Article de méthode

Utilisant la technologie 3D Impression de fusion IRM avec histologie: Un protocole pour Brain Sectionnement

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DOI :

10.3791/54780

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6 décembre 2016

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1Translational Neuroradiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2Cerebral Microcirculation Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 3Viral Immunology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke

Dans cet article

Résumé

L'objectif global de ce protocole est d'aligner avec précision imagerie par résonance magnétique (IRM) des volumes d'image avec coupes histologiques par la création de supports de cerveau personnalisés 3D-imprimés et les boîtes de trancheuse.

Résumé

L’imagerie par résonance magnétique (IRM) permet de délimiter les tissus normaux et anormaux à une échelle macroscopique, en échantillonnant un volume tissulaire entier en trois dimensions. Bien que l’IRM soit un outil extrêmement sensible pour détecter les anomalies tissulaires, l’association des changements de signal avec un processus pathologique sous-jacent n’est généralement pas simple. Dans le système nerveux central, par exemple, l’inflammation, la démyélinisation, les lésions axonales, la gliose et la mort neuronale peuvent toutes induire des résultats similaires à l’IRM. En tant que tel, l’interprétation de l’IRM dépend du contexte, et la corrélation radiologique-histopathologique est donc de la plus haute importance. Malheureusement, la section pathologique traditionnelle du tissu cérébral est souvent imprécise et incohérente, ce qui complique la comparaison entre les coupes histologiques et l’IRM. Cet article présente une nouvelle méthodologie pour sectionner avec précision les tissus cérébraux des primates et permettre ainsi une correspondance précise entre l’histologie et l’IRM. Le protocole détaillé décrit dans cet article aidera les chercheurs à appliquer cette méthode, qui repose sur la création de trancheurs de cerveau imprimés en 3D. Légèrement modifié, il peut être facilement mis en œuvre pour les cerveaux d’autres espèces, y compris les humains.

Introduction

L’IRM in vivo fournit une mesure non invasive et sensible de l’intégrité tissulaire au niveau macroscopique. Les changements dans l’intensité du signal IRM observés in vivo sont des mesures de résultats dans de nombreux essais cliniques en cours. 1 Bien que les changements d’intensité observés par IRM puissent identifier des zones d’anomalie dans le contexte de l’ensemble du cerveau, ils ne sont souvent pas suffisamment spécifiques pour différencier les processus pathologiques. C’est particulièrement vrai pour les processus dynamiques impliquant de multiples pathologies. Par exemple, dans la sclérose en plaques (SEP) ou son modèle animal, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), l’inflammation, l’œdème, la dégradation de la myéline, la destruction axonale, la gliose et la mort neuronale se chevauchent. 2, 3 Pour obtenir la spécificité nécessaire concernant la pathologie sous-jacente, il faut tenir compte du contexte, ainsi que de la connaissance de l’histologie des tissus anormaux identifiés par IRM.

Cependant, même dans les expériences bien contrôlées sur des animaux, l’appariement de l’histologie avec l’IRM in vivo est fondamentalement difficile pour diverses raisons. Tout d’abord, la différence d’échelles dimensionnelles entre les coupes d’histologie et l’IRM est de plusieurs ordres de grandeur. 4 Deuxièmement, pour une comparaison correcte, l’orientation du plan de coupe de l’IRM doit correspondre au plan de coupe du tissu cérébral lorsqu’il est coupé. En raison de la forme du cerveau, il est très difficile de faire des coupes droites et précises lorsque le cerveau est assis sur une surface plane. Troisièmement, la grande taille du cerveau par rapport à une zone d’intérêt potentiellement petite (lésion, tumeur, etc.) crée un scénario d'« aiguille dans une botte de foin » pour le pathologiste qui traite le tissu. Quatrièmement, même lorsque le tissu cible est trouvé, il est généralement traité de telle manière qu’il est pratiquement impossible toute association avec les données IRM originales. Enfin, la section pathologique traditionnelle du tissu cérébral est souvent imprécise et incohérente, ce qui complique encore la comparaison entre les coupes histologiques et les images IRM.

Les tentatives précédentes pour surmonter ces défis reposaient sur l’utilisation d’algorithmes de déformation pour co-enregistrer les données et/ou le placement de marqueurs repères à l’intérieur ou autour du tissu comme référence. 5, 6, 7, 8 La première approche nécessite des modèles informatiques complexes qui sont particulièrement sensibles aux complications dues au formatage des données, aux artefacts d’imagerie et aux modifications causées par le traitement des tissus. 4 D’autre part, cette dernière approche introduit la possibilité de contaminer ou d’endommager d’une autre manière le tissu lui-même. 9

L’approche décrite ici améliore la transition entre les modalités grâce à l’utilisation de l’IRM post-mortem pour combler le fossé entre l’IRM in vivo et l’histologie. L’IRM post-mortem fournit des images tridimensionnelles (3D) du cerveau à une résolution plus élevée que celle obtenue in vivo et fournit en outre les données nécessaires à la production d’un modèle morphologiquement précis de la surface du cerveau. Ce modèle numérique peut ensuite être utilisé pour créer un support personnalisé imprimé en 3D pour le cerveau. Grâce à un positionnement soigneux, le support de cerveau permet une section cérébrale précise et orientée IRM, réduisant ainsi le besoin d’algorithmes mathématiques complexes, et permet de se concentrer sur des régions spécifiques pour un échantillonnage ciblé.

