β la mort cellulaire précède le développement du diabète de type 1, et la détection de ce processus peut permettre une intervention thérapeutique précoce. Nous fournissons ici une description détaillée de la façon de mesurer les espèces d’ADN INS méthylées de manière différentielle dans le sérum humain en tant que biomarqueur de la mort cellulaire β.
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Dans cet article
Résumé
Résumé
La mort des cellules des îlots β est censée être à l’origine de la pathogenèse de pratiquement toutes les formes de diabète et précéder le développement de l’hyperglycémie franche, en particulier dans le diabète de type 1. La mise au point de biomarqueurs sensibles et fiables de la mort cellulaire β peut permettre une intervention thérapeutique précoce pour prévenir ou retarder le développement du diabète. Récemment, plusieurs groupes, dont le nôtre, ont rapporté que l’ADN acellulaire et méthylé différentiellement codant pour la préproinsuline (INS) dans la circulation est corrélé à la mort cellulaire β dans le prédiabète de type 1 et le diabète de type 1 d’apparition récente. Ici, nous présentons un protocole étape par étape utilisant la PCR numérique pour la mesure de l’ADN INS acellulaire qui est méthylé de manière différentielle à la cytosine à la position -69 pb (par rapport au site de départ transcriptionnel). Nous démontrons que le test peut faire la distinction entre la cytosine méthylée et non méthylée à la position -69 pb, qu’il est linéaire sur plusieurs ordres de grandeur, qu’il fournit une quantification absolue du nombre de copies d’ADN et qu’il peut être appliqué à des échantillons de sérum humain provenant d’individus atteints de diabète de type 1 d’apparition récente et de témoins sans maladie. Le protocole décrit ici peut être adapté à n’importe quelle espèce d’ADN pour laquelle la détection de cytosines méthylées différentiellement est souhaitée, que ce soit à partir de la circulation ou de cellules et de tissus isolés, et peut fournir une quantification absolue des fragments d’ADN.
Introduction
Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto - immune qui se caractérise par la destruction des îlots de Langerhans productrices d'insuline par les cellules β des cellules T autoréactives 1. Le diagnostic de DT1 est généralement faite sur mesure (glycémie> 200 mg / dl) de l'hyperglycémie chez un jeune individu maigre, qui pourrait présenter une acidocétose comme preuve d'une carence en insuline. Au moment du diagnostic de diabète de type 1, il existe des preuves pour une perte substantielle de la fonction des cellules β et la masse (50-90%) 2. Dans les études cliniques, plusieurs médicaments modulateurs immunitaires qui ont été instituées au moment du diagnostic ont donné lieu à la stabilisation de la fonction des cellules β (et probablement de masse), mais aucune n'a abouti à une rémission clinique de la maladie, une constatation qui a soulevé l'appel pour le développement de biomarqueurs pour la détection précoce de la maladie et pour le suivi longitudinal de l' efficacité de la combinaison des thérapies 3,4. Les efforts déployés par des consortiums internationaux, une telleest le Consortium Réseau de recherche sur l' îlot humain au National Institutes of Heath 5, ont souligné la nécessité de développer des biomarqueurs qui mettent l' accent sur le stress cellulaire β et la mort dans le DT1.
Conformément à ces efforts, notre groupe et d' autres ont récemment mis au point des tests de biomarqueurs qui mesurent en circulation, des fragments d'ADN épigénétique modifiés qui découlent principalement de la mort des cellules ß 6-9. Dans tous les essais publiés à ce jour, l'accent a été mis sur la quantification du gène humain codant pour la préproinsuline (INS), ce qui démontre un plus grand degré de sites CpG non méthylés dans les régions codantes et du promoteur par rapport à d' autres types de cellules. La libération de fragments d' ADN non méthylé INS a émis l' hypothèse que découlant principalement de la mort (nécrotiques, apoptotiques) cellules ß. Nos études récentes ont montré que chez les jeunes, les élévations de l'ADN non méthylé INS à la fois et méthylé en position -69 pb ( par rapport à til transcriptionnelle site de départ) ont été observés dans la nouvelle apparition du DT1, et ensemble a servi en tant que biomarqueurs spécifiques pour cette population 6. Ces dosages de marqueurs biologiques impliquent l'isolement de l'ADN acellulaire de sérum ou de plasma en utilisant des kits commerciaux de rotation, suivie d'une conversion au bisulfite de l'ADN isolé (pour convertir les cytosines non méthylées à uraciles, en laissant intact cytosines méthylées).
