Une méthode alternative et Validé Injection pour l'accès à l'espace sous-rétinien via Une approche transclérale Postérieur

Summary

Les injections sous-rétiniennes sont la technique la plus courante pour administrer de grands agents thérapeutiques tels que des protéines et des vecteurs viraux aux photorécepteurs et à l’épithélium pigmentaire rétinien. Une méthode alternative chez la souris qui cible avec succès l’espace sous-rétinien avec des dommages collatéraux minimaux et des temps de récupération rapides est décrite ici.

Abstract

injections sous-rétiniens ont été utilisées avec succès chez les humains et les rongeurs pour fournir des interventions thérapeutiques des protéines, des agents viraux et les cellules du interphotorécepteur / compartiment sous-rétinien qui a une exposition directe à photorécepteurs et l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR). injections sous-rétiniens de plasminogène ainsi que des essais précliniques et cliniques récentes ont démontré la sécurité et / ou l'efficacité de la prestation des vecteurs viraux et des cellules souches à des personnes ayant une maladie rétinienne avancé. Des modèles murins de maladie de la rétine, en particulier héréditaire de la rétine dystrophies, sont essentielles pour tester ces thérapies. La procédure d'injection la plus courante chez les rongeurs est d'utiliser petite transcornéenne ou incisions transclérale avec une approche antérieure à la rétine. Avec cette approche, l'aiguille d'injection pénètre dans la rétine neurosensorielle perturber le RPE sous-jacente et à l'insertion peut facilement nick la lentille, ce qui provoque l'opacification du cristallin et la dépréciation des imagi non invasiveng. Accès à l'espace sous-rétinien via un transclérale, approche postérieure évite ces problèmes: l'aiguille traverse la sclérotique environ 0,5 mm du nerf optique, sans pénétration de la rétine et évite de perturber le vitré. Les dommages collatéraux est limitée à celle associée à la sclérotomie focale et les effets d'un transitoire, décollement de la rétine séreux. La simplicité de la méthode minimise des lésions oculaires, assure réapplication de la rétine rapide et la récupération, et a un faible taux d'échec. Le minimum de dommages à la rétine et RPE permet une évaluation précise de l'efficacité et les effets directs des agents thérapeutiques eux-mêmes. Ce manuscrit décrit une nouvelle technique d'injection sous-rétinienne qui peut être utilisé pour cibler des vecteurs viraux, des agents pharmacologiques, les cellules souches ou de cellules souches pluripotentes induites (iPS) à l'espace sous-rétinien chez des souris avec une grande efficacité, un minimum de dommages, et une récupération rapide.

Introduction

Injections sous - rétiniens sont les principaux moyens de délivrer des agents cellulaires et viraux aux rétines de souris pour étudier leurs effets sur les photorécepteurs et l'EPR sous - jacente ^1,2. La plupart des protocoles d'injection sous - rétinienne chez les souris utilisent un transcornéen ou d' un site d'injection transclérale antérieure à l'équateur (figure 1). Cette approche peut entraîner des dommages collatéraux inhérents qui comprend entailler et opacification résultante de la lentille, la perturbation de l'intégrité du corps vitré, la pénétration de la rétine neurosensorielle et de l' iris, hémorragie rétinienne, décollement de la rétine substantielles et durables œdème sous - rétinien ^3-9. Les manipulations expérimentales doivent surmonter ces effets afin d'évaluer les effets des interventions thérapeutiques ^3,7,10,11. Cette étude fournit une description détaillée et validation d'une méthode d'injection transclérale postérieure qui évite ces complications, minimise les traumatismes et a un taux de réussite élevé de cibler le sousl'espace de la rétine.

Injections ciblant l'espace sous - rétinien chez les souris sont souvent très difficiles à réaliser et la plupart des chercheurs se heurtent à une fréquence élevée de tentatives infructueuses dans lequel le vecteur est livré à un emplacement incorrect ou il y a des lésions rétiniennes importantes, par exemple dans un décollement de la rétine complète ^6. Le nombre d'yeux exclus de l'analyse en raison de complications d'injection est généralement pas signalé dans les études de la souris, mais dans notre propre expérience et en discussion avec d'autres chercheurs, le nombre d'injections échoué peut être aussi élevé que 50% et varier en fonction de l'expérience et capacités de l'enquêteur qui effectue les injections. Le succès de l'injection est généralement évaluée par imagerie rétinienne directe et / ou tomographie par cohérence optique (OCT) ^7,9. Une méthode facile à maîtriser avec des taux de réussite élevés pour les injections sous-rétiniens chez les souris peut accélérer l'expérimentation et de réduire le coût des études précliniques de treatments pour les maladies rétiniennes qui sont les principales causes de cécité aux Etats-Unis.