Notre laboratoire a récemment introduit de nouvelles méthodes pour créer des supports et des trancheurs de cerveau personnalisés à l’aide de l’IRM post-mortem et de la technologie d’impression 3D pour les cerveaux humains10 et de ouistitis. 4 Les deux méthodes permettent une corrélation plus précise entre l’IRM et l’histologie dans un cadre de recherche et, en fin de compte, permettent une compréhension plus approfondie de la pathologie spécifique sous-jacente aux anomalies de l’IRM. Des expériences soigneusement conçues, dans lesquelles le cerveau est échantillonné à plusieurs reprises au fil du temps in vivo, peuvent fournir un contexte pour l’interprétation de la pathologie, ce qui peut à son tour ajouter de la spécificité à l’interprétation de l’IRM. Ici, nous présentons un protocole modifié dans un cadre unifié qui peut être appliqué à n’importe quel tissu cérébral, qu’il provienne de primates non humains, de rongeurs ou d’humains. Nous fournissons des instructions détaillées, ainsi qu’une vidéo correspondante, pour le sectionnement des ouistitis. Bien que le protocole global s’applique à tout type de cerveau, en raison des différences dans l’acquisition de l’IRM et la taille des tissus, ainsi que des défis rencontrés lorsqu’il s’agit de types de cerveau spécifiques, il existe certaines différences dans l’approche en fonction du type de cerveau traité. Dans cette présentation, les sections avec « humain » indiqueront les différences de protocole spécifiques au cerveau humain.

Protocole

Toutes les manipulations et les procédures décrites ici animale ont été réalisées conformément à un protocole approuvé par l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies de protection des animaux et l'utilisation Comité. Les cerveaux ont été recueillies auprès de ouistitis communs (Callithrix jacchus) induites pour développer EAE. 11 Les cerveaux ont été stockés dans 10% de formaline pour entre 3 semaines et un an après l' euthanasie par perfusion transcardial de paraformaldéhyde 4%.

1. Postmortem IRM Préparation et Acquisition

  1. Ouistiti cerveau
    1. Préparer une station de travail avec une gaze de coton, un tube de centrifugeuse de 50 ml, de petites spatules, ~ 30 ml d'une huile fluorée, de la paraffine, et le cerveau ouistiti.
    2. Remplir le tube avec l'huile fluorée et de la gaze à la marque de 20 ml. Compresser la gaze pour éliminer les bulles d'air le long du chemin.
    3. formaline doucement à sec à partir de la surface du cerveau avec une serviette en papier. Insérer le cerveau avec le pôle frontal vers le bas deun tube. Fixez soigneusement le cerveau dans le tube en utilisant plus de gaze sur les côtés pour fixer sa position. Se reporter à la section supplémentaire 11 pour un procédé de création d'un cerveau berceau IRM pour la configuration des examens IRM supplémentaires.
    4. Remplissez le reste du tube avec de la gaze et de l'huile fluorée. Retirez soigneusement les bulles d'air le long du chemin. Fixer le bouchon et sceller le tube avec de la paraffine.
    5. Marquez le bouchon en ligne avec la fissure interhémisphérique. Envelopper le tube dans une serviette en papier et l'insérer dans la bobine avec la marque en haut au centre.
    6. Acquire 2D écho de spin T2. Les paramètres sont indiqués dans le tableau 1.
    7. Ouvrez les 10 anatomiques 150 microns acquisitions T2 weigted dans Mipav et inscrivez -vous pour la 6 ème acquisition.
      NOTE: L'inscription est un algorithme d'enregistrement de 3.5D automatique optimisé avec 9 degrés de liberté, fenêtré interpolation sinc, la fonction normalisée des coûts de corrélation croisée, avec l'appel de recherche de l'algorithme de Brent d'un Powell. Rotations ont été échantillonnés de +106; à -10 ° avec des rotations grossières incrémentation 5 degrés et rotations fines incrémentation 1 °. Ensuite, la moyenne des images enregistrées: Utilitaires, Image Calculatrice-Bulk images, moyenne.
  2. Cerveau humain
    1. Séparer le cerveau antérieur du tronc cérébral à l'aide d'une découpe au niveau du mésencéphale. 10 Les hémisphères peuvent également être séparés par une coupe en bas de la ligne médiane.
    2. Positionner le cerveau antérieur, dans un tube cylindrique d'un dôme hémisphérique à une extrémité et un bec à l'autre extrémité.
    3. Remplir le tube avec une huile fluorée à travers le bec. Retirer les bulles d'air par aspiration douce pour ~ 30 min à travers le bec.
    4. Acquérir 3D T1-MPRAGE. Les paramètres sont indiqués dans le tableau 1.