Dans ce rapport, nous décrivons les aspects techniques de la collecte des échantillons de sérum, l' isolement de l' ADN sans cellules à partir de sérum, conversion au bisulfite, et les performances des gouttelettes PCR numérique (désormais, PCR numérique) pour l' ADN méthylé INS différentiellement.
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Protocole
Énoncé d’éthique : Les protocoles ont été approuvés par le comité d’examen institutionnel de l’Université de l’Indiana. Les parents des sujets ont fourni un consentement éclairé écrit, et les enfants de plus de 7 ans ont donné leur consentement à leur participation.
1. Traitement du sérum
REMARQUE : Le test décrit a été rigoureusement testé en utilisant du sérum humain isolé comme suit.
- Prélever le sang dans un tube de prélèvement sanguin rouge (sans additif, non enrobé).
- Laisser reposer à température ambiante pendant 30 minutes pour permettre au caillot de se former.
- Tube de centrifugation à 2 000 x g pendant 10 min à température ambiante. Transférez le surnageant (sérum) dans un nouveau tube destiné à l’entreposage du sérum (tubes à vis en polypropylène, dont la taille dépend des échantillons).
- Conservez les échantillons à -80 ºC jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’isolement de l’ADN.
2. Extraction de l’ADN sérique
REMARQUE : L'ADN est extrait à l'aide d'un kit d'extraction d'ADN à l'aide de 50 μl de sérum (recommandé), en suivant le protocole du fabricant avec quelques modifications.
- Préparez 200 μl de tampon de lyse + 1 μl de poly(A) (5 μg) par échantillon dans un tube de microcentrifugation. Vortex pendant 15 sec. Mettez de côté jusqu’à l’étape 2.3.
- Prélever des échantillons de sérum dans un congélateur à -80 ºC et les décongeler à température ambiante. Porter le volume total de l’échantillon sérique à 200 μl à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, avec chlorure de calcium et chlorure de magnésium).
- Lyser l’échantillon en ajoutant 20 μl de protéase (1,4 unité Anson/ml) à l’échantillon, suivi d’un mélange tampon de lyse/polyA de 200 μl (de l’étape 2.2) et d’un vortex pendant 8 secondes. Incuber l’échantillon à 56 °C pendant 10 minutes, puis centrifuger brièvement pendant 7 secondes à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse (>10 000 x g).
- Faites précipiter l’ADN en ajoutant 230 μl d’éthanol à 100 % dans l’échantillon et agitez le vortex pendant 8 secondes. Centrifugez brièvement pendant 7 secondes à vitesse maximale (>10 000 x g).
- Appliquez l’ADN sur la colonne de spin en ajoutant un mélange d’échantillons de 600 μl dans la mini colonne de spin. Centrifugeuse à 6 000 x g pendant 1 min. Jetez le flux continu et placez la colonne dans un tube propre.
- Lavez l’ADN en ajoutant 500 μl de tampon de lavage 1 à la colonne. Centrifugeuse à 6 000 x g pendant 1 min. Jetez le flux continu et placez la colonne dans un tube propre. Ajouter 500 μl de tampon de lavage 2 dans la colonne et centrifuger à vitesse maximale (>10 000 x g) pendant 3 min. Placez la colonne dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml et centrifugez à nouveau à vitesse maximale pendant 1 min.
