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Article de méthode

Une plate-forme de dosages anti-biofilm Adaptés à l'exploration des bibliothèques de composés naturels

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⸱

DOI :

10.3791/54829

⸱

27 décembre 2016

 ,  , 
1Pharmaceutical Design and Discovery (PharmDD), Faculty of Pharmacy, University of Helsinki

Dans cet article

Résumé

Les infections à biofilm montrent une tolérance élevée à la chimiothérapie. Aucun test unique ne permet de saisir la complexité des biofilms. Au lieu de cela, des tests complémentaires sont nécessaires. Nous présentons une plateforme de criblage (développée pour S. aureus) qui combine des tests de viabilité, de biomasse et de matrice de biofilm. Il permet la découverte de médicaments anti-biofilm, y compris l’évaluation des effets chimiothérapeutiques à long terme.

Résumé

Les biofilms sont considérés comme l'un des sujets les plus difficiles de la biomédecine moderne, et ils sont potentiellement responsables de plus de 80% des infections aux antibiotiques tolérantes. Les biofilms ont fait preuve d'une tolérance exceptionnelle pour la chimiothérapie, qui est considérée comme multifactorielle. Par exemple, la matrice constitue une barrière physique qui diminue la pénétration des antibiotiques dans le biofilm. En outre, les cellules au sein des biofilms sont phénotypiquement diverses. Probablement, biofilm résilience résulte d'une combinaison de ceux-ci et d'autres mécanismes, encore inconnus,. Tous les antibiotiques actuellement existants ont été mis au point contre les cellules-simples (planctoniques) bactéries. Par conséquent, jusqu'à présent, un répertoire très limité de molécules existe qui peut agir sélectivement sur les biofilms matures. Cette situation a entraîné un changement de paradigme progressiste dans la découverte de médicaments, dans laquelle rechercher les anti-biofilms a été invité à occuper une place plus importante. Un défi supplémentaire est qu'il yanombre de méthodes normalisées pour la recherche de biofilm, en particulier ceux qui peuvent être utilisés pour le criblage à grande débit de banques chimiques très limitée. Ici, une plate-forme anti-biofilm expérimentale pour le dépistage chimique est présenté. Coloration de la N - acétyl-glucosamine poly- PNAG base WGA-fluorescence , il utilise trois essais pour mesurer biofilm viabilité (avec résazurine coloration), la biomasse totale (avec coloration au cristal violet) et la matrice du film biologique ( en utilisant une agglutinine de germe de blé, , fraction). Tous les dosages ont été développés en utilisant Staphylococcus aureus que les bactéries du modèle. Des exemples de la façon dont la plate-forme peut être utilisée pour le criblage primaire, ainsi que pour la caractérisation fonctionnelle des résultats anti-biofilm identifiés sont présentés. Cette séquence expérimentale permet en outre la classification des résultats sur la base des points finaux mesurés. Il fournit également des informations sur leur mode d'action, en particulier sur le long terme par rapport aux effets chimiothérapeutiques à court terme. Par conséquent, il est très avantageous pour l'identification rapide des composés à succès de haute qualité qui peuvent servir de point de départ pour diverses applications biomédicales.

Introduction

Les bactéries peuvent basculer entre les deux modes de vie très différents, planctoniques et sessiles, dont un biofilm est l'exemple le plus commun. En biofilms, les bactéries forment des communautés structurées noyées dans une matrice auto-produit 1. Cette matrice auto-produit est une barrière entre les bactéries et leur environnement extérieur, et il protège les cellules microbiennes, en les gardant à proximité. La composition de la matrice du biofilm varie entre et au sein même espèce, mais il est principalement constitué d'un réseau serré de lipopolysaccharides, de l'ADN extracellulaire, et des protéines. La matrice sert de barrière physique , l' inhibition de l'entrée d'agents nocifs, mais protège également le biofilm de la déshydratation et empêche les nutriments de fuite de la cellule 2.