2. Extraire la surface du cerveau: Mipav 7.2

  1. Ouvrez l'IRM dans l'orientation coronale.
  2. Sélectionnez algorithmes, outils de transformation, Transform, Resample. Sélectionnez l'utilisateur taille définie et rééchantillonner à isotRopic voxels: 0,1 x 0,1 x 0,1 mm. Save the IRM rééchantillonnée comme Brain_MRI_Resampled. Human: Resample à isotrope voxels 0,3 x 0,3 x 0,3 mm.
  3. Sélectionnez Algorithmes, Filtres (spatial), la réduction du bruit non linéaire. Utilisez les paramètres par défaut, cliquez sur OK.
  4. Sélectionnez Affiche table de recherche et cliquez sur le bouton à double seuil. Faites glisser le curseur sur le graphique pour couvrir l'ensemble du cerveau.
  5. Sélectionnez Algorithmes, Segmentation, Seuil, Seuil en utilisant min / max. Entrez la valeur située dans le coin inférieur gauche du graphe d'intensité (juste en dessous de l'échelle) dans la case "Limite inférieure". Sélectionnez "binaire" dans le type d'image de sortie et décochez "seuil inverti."
  6. Sélectionnez Algorithmes, Morphologique, Remplir les trous. Vérifiez «Processus en 2.5D."
  7. Parce que cela est une IRM du cerveau complet, il y a un espace vide entre le rhombencéphale et le cortex qui doit être rempli. Le cerveau humain: sauter cette étape.
    1. Utilisation de la ligne VOI, dessiner dans une connexionentre le rhombencéphale et le cortex des deux côtés du cerveau au point le plus latéral du. Continuez ce à travers le cerveau.
    2. Sélectionnez la conversion VOI, VOI, Tout pour masque binaire. Sélectionnez Utilitaires, Calculatrice d'image. Sélectionnez OU dans le menu déroulant de l'opérateur et sélectionnez le masque du cerveau. Sélectionnez "Promouvoir le type de destination de l'image"
    3. Sélectionnez Algorithmes, Morphologique, Remplir les trous. Cochez la case "Processus en 2.5D"
  8. Enregistrez le masque binaire comme Brain_Model.nii.
  9. Sélectionnez Algorithmes, surface Extract (marching cubes). Sélectionner une image de masque, Enregistrer sous Brain_Model.ply.

3. Sélection Slice Emplacements: Mipav 7.2

  1. Identifier tissu d'intérêt ou de la position de départ. Calculer l'épaisseur de la dalle destinée. En ouistiti cerveau, comptant 30 tranches d'IRM par section, et 5 tranches d'IRM par écartement des lames, crée 3 sections mm avec des lacunes de lame 0,5 mm, ce qui entraîne ~ dalles de 3,5 mm. Le cerveau humain: 20 tranches IRM par section, et 4 IRM slglaces par écartement des lames, crée des sections de 6 mm avec des lacunes de lame 1,2 mm, ce qui entraîne ~ dalles de 7,2 mm.
  2. A l'endroit de la première fente de lame, cliquez sur "case VOI", puis dessiner une boîte sur le cerveau. Cliquez à l'intérieur de la boîte pour la sélectionner. Copiez et collez le contour pour chaque tranche d'IRM correspondant à l'écart de la lame.
  3. Sautez par le nombre de tranches d'IRM correspondant à l'épaisseur de la section et copier et coller le contour correspondant à l'écart de la lame suivante. Répétez ce processus à travers le cerveau.
  4. Sélectionnez VOI, Conversion VOI, Tout pour Masque binaire. Enregistrer sous Blade_Gaps.nii.
  5. Sélectionnez Algorithmes, extrait Surface (cubes de marche), l' image de masque, Blade_Gaps.ply.

4. Création d'IRM Lame Carte: Mipav 7.2

  1. Ouvrez le Brain_MRI_Resampled et les images Blade_Gaps.nii.
  2. Avec l'image Blade_Gaps.nii sélectionné, sélectionnez Utilitaires, Image Math. Sélectionnez Promouvoir type d'image et Multiply.Entrez 10.000 en tant que valeur.
  3. Sélectionnez Utilitaires, Calculatrice d'image. Sélectionnez Ajouter, puis sélectionnez l'image Brain_MRI_Resampled dans la zone d' image déroulante. Sélectionnez Promouvoir destination type d'image.
  4. Enregistrer l'image Brain_BladeMap.nii.
  5. En cliquant sur la vue TRIPLANAR, les endroits où le cerveau sera tranché peut être vu dans trois vues orthogonales.

5. Importation cerveau et lames Gap Surfaces: Netfabb Professional

  1. Sélectionnez Partie, Ajouter part. Choisissez les fichiers Brain_Model.ply et Blade_Gaps.ply
  2. Sélectionnez le cerveau et cliquez sur le mode de réparation. En mode de réparation:
    1. Cliquez sur le bouton de sélection de la coquille, puis cliquez sur le cerveau.
    2. Cliquez sur le bouton de sélection de bascule pour sélectionner les autres mailles. Cliquez sur Supprimer pour supprimer les autres mailles.
    3. Cliquez sur Appliquer réparation, et retirer la partie ancienne.
  3. Faites un clic droit sur le cerveau. Sélectionnez mouvement. Clique sur lePour bouton origine. Enregistrer les paramètres XYZ qui apparaissent. Ces paramètres de traduction sont nécessaires pour maintenir le positionnement de la lame mis en place en Mipav. Cliquez sur Traduire. Ensuite, fermez la fenêtre. (Ne cliquez traduire plus d'une fois. Il se traduira en utilisant à nouveau les mêmes paramètres.)
  4. Sélectionnez le modèle Blade_Gaps. Clic droit sur la partie, et sélectionnez Déplacer. Entrez les valeurs XYZ enregistrées précédemment dans les paramètres des boîtes XYZ. Maintenant, cliquez sur Traduire et fermer la fenêtre.
  5. Sélectionnez le modèle de Brain_Model et cliquez sur le mode de réparation. En mode de réparation:
    1. Cliquez sur le bouton de sélection de la coquille, puis cliquez sur le cerveau.
    2. Faites un clic droit et sélectionnez Triangles lisses. Entrez 4-5 itérations. Vérifiez Empêcher le volume rétrécissement. cerveau humain: 1-2 itérations.
    3. Clic droit, sélectionnez Réduire Triangles. Entrez 200000 dans le nombre cible de triangle et cliquez sur Exécuter.
    4. Cliquez sur la réparation automatique, par défaut de réparation. Cliquez ensuite sur Appliquer réparation
  6. Clic droit, Renommer. Renommez le cerveau lissée comme Smoothed_Brain_Model.
  7. Sélectionnez Smoothed_Brain_Model. Faites un clic droit, Export, STL.

