High Throughput, en temps réel, à double lecture Test de intracellulaires activité antimicrobienne et eucaryotes cytotoxicité cellulaire

Summary

Un test en temps réel à haut débit a été mis au point pour identifier simultanément (1) les antimicrobiens à pénétration de cellules eucaryotes ciblant un pathogène bactérien intracellulaire, et (2) évaluer la cytotoxicité des cellules eucaryotes. Une variante de la même technologie a ensuite été combinée à la technologie de distribution numérique pour permettre des études faciles, à haute résolution, dose-réponse et en synergie bidimensionnelle et tridimensionnelle.

Abstract

Les mesures traditionnelles d'activité antimicrobienne intracellulaire et la cytotoxicité des cellules eucaryotes reposent sur des tests finaux. De tels tests finaux nécessitent plusieurs étapes expérimentales supplémentaires avant une lecture, telles que la lyse cellulaire, la formation de colonies de détermination de l'unité, ou l'addition de réactifs. Lorsque vous effectuez des milliers de tests, par exemple, au cours de criblage à haut-débit, l'effort aval requis pour ces types d'essais est considérable. Par conséquent, pour faciliter la découverte antimicrobienne à haut débit, nous avons développé un essai en temps réel pour identifier simultanément des inhibiteurs de la croissance bactérienne intracellulaire et d'évaluer la cytotoxicité des cellules eucaryotes. Plus précisément, la détection de la croissance bactérienne intracellulaire en temps réel a été activé par le marquage des souches bactériennes de criblage soit d' un opéron bactérien lux (1 essai de génération ^st) ou reporters de protéines fluorescentes (2 ^ème génération, le dosage orthogonales). Une membrane cellulaire imperméant, un colorant de liaison aux acides non toxiques, Nucleica également été ajouté au cours de l'infection initiale des macrophages. Ces colorants sont exclues des cellules viables. Cependant, les cellules hôtes non viables perdent l'intégrité de la membrane permettant l'entrée et le marquage fluorescent de l'ADN nucléaire (acide désoxyribonucléique). Notamment, la liaison d'ADN est associée à une forte augmentation du rendement quantique de fluorescence qui fournit une lecture à base de solution de la mort de la cellule hôte. Nous avons utilisé ce dosage combiné pour réaliser un écran à haut rendement en format microplaque, et pour évaluer la croissance intracellulaire et la cytotoxicité par microscopie. En particulier, les antimicrobiens peuvent présenter une synergie dans laquelle l'effet combiné de deux ou plusieurs agents antimicrobiens, lorsqu'il est appliqué en même temps est supérieur lorsqu'ils sont appliqués séparément. Test de synergie in vitro contre les pathogènes intracellulaires est normalement une tâche prodigieuse permutations combinatoires d'antibiotiques à différentes concentrations doivent être évaluées. Cependant, nous avons trouvé que notre analyse en temps réel combinée avec automatisé, distribution numérique technologie permitted tests de synergie facile. L' utilisation de ces approches, nous avons pu étudier systématiquement l' action d'un grand nombre des seuls antimicrobiens et en combinaison contre le pathogène intracellulaire, Legionella pneumophila.

Introduction

Pathogens qui poussent ou résident temporairement dans des compartiments intracellulaires sont difficiles à éradiquer thérapeutique. OBLIGER ou relativement obliger les agents pathogènes intracellulaires tels que Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp. , Francisella tularensis, et Mycobacterium spp. nécessitent souvent des cours de thérapie antimicrobienne prolongée pour la guérison qui peut aller de quelques mois à voire des années. En outre, les agents pathogènes extracellulaires peuvent transitoirement occuper des niches intracellulaires et de cette façon échapper à un dégagement de cours norma....

Protocol

1. Temps réel intracellulaires croissance et cellules eucaryotes Essai de cytotoxicité

1. Préparation de cellules hôtes (Cellules J774A.1)
   1. Les cellules de type macrophage Culture J774A.1 Mus en suspension dans RPMI 1640 avec 9% de sérum de veau fer complété. Un premier passage dans des flacons de culture tissulaire. Après que les cellules sont devenues confluentes dans 75 cm ² flacon de culture tissulaire dans 15 ml de milieu, divisé par grattage et de dilution à 65 ml avec le même type de support, dont 15 ml retourne dans le flacon de culture tissulaire et 50 ml est transféré à un 250 ml bactérienne flacon shaker.
   2. Pour ....