Les biofilms sont considérés comme l' un des sujets les plus difficiles de la biomédecine moderne, et ils sont prétendument responsables de plus de 80% des infections aux antibiotiques tolérantes 3. Ils DISPétablir une tolérance intrinsèquement élevée contre les menaces extérieures: l' humidité, la pression osmotique, stress mécanique 4, chaleur, rayonnement UV 5, désinfectants, agents antimicrobiens, et le système immunitaire de l' hôte 1. Par exemple, la concentration en agent antimicrobien requis nécessaire pour tuer un biofilm a été montré que jusqu'à 1000 fois plus élevée par rapport à celle requise pour tuer les bactéries planctoniques. L'explication de cette plus grande tolérance semble être multifactorielle. La matrice constitue une barrière physique qui diminue la pénétration des antibiotiques dans le biofilm. En outre, les cellules au sein des biofilms sont phénotypiquement divers; leur transition entre les différents états métaboliques dus à un gradient existant de l' oxygène, des substances nutritives et des métabolites entre les parties intérieure et extérieure du biofilm 6. Par conséquent, dans certaines régions du biofilm, comme le noyau, les bactéries sont privées d'oxygène et de nutriments et vivent dans un métaboliquement moins actif ou un état complètement dormantes 7. Les cellules complètement inactives sont désignées comme cellules persister, et ils ne sont pas sensibles aux traitements antibiotiques conventionnels 8. Par conséquent, il est probable que la résistance biofilm résulte d'une combinaison des mécanismes actuellement proposés et d'autres, encore inconnus. Staphylococcus spp. sont encore parmi les bactéries les gram-positives les plus problématiques, ce qui provoque de graves, souvent liés à biofilm, les infections 4. Il est suggéré que jusqu'à 99% de toutes les bactéries sont associées au sein de biofilms, ce qui rend la vie bactérienne prédominante 3. Cependant, tous les antibiotiques actuellement existants ont été développés contre une seule cellule (planctoniques) bactéries. Jusqu'à présent, un répertoire très limité de molécules existe qui peut sélectivement agir sur les biofilms matures. Cette situation a entraîné un changement de paradigme progressiste dans la découverte de médicaments, dans laquelle rechercher les anti-biofilms a été invité à occuper une place plus importante.

D'un méthodologperspective ical, des défis supplémentaires existent, car seul un nombre limité de méthodes de biofilm ont été développés par des organisations de normalisation, en particulier celles qui sont applicables au criblage à haut débit de banques chimiques. Tous les tests standardisés (avec une seule exception) sont basées sur des réacteurs biofilm, et ces méthodes nécessitent d' importants volumes de travail et de grandes quantités de composés à tester, qui sont généralement indisponibles pendant la phase d' investigation précoce 9-12. Le dosage de criblage standard applicable seulement existant est le soi-disant dispositif de Calgary biofilm, à partir de laquelle le système disponible dans le commerce de concentration de l' élimination du biofilm minimale (MBEC) est développé 13-15. Cependant, la limitation de ce test est que les biofilms sont cultivées sur des piquets, et non pas toutes les espèces bactériennes ou même des souches de la même espèce sont capables de former des biofilms sur cet appareil. En outre, les méthodes qui peuvent être particulièrement appliqués à l'exploration de composés naturels sontnécessaire. Les produits naturels ont été la principale source d'innovation dans la découverte de médicaments antimicrobiens au cours du siècle 16. Ils peuvent fournir des composés anti-biofilm nouveaux avec des mécanismes d'action uniques qui peuvent aussi être efficaces contre les cellules Persister. Ainsi, l'exploration des bibliothèques naturelles et d'inspiration naturelle a de fortes chances de produire des pistes anti-biofilm prometteurs et uniques.