6. Modification du cerveau Contours: Meshmixer

  1. Importez le Smoothed_Brain_Model en Meshmixer.
  2. Utilisez les outils de sculpture et de sélection pour faire des ajustements à la maille. Edits comprennent:
    1. Utiliser des outils Sculpting, robuste lisse. Lisser la zone correspondant à la ligne VOI. Le cerveau humain: sauter cette étape.
    2. Lisser la surface du cortex qui sera face vers le bas dans la boîte.
    3. Aplanir les petites mottes qui auraient pu être créés dans le processus de maillage et d'édition.
  3. Sélectionnez Analyse, inspecteur, réparation automatique tous.
  4. Exporter le Smoothed_Brain_Model comme Smoothed_Edited_Brain_Model.

7. Création de la Slicer Brain Box: Netfabb Professional

  1. Sélectionnez Partie, Ajouter Partie. Choisissez le file Smoothed_Edited_Brain_Model.
  2. Sélectionnez Partie, Ajouter Partie. Ensuite , sélectionnez le fichier STL cerveau Slicer Parts_Marmoset et cliquez sur Ouvrir. Cerveau humain: Brain Slicer Parts_Human (fichiers de code supplémentaires).
  3. Clic droit sur la partie, et sélectionnez Extended, Coquilles aux parties. Sélectionnez chaque partie individuellement et cliquez sur le droit de les renommer. (Cliquer sur l'œil à côté d'un objet cache ou rend visible.) Renommez la grande boîte principale, la petite boîte Sub, et la boîte de coupe Box_Cutout, l'Hexagone forme Blade_Holder_Main, la petite boîte plate Microtome Blade, et la demi Tube objet Cradle. Cerveau humain: pas Blade_Holder_Main, Microtome Blade, ou Cradle.
  4. Masquer Main, Sub, Blade, Blade_Holder_Main, Microtome Blade et Cradle et utiliser shift-sélection pour sélectionner tous les six et le Box_Cutout. Seul le Box_Cutout et Smoothed_Edited_Brain_Model doit être visible, mais le Smoothed_Edited_Brain_Model ne doit pas être sélectionné.
  5. Cliquez et faites glisser les pièces sélectionnées pour ajuster la position relative au cerveau de la boîte.
    1. Positionner le cerveau dans le centre de la boîte. Postion le cerveau assez profond dans la boîte à être étroitement serré, mais pas trop profond pour créer des surplombs qui empêchent un placement correct.
  6. Une fois positionnée, la boîte de cerveau contour peut être testé pour les surplombs. Sélectionnez le Box_Cutout et Smoothed_Edited_Brain_Model. Sélectionnez Opération booléenne.
    1. Cliquez sur le Smoothed_Edited_Brain_Model pour le transformer rouge.
    2. Sélectionnez booléenne Soustraction, et appliquer les calculs.
  7. Cochez la case du cerveau pour les surplombs qui empêcheraient le tissu cérébral d'être placé en toute sécurité dans la zone. Si ces surplombs sont présents, ajustez le cerveau de sorte qu'il est moins profond dans la boîte. Si le cerveau est à la profondeur et surplombs souhaitéesont présents, se reporter à la section complémentaire 10 pour une solution pour éliminer les surplombs.
  8. Sélectionnez le modèle Blade_Gaps. Faites un clic droit, sélectionnez Déplacer. Notez la valeur de Z de position, puis fermez la fenêtre. Ce sera la position de l'écart de la lame la plus postérieure.
  9. Sélectionnez la STL de la lame qui est venu du cerveau Pièces Slicer. Faites un clic droit, sélectionnez Déplacer.
    1. Sélectionnez la traduction absolue. Entrez la valeur de Z de la 7.8. Pour les valeurs X et Y, entrez la valeur correspondante dans les boîtes de paramètres de position actuels
  10. Sélectionnez la STL Blade. Clic droit, Cliquez sur Dupliquer.
    1. Vérifiez Disposez les pièces. Entrez le nombre total de lames dans le nombre total. Entrez le même numéro dans la zone de comptage Z. Entrez l'épaisseur de la dalle dans la fente de Z. Cliquez sur Dupliquer. Si l'épaisseur de la dalle a été modifiée, les lames doivent être positionnées individuellement. Dupliquer chaque nouvelle lame de la précédente (mouvement d'arrière en avant)avec le z gap égale à l'épaisseur de la section de cette section.
  11. Positionner les pièces Microtome lame à exactement les mêmes intervalles que les lames dans la trancheuse par étape 7.9 et 7.10 pour la lame de microtome répéter. Le cerveau humain: sauter cette étape.
    1. Sélectionnez Microtome lame le long de la partie Blade_Holder_Main et sélectionnez l' opération booléenne.
    2. Sélectionnez toutes les lames dans Microtome Lame de les mettre en évidence rouge. Cliquez sur booléenne Soustraction, et appliquer les calculs.
    3. Sélectionnez le mode de réparation. Effectuer une réparation prolongée. Sélectionnez appliquer la réparation, et retirer la partie ancienne.
    4. Renommez le Titulaire partie de la lame. Export de la partie en STL.
  12. Maj-select Smoothed_Edited_Brain_Model, tous les modèles Blade créés à l'étape précédente, et le Sous et Main. Cliquez sur opération booléenne.
    1. Faire toutes les pièces sauf le rouge principal en soiles lecte et en cliquant sur la flèche sous la boîte verte pour les déplacer au rouge.
    2. Sélectionnez booléenne Soustraction puis sélectionnez appliquer des calculs.
  13. Cliquez sur le mode de réparation. En mode de réparation:
    1. Cochez la case surplombs et pointes. Ceux-ci peuvent être lissés en Netfabb ou Meshmixer.
    2. Cliquez sur la réparation automatique, réparation prolongée. Ensuite, appliquez la réparation et enlever la partie ancienne
  14. Clic droit sur la zone du cerveau réparé et renommez - le cerveau Slicer Box. Exporter en tant STL.