- Éluez l’ADN en plaçant la colonne dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml et en ajoutant un tampon d’élution de 60 μl directement sur le filtre. Il est important d’échanger les pointes entre les échantillons pour éviter la contamination croisée. Incuber à température ambiante pendant 5 min, puis centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min. Ajouter 60 μl supplémentaires de tampon d’élution et centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min.
- Stockez l’ADN à -20 ºC pour une utilisation ultérieure, ou procédez immédiatement à la conversion au bisulfite.
3. Conversion au bisulfite
REMARQUE : La conversion au bisulfite est effectuée à l'aide d'un kit de conversion au bisulfite, en suivant le protocole du fabricant avec quelques modifications.
- Pour convertir les cytosines non méthylées en uraciles, ajoutez 130 μl de réactif de conversion au bisulfite à 20 μl d’ADN à partir de l’étape 2.7 dans un tube PCR (tube PCR unique de 0,2 ml ou tubes PCR à 8 bandelettes). Conservez les 40 μl d’ADN restants pour une utilisation ultérieure ou utilisez-les dans des réactions répétées. Mélangez 20 fois en pipetant de haut en bas et centrifugez brièvement pour vous assurer qu’il n’y a pas de gouttes sur les côtés ou le couvercle. Incuber dans un bain-marie ou un thermocycleur comme suit : 98 °C pendant 8 min, 54 °C pendant 60 min, 4 °C pendant 5 min.
- Passez à l’étape 3.2 ou conservez à 4 °C pendant 20 h maximum.
- Ajoutez 600 μl de tampon de liaison à la colonne d’essorage et placez la colonne dans le tube de collecte fourni. Appliquez l’ADN bisulfité dans la colonne et mélangez en pipetant de haut en bas 10 fois. Centrifugeuse à vitesse maximale (>10 000 x g) pendant 30 sec. Jeter le flux.
- Laver l’ADN en ajoutant 100 μl de tampon de lavage dans la colonne et la centrifugeuse à vitesse maximale (>10 000 x g) pendant 30 secondes.
- Effectuer une désulfonation pour éliminer le groupe sulfonate afin de finaliser la conversion des cytosines non méthylées en uracile en ajoutant 200 μl de tampon de désulfonation à la colonne. Laisser reposer à température ambiante pendant 20 min, puis centrifuger à vitesse maximale (>10 000 x g) pendant 30 sec.
- Lavez l’ADN en ajoutant 200 μl de tampon de lavage dans la colonne et centrifugez à pleine vitesse pendant 30 secondes. Jetez le flux continu et répétez cette étape de lavage.
- Placez la colonne dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Elutez l’ADN en ajoutant un tampon d’élution de 10 μl directement dans le filtre de colonne. Incuber pendant 1 min. Centrifugeuse pendant 30 s à pleine vitesse pour éluer l’ADN. Quantifier l’ADN récupéré par spectrophotométrie à A260.
REMARQUE : L’ADN détecté par spectrophotométrie représente principalement l’ADN polyA porteur qui a été ajouté à l’étape 2.3 ci-dessus. En règle générale, la récupération de polyA est de ≥85 % de l’entrée (>4,25 μg). - Conservez l’ADN à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à passer à la PCR numérique.
4. PCR numérique multiplex
- Faites un mélange maître avec suffisamment de solution pour chaque échantillon et contrôle. Inclure au moins un échantillon contenant de l’eau (témoin négatif), un échantillon d’un plasmide contenant des INS non méthylés (1 pg, témoin positif), un échantillon de plasmide contenant des INS méthylés (1 pg, témoin positif) et un échantillon contenant un mélange 1:1 de plasmides.
- Pour préparer le mélange maître PCR, ajoutez 12,5 μl par réaction de tampon PCR (par exemple, 125 μl pour 10 échantillons), 1,25 μl par mélange d’amorce de réaction/sonde (par exemple, 12,5 μl pour 10 échantillons), 8,25 μl par eau de réaction (par exemple, 82,5 μl pour 10 échantillons), 0,5 μl par enzyme EcoR1 de réaction (par exemple, 5 μl pour 10 échantillons).