Ici, nous présentons les détails expérimentaux d'une plate - forme d'essais qui a été développé pour le criblage chimique des composés anti-biofilm utilisant trois essais pour mesurer les effets sur la viabilité, la biomasse totale, et de la matrice de biofilms Staphylococcus aureus. Le premier essai mesure biofilm viabilité et elle est basée sur la coloration résazurine. La résazurine est un colorant d'oxydo-réduction qui est bleu et non fluorescent dans son état oxydé et se transforme en rose de la résorufine, fortement fluorescent lorsqu'il est réduit par l'activité métabolique des bactéries. Il est un m très simple et rapideéthode appropriée pour des projections primaires 17-20. Le deuxième essai, sur la base de coloration au cristal violet, mesure la masse de biofilm totale. Le cristal violet est une tache largement utilisée pour étudier les bactéries et les bactéries dans les biofilms 19,21-23. L'essai est basé sur des réactifs peu coûteux et a une lecture simple absorbance final. Enfin, le troisième test cible la substance polymérique extracellulaire (EPS) -MATRIX du biofilm au moyen d' agglutinine de germe de blé (WGA), qui se lie spécifiquement au poly- résidus de N - acétyl-glucosamine (PNAG) présents dans la matrice du biofilm 24 staphylocoques. WGA est conjugué à un fluorophore qui peut être détectée en utilisant des lecteurs d'intensité de fluorescence 25. Nous présentons ici les raisons et les détails de la plate-forme que nous avons développé, y compris des exemples d'applications.

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Protocole

1. Faire croître les bactéries

  1. Pré-culture les bactéries durant la nuit dans un bouillon de soja tryptique (TSB) à 37 ° C avec 220 rpm agitation (16-18 h).
  2. Diluer la pré-culture 100-1,000 fois ( en fonction du taux des bactéries de croissance; ici, 1000 fois est utilisé pour S. aureus) dans l' eau douce du BST et de le laisser grandir à 37 ° C et 200 tours par minute pour atteindre une croissance exponentielle (optique densité à 595 nm (DO 595) entre 0,2 et 0,6).
    REMARQUE: Cette étape nécessite une optimisation spécifique à la souche.

2. Formation biofilm: pré et post-exposition

  1. Diluer la culture cultivés de manière exponentielle à 100 fois (ce qui équivaut à environ 10 6 unités formant des colonies par millilitre (UFC / ml)).
  2. Protocole pré-exposition
    1. Pour les échantillons témoins non traités, ajouter 200 pl de la culture bactérienne diluée dans chaque puits d'une plaque à 96 micropuits stérile.
    2. Ajouter 4 ul d'un composé d'essai ou un contrôleantibiotique (50x solution mère) et 196 ul de la culture bactérienne diluée par puits.
    3. Incuber à 37 ° C sur un agitateur de plaques à 200 tpm pendant 18 heures.
      Note: Ici, nous utilisons un shaker avec une orbite de 2 mm.
  3. Protocole post-exposition
    1. Pour tous les échantillons, ajouter 200 pl de la culture bactérienne diluée dans chaque puits d'une plaque à 96 micropuits stérile.
    2. Incuber à 37 ° C sur un agitateur de plaques à 200 tpm pendant 18 heures.
      Note: Ici, nous utilisons un shaker avec une orbite de 2 mm.
    3. Retirer la solution planctonique attentivement tout, sans toucher le biofilm, à l'aide d'une pipette multicanaux.
    4. Ajouter 4 ul d'un composé d'essai ou un antibiotique de commande (50x solution mère) et 196 pi de TSB par puits.
    5. Incuber à 37 ° C sur un agitateur de plaques à 200 tpm pendant 24 une heure supplémentaire.
      Note: Ici, nous utilisons un shaker avec une orbite de 2 mm.