Results

essai de croissance intracellulaire microplaque

Figure 1 schématise les étapes d'essai. Les étapes automatisées indiquées peuvent être effectuées manuellement. Cependant, le débit est grandement facilité l'utilisation de systèmes de manipulation de liquides.

La figure 2 montre des résultats représentatifs d'une microplaque de 384 pu.......

Discussion

Nous décrivons des tests en temps réel pour la détection simultanée de la croissance bactérienne intracellulaire et la cytotoxicité des cellules hôtes. Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole. D'abord, pour les performances du test robuste, il doit y avoir une séparation spectrale suffisante entre les lectures bactériennes et cytotoxicité. Une telle séparation est intrinsèque des combinaisons de reporters opéron luciférase et des colorants de liaison à l'ADN fluorescents. Cependant, sur la base de no.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
J774A.1 cellules	American Type Culture Collection	TIB-67	Cellule hôte
ACES	Sigma-Aldrich	A9758  ;	Pour la fabrication d’une gélose à l’extrait de levure de charbon de bois tamponnée et d’un milieu d’extrait de levure tamponné
Extrait de levure, ultrafiltré	Becton-Dickinson/Difco	210929	Pour la fabrication d’une gélose à l’extrait de levure au charbon de bois tamponné et d’un milieu d’extrait de levure tamponné ; les grades inférieurs peuvent entraîner une altération de la croissance et/ou altérer la sensibilité de Legionella aux inhibiteurs de croissance
Acide alpha-cétoglutarique, sel monopotassique	Sigma-Aldrich	K2000	Pour la fabrication d’une gélose à l’extrait de levure au charbon de bois tamponné et d’un milieu d’extrait de levure tamponné
Pyruvate de sodium	Sigma-Aldrich	P5280	Pour la fabrication d’une gélose à l’extrait de levure au charbon de bois tamponné et d’un milieu d’extrait de levure tamponné
Phosphate de potassium, dibasique	Thermo Fisher Scientific	P288-500	Pour la fabrication d’une gélose à l’extrait de levure de charbon de bois tamponné et d’un milieu d’extrait de levure tamponné
L-cystéine	Sigma-Aldrich	C-7755	Pour la fabrication d’une gélose à l’extrait de levure au charbon de bois tamponné et d’un milieu
d’extrait de levure tamponnéCitrate de fer d’ammonium(III)	Sigma-Aldrich	F5879	Pour la fabrication d’une gélose à l’extrait de levure de charbon de bois tamponné et d’un milieu d’extrait de levure tamponné ; le pyrophosphate ferrique peut être utilisé à la place, mais il est plus difficile à peser avec précision
Solution d’hydroxyde de potassium, concentrée	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	Pour la fabrication d’une gélose d’extrait de levure de charbon de bois tamponné et d’un milieu d’extrait de levure tamponné
Eau déonisée	N/A	/A	Pour la fabrication d’une gélose à l’extrait de levure de charbon de bois tamponnée et d’un milieu d’extrait de levure tamponné
Thymidine (qualité culture tissulaire)	Sigma-Aldrich	T1895	Pour compléter à la fois le RPMI 1640 et l’extrait de levure tamponné agar/medium &mdash ; la thymidine de grade inférieur peut être utilisée pour ce dernier, mais peut entraîner une altération de la croissance cellulaire et/ou la mort cellulaire dans le RPMI 1640
RPMI 1640, formulation standard	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	Pour la croissance des cellules J774A.1 avant le placage ; comprend 2 mM de L-glutamine
RPMI 1640 sans rouge de phénol	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	Pour le placage des cellules J774A.1 dans des boîtes à 384 puits (ne convient pas à la croissance avant le placage) ; manque également de L-glutamine &mdash ; supplément à 2 mM avant utilisation
L-glutamine, 200 mM dans 0,85 % de NaCl (qualité culture tissulaire)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	Pour compléter le RPMI 1640 manquant de L-glutamine, à une concentration finale de 2 mM
Sérum de veau supplémenté en fer	Gemini Bioproducts	100-510	Pour compléter le RPMI 1640, à une concentration finale de 9,1 %
Solution de Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154	Pour la coloration pour J774A.1 Détermination de la mort cellulaire lors du comptage de la densité cellulaire
SYTOX Green, solution de 5 mM dans du DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	Pour la coloration pour J774A.1, la détermination de la mort cellulaire par lecture de fluorescence ou microscopie d’épifluorescence (en conjonction avec des bactéries fluorescentes rouge orangé ou rouge lointain). Utilisation à une concentration finale de 125 nM.
