z6 porte-échantillon
T-Cube DC servomoteur contrôleurThorlabs, NJTDC001
Piezo Phase ShifterPhysik Instrumente, AllemagneS-303.CD
objectifNikon, JaponMRD01691. Apo TIRF 60X/1.49
étage de translation d’huileNew Focus, CA9062-COM-M
Pico Motor ActuatorNew Focus, CA8301
rotatif Solénoïde/ObturateurDACO Instruments, CT5423-458
Séparateur de faisceau 3 voiesRocky Mountain Instruments, COséparateur defaisceau
Piezo Z/Tip/Tilt scannerPhysik Instrumente, AllemagneS-316.10
aligneur inclinable cinq axes motoriséNew Focus, CA8081
Contrôleur ethernet PicmotorNew Focus, CA8752
Contrôleurs piézoélectriques/amplificateur/module de commande numériquePhysik Instrumente, AllemagneE-509/E-503/E-517
filtre passe-bandeSemrock, NYFF01-523/20
filtresfiltre passe-bandeSemrock, NYFF01-588/21
filtre passe-bandeSemrock, NYFF01-607/30
filtre passe-bandeSemrock, NYFF01-676/37
filtre coupe-bandeSemrock, NYNF01-405/488/561/635
roue à filtres motorisée avec controllterThorlabs, NJFW103H
EMCCDAndor, Royaume-UniDU-897U-CSO-#BV3 jeux
d’ordinateurs de bureau pour le contrôle des caméras et la synchronisation DellPrecision T3500PC, 4 jeux
de lamelles avec repèreHestzig, VA600-100AuF, préparation d’échantillons. repères avec différentes densités et spectres disponibles
fibronectineMillipore, MTFC010
paraformaldéhydeElectron Microscopy Sciences, PA15710fixation. 16 %
glutaraldéhydeMicroscopie électronique Sciences, PA1622025 %
triton X-100Sigma aldrich, MOT8787
HUVECcellules Life Technologies, CAC-015-10C
Medium 200Life Technologies, CAM-200-500
Facteursendothéliales des grands vaisseauxLife Technologies, CAA14608-01
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline14190367
Pennicilline/Streptomycine15140122
Trypsine/EDTALife Technologies, CA25200056
PIPESSigma aldrich, MOP1851PHEM
HEPES1ère base, MalaisieBIO-1825
EGTASigma aldrich, MOE3889
MgCl2Millipore, MT5985
Alexa Fluor 647 PhalloidinInvitrogen, CAA22287coloration
borohydrure de sodium (NaBH4)Sigma aldrich, MO480886extinction du
glucose1ère base, MalaisieBIO-1101tampon d’imagerie
glucose oxydaseSigma aldrich, MOG2133
catalaseSigma aldrich, MOC9322
cystéamineSigma aldrich, MO30070
EpoxyThorlabs, NJG14250
vaselineSigma aldrich, MO16415scellement
d’échantillon lanolineSigma aldrich, MOL7387
cire de paraffineSigma aldrich, MO327204
Huile d’immersionMicroscopie électronique Sciences, PA16915-04imagerie. Cargille Type HF
miroir tournant personnalisé motorisé objectifpersonnalisé

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
  2. Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super reso....

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Mots-clés

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