REMARQUE : Les amorces et les sondes utilisées ici sont les suivantes : Amorce avant : 5'-GGAAATTGTAGTTTTTTTTTTTTTTTATTTGT-3' ; Amorce inversée : 5'-AAAACCCATCTCCCCTACCTATCA-3' ; Sonde FAM : FAM-5'-ACCCCTACCACCTAAC-3'-MGB ; Sonde VIC : VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB.
- Pour préparer le mélange maître PCR, ajoutez 12,5 μl par réaction de tampon PCR (par exemple, 125 μl pour 10 échantillons), 1,25 μl par mélange d’amorce de réaction/sonde (par exemple, 12,5 μl pour 10 échantillons), 8,25 μl par eau de réaction (par exemple, 82,5 μl pour 10 échantillons), 0,5 μl par enzyme EcoR1 de réaction (par exemple, 5 μl pour 10 échantillons).
- Mettre en place une réaction PCR multiplex dans une plaque à 96 puits. Ajouter 19,5 μl de mélange maître dans chaque puits. Ajouter 2,5 μl d’échantillon d’ADN converti au bisulfite dans chaque puits approprié (conserver les 7,5 μl restants d’ADN converti au bisulfite ou l’utiliser dans des réactions de répétition). Mélanger en pipetant plusieurs fois de haut en bas.
REMARQUE : Les 8 puits alignés doivent contenir un échantillon ou un tampon de contrôle. - Scellez avec un scellage en aluminium à l’aide d’une scelleuse à plaques et centrifugez dans une toupie à plaques jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de liquide sur les côtés des puits.
- Configurer le générateur de gouttelettes automatisé sur l’écran tactile.
REMARQUE : Les 8 puits de la cartouche doivent contenir un contrôle d’échantillon ou de tampon.- Réglez le nombre de rangées utilisées en touchant la ou les rangées dans lesquelles les échantillons sont chargés sur la plaque à 96 puits à partir de l’étape 4.2 et mettez la ligne en surbrillance en bleu pour indiquer une rangée active.
- Chargez les consommables de l’arrière vers l’avant pour éviter toute contamination. Pour commencer, ajoutez des cartouches le long de la rangée arrière de l’instrument. Chargez les pointes dans la rangée centrale de l’instrument.
REMARQUE : Les cartouches ne peuvent s’insérer dans les supports que dans le bon sens. - Placez une plaque à 96 puits dans l’instrument. Sortez un bloc froid du congélateur à -20 °C et placez-y une nouvelle plaque à jupe de 96 puits. Placez-le à l’intérieur de l’instrument à côté de la plaque de 96 puits chargée d’échantillons.
- Ajoutez de l’huile dans le distributeur à l’avant de l’instrument. Sélectionnez le type d’huile sur l’écran tactile.
- Appuyez sur le bouton de démarrage bleu pour démarrer la course. Confirmez la configuration de la plaque et appuyez sur le bouton de démarrage pour commencer.
- Une fois terminé, retirez la plaque à 96 puits qui contient les gouttelettes nouvellement formées et scellez-la avec un joint en aluminium à l’aide d’une scelleuse de plaques.
- Effectuez la PCR10 sur un thermocycleur en utilisant le programme suivant : 95 °C pendant 10:00 min ; 40 cycles à : 94 °C pendant 00:30 min, 57,5 °C pendant 01:00 min ; 98 °C pendant 10:00 min ; 12 °C pendant 10 min ou jusqu’à 24 h.
- Placez la plaque sur le lecteur de gouttelettes et installez le lecteur.
- Cliquez sur l’onglet Configuration. Ouvrez un nouveau modèle en cliquant sur le modèle > nouveau. Entrez un nom de fichier.