3. résazurine Coloration Protocol pour l'évaluation de la viabilité des biofilms

  1. Préparer une solution mère de 0,1 mg / ml de résazurine (0,4 mM) dans du PBS stérile. Gardez ce stock stérile, à l'abri de l'exposition lumineuse, et à 4 ° C.
  2. Diluer la résazurine actions à 1:50 dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) pour obtenir une concentration finale de 20 uM.
  3. Transférer la totalité de la solution planctoniques (en laissant les biofilms dans les puits) avec précaution, sans toucher les biofilms ou la création de bulles d'air, à une plaque de 96 puits séparée, propre à l'aide d'une pipette multicanaux.
  4. Laver les biofilms une fois avec du PBS stérile en ajoutant 200 pi par puits, et retirez-le soigneusement à l'aide d'une pipette multicanaux.
  5. Ajouter 200 ul de la résazurine dilué par puits de la plaque à biofilm en utilisant une pipette à canaux multiples.
  6. Incuber dans l'obscurité, à la température ambiante (RT), et 200 tours par minute, agitation pendant environ 20 min jusqu'à ce que les contrôles de biofilm non traitées sont uniformément rose.
  7. Mesurer la fluorescence àλ exc = 560 nm et λ em = 590 nm avec un lecteur de plaque ( en haut de lecture).

Protocole de coloration 4. Cristal Violet pour la biomasse Quantification des biofilms En utilisant la même plaque comme à l'étape 3

  1. Retirez la tache de résazurine soigneusement des puits à l'aide d'une pipette multicanaux.
  2. Fixer les biofilms avec 200 pi de methanol pendant 15 min.
  3. Laissez la plaque sécher à l'air pendant 10 minutes.
  4. Ajouter 190 ul de 0,02% (volume / volume, dilué dans de l'eau déminéralisée), une solution de cristal violet, soigneusement à l'aide d'une pipette multicanaux. Évitez de toucher les côtés des puits avec la tache tout en pipetage et empêcher la formation de bulles d'air en ne pressant la pipette pour terminer soufflage.
  5. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
  6. Enlever la tache soigneusement, à l'aide d'une pipette multicanaux.
  7. Laver deux fois avec de l'eau déminéralisée (200 pi à chaque fois).
  8. Laissez les puits sécher pendant 5 min à température ambiante et se dissolvent la tache restantedans 96% d'éthanol ou d'acide acétique à 33%.
  9. Incuber pendant 1 heure à température ambiante et de lire l'absorbance à 595 nm.

5. L'évaluation de l'effet bactéricide sur les bactéries planctoniques Utilisation de la plaque de l'échantillon même que pour les biofilms

  1. Mesurer la turbidité à 595 nm de la plaque avec la solution de 3,3 planctonique.
  2. Colorer les bactéries planctoniques avec résazurine en ajoutant 10 pi de la résazurine stocks par puits. Bien mélanger par pipetage.
  3. Incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant environ 5 min, jusqu'à ce que les témoins non traités sont uniformément rose.
  4. Mesurer la fluorescence à λ exc = 560 nm et λ em = 590 nm.

6. Germe de blé agglutinine Coloration pour Matrix Quantification et Fluorescence Microscopy Imaging des biofilms

  1. Matrice de quantification
    1. Préparer une solution de la sonde WGA dans du PBS stérile / ml 5 pg.
    2. Utilisez un échantillon parallèle plaTe pour cette coloration. Retirer la solution planctoniques des puits et laver une fois avec PBS stérile (200 pi par puits), en utilisant soigneusement une pipette multicanaux sans toucher les biofilms.
    3. Ajouter 200 pi de solution WGA par puits à colorer.
    4. Incuber dans l'obscurité à 4 ° C pendant 2 heures.
    5. Enlever la tache non lié en lavant les puits avec 200 ul de PBS trois fois.
    6. Laissez la plaque sécher pendant 15 min à température ambiante.
    7. Dissoudre la tache liée dans l'acide acétique à 33%, en utilisant 200 pi par puits.
    8. Sceller les puits avec des bouchons de bande et sonication les utilisant un sonicateur à bain d'eau pendant 30 secondes à la température ambiante et 40 kHz.
    9. Incuber la plaque pendant 1 heure à température ambiante.
    10. Répétez l'étape de sonication. Les puits peuvent rester étanche entre les étapes de sonication.
    11. Mesurer la fluorescence à λ ex = 495 nm et λ em = 520 nm avec un lecteur de plaque ( en haut de lecture).
  2. Visualiser la matrice avecLa microscopie à fluorescence
    1. Utilisez le même protocole que ci-dessus jusqu'à l'étape 6.1.6.
    2. Après l'étape de séchage, de visualiser les échantillons avec un microscope à fluorescence, en utilisant un filtre FITC (ou un autre filtre d'excitation vert approprié).