Incubateur de culture cellulaire	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	Pour l’incubation des cellules J774A.1 (avant et après l’infection) ; peut également être utilisé pour l’incubation de bactéries, ou un incubateur à atmosphère standard peut être utilisé à la place)
Agitateur orbital	BellCo Glass	7744-01010	Pour l’incubation agitée des cellules J774A.1 avant l’infection ; s’insère dans l’incubateur de culture cellulaire ; comprend une base d’agitateur 7744-01000 et un plateau 7740-01010 (ils sont également disponibles séparément)
Flacons agitateurs (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	Pour l’incubation agitée des cellules J774A.1 avant l’infection
Pinces vibrantes pour flacons (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	Pour agiter l’incubation des cellules J774A.1 avant l’infection
Fioles agitatrices (1 000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	Pour agiter l’incubation des cellules J774A.1 avant l’infection
Pinces vibrantes pour flacons (1 000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	Pour agiter l’incubation des cellules J774A.1 avant l’infection
Capuchons en mousse éponge pour flacons (250 ml-1 000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	Pour l’incubation agitée des cellules J774A.1 avant l’infection ; réduit le risque de contamination par rapport aux capuchons métalliques standard
Pompe péristaltique multicanal programmable MultiDrop Combi	Thermo Fisher Scientific	5840300	Pour la distribution de cellules J774A.1, de milieux et de suspensions bactériennes contenant des fluorophores à un grand nombre de boîtes à 384 puits
Collecteur à alésage standard Combi	Thermo Fisher Scientific	24072670	Volume de prédistribution par défaut de 20 μ ; l est insuffisant pour compenser le tassement &mdash ; augmentation à 80 μ ; l
Blancs 384 boîtes à puits traités pour la culture tissulaire	Corning	3570	Pour la lecture de la luminescence et de la fluorescence ; Le catalogue Greiner # 781080 a également été testé avec succès
DMSO (grade de culture tissulaire, en ampoules scellées)	Sigma-Aldrich	D2650	Pour dissoudre les composés de contrôle positif et de test
Azithromycine	Sigma-Aldrich	PHR1088	Contrôle positif antibiotique
Saponine (à partir de l’écorce de Quillaja)	Sigma-Aldrich	S-4521	Pipette
	multicanaux de contrôle positif de cytotoxicitéThermo Fisher Scientific	Finnpipette	Pour le transfert de quantités fixes de composés de contrôle positif ; le pipeteur doit disposer d’une distribution numérique avec crans pour permettre une distribution répétitive à volume fixe
Robot de transfert de broches Epson Epson	/ICCB-L	(équipement personnalisé)	Pour le transfert de quantités fixes de composés de test à partir de réseaux de bibliothèques
Système de distribution numérique D300	Hewlett-Packard via Tecan	D300	Pour le transfert de quantités variables de composés d’essai allant de 11 picolitres à 10 & micro ; l
Cartouches T8+ pour système de distribution numérique D300	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	Pour la distribution de composés de test
Microscope à épifluorescence avec appareil photo numérique connecté à l’ordinateur	Nikon	Ti	Pour l’imagerie de cellules vivantes ; tout microscope fluorescent standard peut remplacer, avec une optique à contraste de phase ou DIC, capable d’imager la fluorescence verte (fluorescéine), rouge orangé à rouge (Texas Red) et rouge lointain (Cy5), avec de l’huile 100X objectif pour la résolution la plus élevée
Boîtes de culture tissulaire à fond de verre	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	Pour l’imagerie de cellules vivantes. Les paraboles telles que le MatTek permettent une visualisation microscopique à un grossissement de 600X ou 1 000X grâce à l’utilisation d’un microscope épifluorescent inversé ou confocal. Ces plats spécifiques ont un diamètre nominal de 3,5 cm, un diamètre intérieur de 3,3 cm, avec des lamelles de recouvrement de 20 mm de diamètre #1,5 d’épaisseur insérées dans les fonds.
Photoshop, CS6	Adobe		, Adobe Photoshop ou des programmes similaires peuvent être utilisés pour pseudocolorier et fusionner des images microscopiques et fluorescentes.
Mathematica 10	Wolfam		Pour la génération d’isobologrammes isocontours bidimensionnels et d’isobologrammes de surface tridimensionnels.