8. Impression de la Slicer Brain Box sur le Ultimaker 2

  1. Ouistiti Cerveau: Cura
    1. Importez le Slicer Brain Box en Cura.
    2. Sélectionnez Rotation et faites glisser le cercle pour faire tourner la boîte de sorte qu'il est à plat sur le lit.
    3. Réglez les paramètres d'impression: Résolution de la couche de 0,1 mm, densité de remplissage de 50%, Raft.
    4. Sélectionnez Enregistrer outil Chemin d'accès à la carte SD. (Heure d'impression ~ 12 h.)
    5. Titulaire d' importation Lame enà Cura et le faire tourner de sorte que les fentes sont sur les côtés et la face de l'hexagone est dans le XZ ou YZ.
    6. Dupliquer l'objet.
    7. Réglez les paramètres d'impression: Résolution de la couche de 0,2 mm, densité de remplissage de 20%, Brim.
    8. Sélectionnez Enregistrer outil Chemin d'accès à la carte SD. (Temps d'impression ~ 3 h)
  2. Cerveau: Cura
    1. Importez le Slicer Brain Box en Cura et tourner comme dans 8.1.2.
    2. Réglez les paramètres d'impression: .2 résolution de la couche mm, la densité de remplissage de 30-35%, Raft.
    3. Sélectionnez Enregistrer la trajectoire d'outil sur la carte SD. (Heure d'impression ~ 70 h pour la boîte de l'hémisphère seul.)
  3. Sur la Ultimaker 2
    1. Appliquer une fine couche de colle bâton de colle pour construire la plaque.
    2. Insérez la carte SD. Sélectionnez l'impression et sélectionnez la partie.

9. Couper le cerveau

  1. Ouistiti cerveau
    1. Préparer une station de travail avec le cerveau fixe, le trancheur du cerveau, deux porte-lames, les lames de microtome, 1 ml d'huile fluorée, fpincettes lat, gants de protection, et des cassettes d'encastrement.
    2. Placez de nouvelles lames de microtome dans les fentes sur les porte-lames. Assurez-vous que le bord biseauté de chaque pale est confronté dans la même direction. Porter des gants de protection lors de la manipulation des lames de microtome.
    3. Retirer le cerveau de formaline et doucement sécher.
    4. Placez le cerveau dans la trancheuse. Quelques gouttes d'huile fluorée peuvent être appliqués au cerveau et trancheuse pour permettre un positionnement facile. Assurez-vous que le cerveau est fermement en place.
    5. Positionner les porte-lames avec les lames dans les fentes de lame correspondantes.
    6. Appuyez sur les porte-lames fermement et appliquer une pression de l'équilibre lent à couper à travers le cerveau.
    7. Retirer chaque plaque, une à la fois, en partant de l'avant du cerveau. Il aide à retirer la lame microtome en face d'une dalle avant de retirer la dalle elle-même. Portez une attention particulière à l'orientation antérieure / postérieure de chaque dalle.
    8. Prenez des photos de l'une antérieured surface postérieure de chaque dalle. Les dalles postérieures seront plus susceptibles de contenir des pièces séparées, donc attention à l'orientation des pièces pour l'enrobage. Placez chaque dalle dans une cassette enrobage et les mettre tous dans une solution de formol à 10%.
  2. Cerveau humain
    1. tester soigneusement l'ajustement du cerveau dans la boîte.
    2. Trancher le cerveau à partir d'une extrémité à l'aide d'une coupe en biais, lentement mais fermement trancher. Couper le cerveau à travers chaque fente de la lame.
    3. Retirez chaque dalle un à la fois, en accordant une attention particulière au nombre et antérieur / postérieure orientation de chaque dalle.
    4. Prenez des photos de la surface antérieure et postérieure de chaque dalle. Placer des plaques étanches à 10% de sacs de formaline. blocs de tissus seront découpées dans les dalles et placés dans des cassettes pour l'enrobage.