- Utilisez l’éditeur de puits pour définir les paramètres de chaque échantillon. Donnez un nom unique à chaque échantillon, définissez l’expérience sur Détection d’événements rares (R-RED) et le master mix sur le mélange utilisé à l’étape 4.1.
- Donnez un nom à la cible 1 (c’est-à-dire non méthylé) et définissez la cible 1 comme inconnue (U). Donnez un nom à la cible 2 (c’est-à-dire méthylé) et définissez la cible 2 comme référence (R).
- Cliquez sur l’onglet Exécuter pour démarrer l’exécution. Dans la fenêtre des options d’exécution, sélectionnez la chimie de détection (FAM/VIC).
5. Analyse des données
- Ouvrez les résultats dans l’onglet Analyser et analysez-les à l’aide d’un tracé 2D basé sur des commandes positives (voir Figure 1).
- Exportez le fichier CSV généré par le lecteur de gouttelettes vers un tableur pour l’analyse des données.
- Pour générer des « copies par μl » de sérum, utilisez la formule : (concentration*250)/(volume de sérum utilisé pour l’isolement de l’ADN en μl). 6
REMARQUE : Les données sont généralement converties en log10 lorsqu’elles sont acquises à partir de sérum humain pour assurer une distribution normale. Alternativement, les données peuvent être tracées sur une échelle logarithmique10 et analysées par des statistiques non paramétriques.
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Résultats
Pour interpréter les données de manière appropriée, nous utilisons des contrôles plasmidiques tant pour l'ADN cible non méthylé et méthylé INS dans chaque essai de PCR numérique. Ces contrôles assurent que les signaux correspondant à l'ADN méthylé et non méthylé se distinguent clairement. La figure 1 montre les diagrammes de dispersion 2-D correspondant aux gouttes pour les contrôles de plasmide contenant le bisulfite converti méthylé INS ADN
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Discussion
La méthylation de cytosines par ADN méthyltransférases permet le contrôle épigénétique de la transcription de nombreux gènes. Le gène de l' INS chez l'être humain est presque exclusivement exprimée dans des cellules d' îlots β, et il semble y avoir une corrélation entre la fréquence de méthylation de cytosine dans le gène INS silençage de sa transcription 11. En tant que tel, la plupart des types de cellules présentent sensiblement plus hautes fréquences de méthylation du gène de...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la subvention UC4 DK104166 des National Institutes of Health (à RGM). Nous tenons à souligner l’aide du Centre de recherche sur le diabète de l’Indiana, soutenu par la subvention P30 DK097512 des National Institutes of Health.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Vacutainer à haut rouge ; | Beckon Dickinson | 366441 | sans additif, intérieur non revêtu, |
| tube cryovial | Simport | T310-3A | , tube à bouchon à vis, n’importe quelle taille |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | détesté dans le tampon TE (10 mM Tris-Cl pH 8,0 + 1 mM EDTA) à 5 & micro ; g/µ ; l ; |
| Éthanol absolu (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (avec CaCl2 et MgCl2) | Sigma | D8662 | |
| 0,2 ml PCR 8 bandelettes | Tubes MidSci | AVST | |
| 8 bandelettes Capuchons, Dôme | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Kit de méthylation-foudre | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix pour sondes (sans dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control pour sondes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-jupe | Eppendorf | 951020346 | |
| Thermoscellage à feuille perçable | Biorad | 1814040 | |
| PX1 Scelleuse de plaques | PCR Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Système PCR numérique | Biorad | 1864101 | |
| Huile de génération de gouttelettes automatisée pour sondes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartouche pour générateur de gouttelettes automatisé | Biorad | 186-4108 | |
| Pointes de pipette pour générateur de gouttelettes automatisé | Biorad | 186-4120 | |
| Bacs à pointes de pipette pour générateur de gouttelettes automatisé | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Thermocycleur tactile | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Lecteur de gouttelettes | Biorad | 186-4003 | |
| Lecteur de gouttelettes ddPCR Huile | Biorad | 186-3004 |
Références
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Réimpressions et autorisations