7. Coloration cellules viables et mortes dans le biofilms pour l'imagerie avec Fluorescence Microscopy et Quantification du signal pour le ratio vert au rouge (G / R)

  1. L' imagerie par microscopie à fluorescence
    1. Préparer une solution de chaque sonde (cellules viables d'une coloration et les autres cellules mortes une coloration), selon les directives du fabricant.
    2. Retirer la solution planctoniques des puits et laver une fois avec du PBS stérile (200 pi par puits) à l'aide d'une pipette multicanaux.
    3. Ajouter 6 ul de la solution de coloration par puits.
    4. Incuber la plaque dans l'obscurité pendant 15 min.
    5. Avant la microscopie, éliminer le liquide en excès manually à l'aide d'une pipette multicanaux.
    6. Capturer les images en utilisant un microscope à fluorescence, en utilisant par exemple un filtre FITC (fluorescence verte, de cellules viables) ou un filtre TRITC (fluorescence rouge des cellules mortes).
  2. Quantification du signal en vert à fluorescence rouge rapport (G / R)
    1. Suivez le même protocole que dans les étapes 7.1.1 et 7.1.2.
    2. Ajouter 200 ul de la solution de coloration par puits et incuber pendant 15 minutes dans l'obscurité.
    3. Mesurer la fluorescence avec un lecteur de plaques à excitation des longueurs d'onde / d'émission 485/535 nm et 485/635 pour la fluorescence verte et rouge, respectivement (lecture supérieure).

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Résultats

Dans la plate-forme proposée, les effets sur la viabilité, la biomasse et de la matrice du biofilm sont quantifiés. Dans la séquence de travail (figure 1), une plaque d'échantillon est coloré avec résazurine et ensuite avec du cristal violet pour évaluer simultanément les effets sur la viabilité des bactéries de biofilm et sur la biomasse totale du biofilm. Les deux tests peuvent être réalisés consécutivement dans la même plaque , car il a été démontré précédemment qu'un...

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Discussion

Il n'y a pas de méthode unique qui peut simultanément mesurer l'effet d'un composé sur la viabilité, la biomasse, et de la matrice de biofilm. Par conséquent, il est nécessaire de combiner des tests pour détecter un effet sur les trois points d'extrémité, de préférence à une étape de criblage primaire.

La résazurine est un protocole de coloration très simple ne comportant que de l'addition de la sonde redox. Cependant, l'établissement du temps d'incubation optimal...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient le professeur Paul Cos et LMPH, Université d'Anvers, en Belgique pour son soutien au cours du processus de tournage dans son laboratoire. Ce travail a été financé par l'Académie des projets Finlande (projets 272266 et 282981) et Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finlande. Les contributions techniques du MSc Janni Kujala sont reconnus.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
ResazurinSigma AldrichR7017
Crystal violetSigma AldrichHT90132  ;
Agglutinine de germe de blé, conjugué Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificW11261
LIVE/DEAD BacLight  ;Sondes moléculairesL7012SYTO 9 pour la coloration des cellules viables en vert et iodure de propidium pour la coloration des cellules mortes rouge
Phosphate Saline
Tryptone agar de sojaLab M, NeogenLAB011
Tryptine Bouillon de sojaLab M, NeogenLAB004
F96 Plaque de puits Polystyrène Stérile Transparent Fond platThermo Fisher Scientific161093
MARQUE : Capuchons, bandes de 8Sigma AldrichBR781413-300EA
Branson série CPX bain à ultrasonsSigma AldrichZ769428-1EA
MultipipetteThermo Fisher Scientific
Distributeur MultidropThermo Fisher Scientific
Biomek 3000Beckman Coulter
Varioskan Flash Lecteur multiplaquesThermo Fisher Scientific
Staphylococcus aureusATCC  ;Référence 25923

Références

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