Le postérieur, transclérale technique d'injection sous - rétinien décrite ici est une adaptation de protocoles cliniques et précliniques ^9,12. Les évaluations diagnostiques non invasives réalisées chez des souris injectées démontrent des dommages doux et très localisée et manquent de lentille supplémentaire de garantie, d'une blessure rétinienne et RPE. En outre, avec relativement peu de pratique, un expérimentateur peut atteindre ces résultats avec un taux de réussite élevé (80 - 90% ou plus), réduisant ainsi les coûts associés à ces études. Cette procédure peut être utilisée pour délivrer des interventions thérapeutiques cellulaires, virales ou pharmacologiques à photorécepteurs et / ou EPR dans des études précliniques et d'évaluer facilement les interventions expérimentales.

Protocol

Animaux: de type sauvage souris C57BL / 6J élevés à l'Université de Californie à Los Angeles (UCLA). Tous les animaux étaient âgés de 11 - de 17 semaines et inclus souris mâles et femelles. Toutes les souris étaient groupe logé, maintenu dans un cycle d' obscurité 12h12 lumière / avec de la nourriture et de l' eau ad libitum. Toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec les directives institutionnelles de l'UCLA et de l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie Déclaration pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research.

NOTE: Tous les médicaments et les agents injectables sont United States Pharmacopeia (USP).

1. Préparation chirurgicale

1. Anesthésier la souris avec une injection intrapéritonéale de 100 mg / kg de kétamine et de 8 mg / kg de xylazine dans un mélange de solution saline. L'anesthésie à une profondeur telle que la souris n'a pas de pincement de l'orteil ou des réflexes de contact de la cornée.
2. Maintenir la température du corps à 37,0 ° C avec un tampon d'eau en circulation.
3. Dilater élèves avec 2,5% phényléphrine oeil drops et tailler les moustaches pour faciliter la visualisation. Moustaches fournissent l'entrée sensorielle significative à la souris, donc, moustache rognage devrait enlever seulement la partie qui bloque l'accès clair à l'œil, et non à la base du cheveu. Dans notre expérience, les souris montrent la récupération normale après cette procédure. Appliquer des gouttes oculaires méthylcellulose pour prévenir la sécheresse et minimiser anesthésiants cataracte transitoire induit ^13.
4. Stériliser les instruments avant la chirurgie ( par exemple, la bétadine et de l' éthanol ou de perles chaudes).
5. Préparer fluorescéine dilué (0,01% en utilisant une solution saline à 0,9%) dans un environnement stérile (c. -à- biosécurité armoire) si la visualisation sera effectuée (voir la section 3 ci - dessous).

2. Injection Préparation du site

1. Préparer une seringue (par exemple, 5 pi de seringue) avec le volume approprié d'injection (par exemple, de 0,3 à 1,0 pi).
2. Placez la souris afin que l'œil est orienté vers le haut et clairement visible dans le dissecting microscope.
3. Pincez doucement la conjonctive temporelle avec pince fine à bout. Faire une incision circonférentielle d'environ 90 degrés à l'aide des ciseaux Vannas incurvées.
4. Répétez l'étape 2.3 avec la capsule de Tenon sous-jacente.
5. Réséquer le tissu conjonctif environnant avec pince fine à bout tout en faisant tourner le globe par voie nasale. Travailler vers le site d'injection d'environ 0,5 mm temporelle du nerf optique. Utilisez un grand soin pour éviter de perturber le sinus rétro-orbital.

3. sclérotomie et sous-rétinienne Injection

NOTE: Il est recommandé que l'injection de 0,01% de fluorescéine dans 0,9% Saline être utilisé pour aider à la visualisation, tout en apprenant cette procédure. La répartition topographique de la fluorescéine peut être efficacement documenté avec l'imagerie rétinienne (voir la section 4 ci-dessous).