10. surplombs Retrait dans Brain Box (section supplémentaire)

  1. Tirer sur les tranches: Meshmixer
    1. Importez le Smoothed_Edited_Brain_Model.
    2. Sélectionnez Modifier, Faire des tranches. Dans les tranches de Marque:
      1. Sélectionnez Stacked 3D, Z, entrez l'épaisseur de 1-2 mm. Cliquez sur Calculer. Lorsque les tranches chargent, cliquez sur Accepter.
    3. Sélectionnez 1 ou 2 tranches avec de grands périmètres à proximité du fond du cortex. Ces tranches doivent être inférieures au niveau de la zone secondaire.
    4. Exporter chacune de ces tranches comme Brain_Slice_ #.
  2. Étendre les tranches jusqu'à retirer surplombs: Netfabb Professional
    1. Importez les Brain_Slice_ # tranches.
    2. Dupliquer chaque Brain_Slice_ # (organiser décochez parties si elle est cochée).
    3. Clic droit sur une copie de chaque Brain_Slice_ # et sélectionnez Echelle.
      1. Décochez rapport de mise à l'échelle fixe. Puis intensifier la tranche de cerveau selon la direction Y afin qu'il atteigne le niveau du fond de la boîte de Sub.
    4. Renommez le # de ces tranches.
    5. Vérifiez la position Y of le Brain_Slice_ original # en cliquant droit sur la partie et déplacer la sélection. Notez la position Y pour chacun des Brain_Slice_ # tranches originales.
    6. Effectuer le calcul: Brain_Slice_ # [Position y] - (Brain_Slice_Big_ # [taille y] - Brain_Slice _ # [size y])
    7. Sélectionnez chacun des Brain_Slice_Big_ # individuellement, clic droit et sélectionnez mouvement.
      1. Entrez la valeur calculée à partir de 10.2.6 dans la boîte de paramètre de translation Y. Pour les paramètres de X et de traduction de Z, entrez les valeurs situées dans les boîtes de paramètres de position actuels. Sélectionnez Absolute traduction. Cliquez sur Traduire et fermer la fenêtre.
        NOTE: Les tranches # Brain_Slice_Big_ seront soustraites avec le cerveau et les lames lors de la boîte.

11. Marmoset IRM cérébrale Cradle pour la numérisation supplémentaires

  1. Création du Cradle IRM du cerveau
    1. Assurez - vous que la surface supérieure de la Cradle est à la même hauteur que le Box_Cutout. La profondeur et la position du cerveau dans le berceau doit être configuré comme il est pour la trancheuse.
    2. Shift-sélectionner pour sélectionner le Smoothed_Edited_Brain_Model et Cradle.
    3. Sélectionnez opération booléenne. Sélectionnez le cerveau pour le mettre en surbrillance rouge, puis sélectionnez la soustraction booléenne. Ensuite, appliquez les calculs. (Sélectionnez également les Brain_Slice_Big_ # tranches le cas échéant.)
    4. Entrez en mode de réparation pour éliminer toutes les pointes dans le contour du berceau comme précédemment pour la trancheuse. Sélectionnez la réparation prolongée. Appliquer la réparation, et retirer la partie ancienne.
    5. Cliquez sur le bouton droit de renommer la partie IRM du cerveau Cradle. Sélectionnez Exporter, STL.
  2. Impression du berceau: Cura
    1. Importez le cerveau IRM Cradle en Cura et le faire tourner de telle sorte que la partie plate avec la découpe du cerveau est orientée vers le haut.
    2. Réglez les paramètres d'impression: Résolution de la couche de 0,1 mm, densité de remplissage de 100%, Raft.
    3. Sélectionnez Enregistrer trajectoire d'outil sur la carte SD. (Temps d'impression ~ 10 h)
    4. Imprimer sur le Ultimaker 2 comme décrit dans 8.3.
  3. L'acquisition de haute résolution T2 * IRM en utilisant le berceau
    1. formaline doucement à sec à partir de la surface du cerveau avec une serviette en papier.
    2. Positionner le cerveau dans le berceau comme décrit pour la trancheuse.
    3. Faites glisser le cerveau et le berceau dans le 50 ml tube de centrifugeuse. Remplissez à ras bord avec de l'huile fluorée.
    4. Appuyez doucement sur le tube pour permettre aux bulles d'air pour échapper au cerveau. Insérez le Cap Insérez dans l'encart du bouchon de tube pour empêcher les bulles d'air de se former là. Fixer le bouchon, et sceller le tube avec de la paraffine.
    5. Placer le tube dans la bobine comme décrit précédemment. 3D T2 * les paramètres sont donnés dans le tableau 1.
    6. Ouvrez les 18 anatomiques 100 microns T2 acquisitions * Pondéré en Mipav et inscrivez -vous pour la 10 ème acquisition. les paramètres d'enregistrement sont les mêmes que dans 1.1.7. La moyenne des images enregistrées: Utilities, image Calculatrice-Bulk images, moyenne.

Résultats

Le flux de travail de cette méthode est résumée dans la figure 1. Une fois que le cerveau est découpé en tranches, une comparaison visuelle entre les images IRM et images des surfaces superficielles des dalles montre un bon match d'orientation sur plusieurs dalles (Figure 2). Une fois que les plaques sont noyées dans de la paraffine, ils sont coupés au microtome et colorées. Une comparaison plus approfondie entre la haute résolution post-mortem IRM et les coupes histologiques colorées démontre une correspondance précise et cohérente à travers toutes les structures du cerveau ouistiti (Figure 3).

Dans ce modèle animal de la sclérose en plaques, les animaux développent des lésions de la substance blanche répartis dans la substance blanche cérébrale. Ces lésions peuvent être détectées de manière non invasive en effectuant l'IRM. La figure 4 démontre la capacité de cette technique à élucider le substrat pathologique des résultats de l'IRM. Les petites lésions détectées à l' IRM in vivo peutêtre suivis à la fois sur l'IRM post-mortem et de l'histologie. Comme on le voit dans les encarts, démyélinisation à l'intérieur des lésions est une des principales composantes d'entraînement du changement de signal RM (hypersignal en comparaison avec le tissu environnant). L'histologie et post - mortem IRM peut aussi présenter des lésions manquées sur IRM in vivo (Figure 4).