1. Faire une petite incision scléral sur le site d'injection en grattant doucement l'œilleton avec une lame ophtalmique 22,5 degrés. Cette shou incisionld seulement être suffisamment grand pour permettre à la pointe de l'aiguille de passer à travers la sclérotique.
2. Insérez le 33 aiguille G biseauté (angle 5 -. 10 ° dans le sclérotomie avec le biseau orienté et incliné parallèlement à la rétine Injecter volume désiré (par exemple, 0,3 à 1,0 pi de 0,01% fluorescéine à des fins d'apprentissage).
   NOTE: maintenir la stérilité de la seringue en nettoyant soigneusement avec des lavages successifs d'un solvant approprié et de l'eau déminéralisée avant chaque injection.
3. Enfoncer le piston lentement (~ 3 sec) sans bouger l'aiguille et avec une pression.
   REMARQUE: Lorsque l'aiguille est dans l'espace sous-rétinien, une légère résistance se fera sentir tout en appuyant sur le piston. Il n'y aura pas de résistance minimale si l'aiguille perce la rétine, et une résistance élevée si l'aiguille ne pénètre pas la sclérotique ou RPE.
4. Attendez quelques secondes avant de retirer l'aiguille pour minimiser le reflux.
5. Rincer l'oeil avec une solution saline stérile tamponnée et veiller à l'oeil hcomme tourné dans sa position normale.

4. Évaluation du décollement de la rétine par PTOM et Fundus Imaging

1. Effectuer l'imagerie octobre immédiatement après l'injection pour évaluer la qualité de l'injection et au moment approprié pointe post-injection nécessaire pour évaluer la structure de la rétine.
   NOTE: Des exemples de l'utilisation de l' OCT dans des études similaires ont été décrits précédemment ^7,14.
   1. Ajuster et aligner l'image OPO pour cibler le site d'injection. Le site d'injection doit être la ligne médiane et 0,5 mm temporelle à la tête du nerf optique. Répéter au besoin si le détachement est hors du cadre ou non de manière optimale centrée.
2. Visualisez décollement de la rétine et le colorant zone d'injection avec en face fundus imagerie ^7,14.
   NOTE: Si un système d'imagerie OCT pas disponible, l'injection d'une petite quantité de fluorescéine avec un vecteur pour la pratique permettra la visualisation avec tout appareil photo rétinienne qui effectue fluorescéine angioGraphie en utilisant les mêmes longueurs d'onde d'excitation et de filtres de blocage. zones localisées de l'hyper-fluorescence apparaîtront sous la vascularisation et la vascularisation auront des limites nettes et distinctes si l'espace sous-rétinien est ciblée correctement. Le bord de la bulle à partir de l'injection sera délimité par le passage de l'hyper- à fluorescence hypo. Plusieurs instruments offrent cette possibilité pour la souris; l'instrumentation utilisée ici est décrit ailleurs ^14.

Soins 5. post-opératoire

1. Appliquer une couche épaisse de crème ophtalmique antibiotique triple à la surface de la cornée de l'œil injecté.
2. Placez la souris dans des cages propres solitaires pour la récupération. Ne pas combiner les souris qui ont subi une chirurgie jusqu'à ce qu'ils soient complètement rétablis.
3. Surveiller la respiration et de la température lors de la récupération d'anesthésie. Surveiller les animaux jusqu'à ce qu'ils puissent maintenir décubitus sternale.
4. Effectuer le suivi post-opératoire appropriée supplémentaireet le traitement, y compris une injection sous-cutanée de carprofène (5 mg / kg) pour le traitement de la douleur post-chirurgicale.

6. Évaluation de la fonction rétinienne par Électrorétinographie (ERG)

1. Effectuer une analyse ERG pré-injection et à des moments appropriés post-injection nécessaire pour évaluer la fonction rétinienne. Si l'injection a été faite dans l'espace sous-rétinien, le décollement de la rétine devrait résoudre dans les 72 heures.
   1. Utiliser des techniques ERG standard pour évaluer la fonction rétinienne avant et après l' injection comme décrit précédemment ^14,15.

7. Reconstruction 3D et Bleb Volume Quantification

NOTE: octobre balayages avec un contraste élevé englobant tout le détachement dans le cadre de vue sont optimales pour l'utilisation. ImageJ / Fidji ^17,18 et Imaris ont été utilisés, mais d' autres logiciels peuvent être utilisés.