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Figure 1. Flux de travail pour la création d' une boîte de trancheuse ouistiti cerveau. Le cerveau est fixé au formol (A1) et une IRM pondérées en T2 sont acquises avec des voxels isotropes de 150 um par arête (A2). Les images sont traitées et seuillés pour créer un masque binaire (A3). La surface est ensuite rendue dans le logiciel de modélisation 3D (A4). Une soustraction Booléenne entre un modèle de trancheuse et le modèle de cerveau crée un modèle numérique de la trancheuse du cerveau (B1). La boîte de trancheuse du cerveau est imprimé sur une imprimante 3D (B2). Le cerveau est alors placé fermement dans la boîte de trancheuse pourcoupe (B3). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. De gauche à droite: In vivo IRM, post - mortem IRM, et la photographie de la dalle de tissu. Avions Tranchage ont été établies sur la base de l'IRM post - mortem (B) et par rapport à la correspondante in vivo IRM tranche (A) visuellement. Le cerveau est alors coupé et les plaques résultantes ont été jugées cohérentes (C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3. haute résolution post - mortem IRM et l' histologiesection correspondante. Dalles ont été inclus dans la paraffine, coupés avec un microtome en 4 sections um et colorées avec le bleu et le violet de crésyl rapide (B). Les sections ont ensuite été visuellement en correspondance avec le T2 * 100 um weighted IRM basée sur les structures du cerveau (A). Détails pour l'acquisition de cette image sont dans la section supplémentaire du protocole et le tableau 1. Les structures du cerveau: (1) flèche rouge = capsule interne, flèche bleue = commissure antérieure; (2) flèche rouge = putamen, flèche bleue = tractus optique; (3) flèche rouge = caudé, flèche bleue = hippocampe; (4) flèche rouge = corps calleux, flèche bleue = aqueduc cérébral; (5) flèche rouge = colliculus inférieur, flèche bleue = faisceau pyramidal. La boîte en pointillés B1 indique une tranche où, que ce soit lors de la coupe du cerveau ou de la paraffine plongement, une erreur a provoqué une légère rotation autour de l'axe Y, conduisant à décalage de la commissure antérieure sur la gauche. S'il vous plaît cliquer ici pour voir uneune plus grande version de ce chiffre.

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Figure 4. Suivi des lésions de l' IRM in vivo à la section de l' histologie. L'IRM in vivo en a montré aucune preuve convaincante de signal hypersignal anormal de suggérer des lésions dans les deux voies optiques (A1). Cependant, l'IRM haute résolution post-mortem montre hyper intenses lignes claires dans les deux voies optiques (A2). Le jeûne bleu / violet de crésyl tache d'une section de 4 pm histologie montre que les zones hyperintenses visibles sur l'ex vivo IRM sont démyélinisation (A3). Dans la substance blanche cérébrale, l'IRM in vivo montre hyperintensité subtile bilatéralement (B1, élargie dans les encadrés). Les zones hyperintenses sont plus évidentes sur la haute résolution post-mortem IRM (B2). La tache LFB d'une section 4 um d'histologie montre que ces zones sont de démyélinisation (B3). Après comparaison avec la ligne de base in vivo IRM et une tache hématoxyline-et-éosine, le côté droit a été déterminé à être une anomalie anatomique, pas une lésion démyélinisée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Fichiers de code supplémentaires. Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl: S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier. Brain_Slicer_Parts_Human.stl: S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier. Cap_Insert.stl: S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le protocole décrit ici permet une comparaison précise entre IRM et coupes histologiques. Le protocole est présenté dans un format unifié qui peut être appliqué sur des cerveaux humains ou de petits animaux, tels que les ouistitis ou les rongeurs. Les différences spécifiques à la grande (humaine) et petits (primate non humain et les rongeurs) cerveaux sont mis en évidence, et dans la vidéo et les figures d'accompagnement, nous démontrons l'application dans le ouistiti. Bien que la méthode est simple, le procédé nécessite de nombreuses étapes, ainsi que l'utilisation de plusieurs types de logiciels. En outre, plusieurs questions touchant potentiellement la précision de cette méthode sont importants à mentionner.

La qualité de l'IRM in vivo d'image est un facteur important. Pour réduire au minimum la disparité dans la résolution d'image entre les images IRM et histologiques digitalisés, la plus petite taille possible IRM voxel doit être utilisé. Ce concept est également valable pour la qualité de l'IRM post-mortem d'image. Alors que l'augmentationtemps d'acquisition en IRM post-mortem permet beaucoup plus haute résolution d'image, la préparation peut introduire des artefacts d'image tels que les pertes de signal focaux liés à des bulles d'air. Ces artefacts peuvent masquer les zones du tissu ainsi que affecter son contour. Par ailleurs, les dimensions du tissu à l'IRM post-mortem sont susceptibles d'être affectées par le processus de fixation et la durée. Alors que le in vivo ex vivo IRM match peut être étroitement approchée en utilisant des repères anatomiques dans la configuration de la géométrie de coupe lors de l' acquisition, un enregistrement non linéaire serait encore nécessaire pour atteindre un plus haut degré de précision dans ces deux images correspondant à l' IRM.

La conception du porte-cerveau et trancheuse est aussi une étape cruciale. Lors de la création du modèle numérique du cerveau, un algorithme de lissage est appliqué, qui élargit légèrement le modèle par rapport à la tête fixe. Ceci permet une insertion facile du cerveau dans son support et trancheuse et réduit les arêtes vives dans le support &le contour; # 39. Cependant, si le modèle est trop grand (par exemple plus de 5%), le cerveau peut se déplacer au cours de l'IRM post-mortem et / ou le sectionnement. Un autre point important est d'adapter la conception du modèle de cerveau de sorte que le cervelet est correctement placé à l'intérieur de l'objet 3D imprimé. Cela peut être particulièrement difficile lorsque le cervelet a été endommagé lors de l'extraction du cerveau à l'autopsie.

Lors de l'impression du trancheur du cerveau et le support, le type d'imprimante 3D doit également être choisi avec soin. Certaines imprimantes à jets multiples nécessitent un post-traitement à l'aide d'un four pour éliminer le matériau de support. Bien que ces imprimantes peuvent produire des objets qui sont étanches à l'eau et relativement plus durable que bureau fusionné modélisation de dépôt imprimantes (FDM), le processus de chauffage pour éliminer les supports peuvent légèrement déformer la boîte, ce qui crée des lacunes de la lame qui ne sont pas parfaitement perpendiculaire au contour du cerveau.

Le processus du cerveau sectionnant est une autre étape cruciale. Avant ème coupee cerveau entier en plaques, il est important de faire en sorte que le cerveau est assis bien à l'intérieur du trancheuse du cerveau: il devrait y avoir aucun mouvement quand une légère pression est appliquée sur le cerveau. Ainsi, il sera possible pour les lames pour couper à travers le cerveau à l'endroit précis fixé par les enquêteurs. Une pression équilibrée continue devrait être appliqué aux deux supports de lame lors de la coupe. En fonction du tranchant des lames et de la rigidité du tissu, un léger mouvement de coupe transversale pourrait être avantageux pour l'entretien de surfaces planes découpées.

Le procédé de paraffine-enrobage peut également être une source de défaut d'alignement entre l'IRM et l'histologie. Si la dalle de tissu ne siège plat contre la cassette pendant le processus d'incorporation, il y aura une inclinaison entre le plan de coupe du microtome et la place de la dalle de surface. Il faudra couper des sections inutilisables pour trouver une surface plane dans laquelle tout le tissu est exposé. Une façon de corriger l'inclinaisonest en changeant l'angle du plan d'observation sur le post-mortem IRM haute isotrope résolution. Toutefois, cela est presque impossible à réaliser sur l'IRM in vivo dans qui est généralement acquise à la résolution anisotrope (typiquement des coupes coronales d'épaisseur).

Finalement, le tissu peut subir une certaine déformation au cours de la période de fixation au formol et inclusion dans la paraffine (retrait), ainsi que lors de la préparation des lames (pliage, des fissures, des rides). Certaines de ces déformations peut être corrigée en mettant les sections 4-5 um dans un bain d'eau avant de les transférer sur des lames. D'autres déformations peuvent être partiellement résolus en effectuant l'image déformable coregistration des images numérisées histologiques aux images IRM post-mortem. Néanmoins, en minimisant les déformations à la pratique attentive et qualifiée est l'approche la plus efficace pour correspondre volumes IRM à histologie sections.

En conclusion, la méthodologie introduite ici permet investigators pour évaluer avec précision la pathologie sous-jacente des résultats de l'IRM. Plus généralement, il est une approche prometteuse pour l'identification et / ou la validation de nouveaux biomarqueurs d'IRM pour les études de recherche qui ciblent les processus pathologiques spécifiques, tels que l'inflammation ou la remyélinisation.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Le programme de recherche intra-muros du NINDS a soutenu cette étude. Nous remercions l’installation d’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle des NIH. Nous remercions Jennifer Lefeuvre et Cecil Chern-Chyi Yen pour leur aide dans l’acquisition de l’IRM post-mortem. Nous remercions John Ostuni et la Section de l’instrumentation pour leur aide avec l’impression 3D. La figure 1 de ce travail a utilisé des instantanés de MeshLab, un outil développé avec le soutien du projet 3D-CoForm.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
7T/30cm USR AVIII Bruker MRIBruker Biospin
38 mm Bruker Biospin bobine volumiqueBruker Biospin
FomblinSolvay Solexis
50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylène, StérileCorning21008-951
Fisherbrand Éponges de gazeFisher Scientrific13-761-52
Parafilm M Film de laboratoire polyvalentBemis
Leica RM2235 microtome rotatif  ;Leica
Leica Lames jetables, profil bas (819)Leica
Cresyl Violet Acétate, 0,1 %Microscopie26089-01
Luxol Fast Blue, 0,1 % dans 95 % d’alcoolMicroscopie électronique Sciences26056-15
ETOH
Ultimaker 2 Extended  ;Ultimaker.75
kg Officiel Ultimaker de marque PLA  ; Filament, 2,85 mm, Argent métalliséUltimaker
Axio Observer.Z1Zeiss
Zen 2 (Blue Edition)Zeiss
Netfabb Professional 5.0.1Netfabbhttp://www.netfabb.com/professional.php
Meshmixer 10.9.332Autodeskhttp://www.meshmixer.com/download.html
Mipav 7.2NIH CIThttp://mipav.cit.nih.edu
CuraUltimakerhttps://ultimaker.com/en/products/cura-software
électronique aqueuse Sciences

Références

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Mots-clés

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