1. Export de la b-scan d'intérêt, l'importation à ImageJ / Fidji et culture (Image> Crop) la partie de la sc octobreun à modéliser en utilisant l'outil de sélection rectangulaire.
   1. Réglez le contraste (Image> Réglages> Luminosité / Contraste) et de délimiter des frontières manquantes en reliant deux sections avec une ligne.
   2. Tracer une ligne droite avec le (changement de portefeuille) outil de ligne qui enjambe la RPE à la couche des photorécepteurs. Mesure (Analyse> Mesure) la longueur de la ligne pour obtenir la taille de détachement maximale pour l'étape 7.8.
2. Importation recadrée cadres au logiciel 3D-reconstruction (voir le tableau des matériaux) en utilisant le "RVB à Gray" plug-in et MATLAB Compiler Runtime.
3. Définissez la taille de voxel (sous Propriétés de l'image) en utilisant les paramètres d'étalonnage de l'analyse OCT (x, y, z).
4. Exécuter le plugin "RGB Gray" (sous Propriétés de l'image), avec une pondération égale à chaque canal, pour créer un quatrième canal. Supprimer les canaux Rouge-Vert-Bleu d'origine.
5. Inversez le canal gris en utilisant le changement de contraste. Magasin Image.
6. Cliquez sur le "ajouter unsurface de ew "bouton dans l'onglet Vue 3D, et commencer le processus de 4 étapes guidée de la création de la surface.
   1. Réglez le niveau de détail de surface (étape 1 de 4).
      NOTE: Dans notre expérience à 12,0 était 8,0 la gamme la plus efficace.
   2. Définissez la taille maximale de la sphère (sous Sélection de base) à un peu moins que la taille de détachement maximale mesurée en 7.1.2. Créer la surface et défaire une inversion de canal gris (étape 2 de 4).
   3. Fixer le seuil à la valeur maximale de sorte que la surface des espaces négatifs à l'extérieur de la rétine et le détachement ne viennent pas en contact (étape 3 de 4).
   4. Définissez le type de filtre pour le nombre de voxels et isoler l'espace négatif dans le site de détachement par taille. Terminez la surface (étape 4 de 4).
      NOTE: Le volume de la surface de décollement est situé sous le volume dans l'onglet des statistiques.

Results

Des injections sous-rétiniennes Postérieur approche transclérale ont été effectuées sur 31 des yeux sains de 16 souris de type sauvage avec des injections de 0,3 pi (n = 18), 0,5 pi (n = 8) et 1,0 pi (n = 5), 0,01% de fluorescéine. Un œil a été exclu de l'injection en raison d'une opacification de la cornée préexistante qui empêchait une analyse structurelle et fonctionnelle. Chaque oeil injecté est inclus dans le présent rapport. Aucun décollement de la rétine non désirées, les crevaiso...

Discussion

injections sous-rétiniens sont la méthode de choix pour la fourniture de vecteurs viraux et de la tige thérapie dérivée des cellules pour manipuler les photorécepteurs et l'EPR dans la recherche fondamentale et le traitement clinique. Chez les patients, des injections sous-rétiniennes sont typiquement réalisées avec une sclérotomie antérieure à la pars plana, une vitrectomie postérieure de base et de pénétration de la rétine par l'aiguille avec la visualisation directe. Comme avec la plupart des procédures de vi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hamilton Modèle 62 RN SYR	Hamilton	87942	Seringue x 1
Aiguille Hamilton 33 G, 1.0", 20 DEG, point 3 (acier inoxydable 304)	Hamilton	7803-05	Aiguilles x 6
Ciseaux courbes Vannas	Ted Pella, INC.	1347	Lame de 5 mm
Couteau de microchirurgie à 22,5 degrés	Wilson Ophthalmic Corp.	91204
Ketaject  ;	Phoenix	NDC 57319-609-02	Kétamine
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	Xylazine
Fluorescéine 10 % AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10	100 mg/ml
0,9 % Saline USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	0,9 % NaCl
Pommade antibiotique	Akorn	NDC 17478-235-35	Eau ophtalmique
Pompe de circulation	Gaymar	TP-500 T/Pump  ;	Réf. 07999-000
sd-OCT	Bioptigen	R-Series	Commercial
Caméra de fond d’œil	Phoenix Research Laboratories	MICRON III
Pince à épiler Type 3	Ted Pella, INC.	5385-3SU
2,5 % phényléphrine	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15	Ophtalmic
IMARIS8	Bitplane		Version 8.1.2
ImageJ	NIH		V1.8.0_77
Hypromellose  ; 2.5 %	Goniovisc	AX0401
Gouttes ophtalmiques en méthylcellulose (rinçage)	Bausch &	Microscope à solution saline
	Zeiss	Stemi 2000	Microscope
lumineuse	Fostec	P/N 20520	Source lumineuse