Observation et Quantification de Mating Comportement dans le nématode, Bursaphelenchus xylophilus

Summary

Un protocole pour étudier le comportement d’accouplement du nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus, est présenté. Les caractéristiques comportementales de B. xylophilus sont décrites dans le processus d’accouplement.

Abstract

Une méthode d'observation et de quantifier le comportement d'accouplement du nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus, a été créé sous un stéréomicroscope. Pour améliorer l'efficacité de l' accouplement de B. Xylophilus et d'augmenter les chances d'observation de l' accouplement, les adultes vierges ont été cultivées et utilisées pour l'enquête. Les œufs ont été obtenus en gardant les nématodes dans l'eau et en permettant aux femelles à pondre des oeufs pendant 10 min. Les juvéniles de deuxième stade (J2) ont été synchronisées par incubation des oeufs pendant 24 h à 25 ° C dans l'obscurité, et le début du J4 ont été obtenus en cultivant le J2 avec de la moisissure grise, Botrytis cinerea, pour un autre 52 h. A ce point du temps, la plupart des nématodes J4 pourraient être clairement distingué comme étant un homme ou une femme en utilisant leur morphologie génitale. Le mâle et la femelle J4 ont été recueillies et cultivées séparément dans deux plats différents de Pétri pendant 24 h pour obtenir nématodes adultes vierges. Un mâle et une femelle vierge vierge ont été jumelés dans une goutte de water dans le puits d'une lame concave. Le comportement d'accouplement a été filmé avec un enregistreur vidéo sous un stéréomicroscope. Toute la période du processus d'accouplement était de 82,8 ± 3,91 min (moyenne ± SE) et pourrait être divisé en 4 phases différentes: la recherche, contact, copuler et persistants. Les minutes moyennes de durée étaient de 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 et 7,2 ± 0,5, respectivement. sous-comportements Onze ont été décrits: croisière, approche, rencontrer, toucher, frettage, la localisation, la fixation, éjaculer, séparer, quiescence, et l'itinérance. Fait intéressant, la concurrence intra-sexuelle évidente a été observée lorsque une femme a été regroupé avec 3 mâles ou d'un mâle avec 3 femelles. Ce protocole est utile et précieux, non seulement dans l' étude du comportement d'accouplement de B. xylophilus, mais aussi en agissant comme une référence pour les études éthologiques des autres nématodes.

Introduction

Le nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner et Buhrer) Nickle, est l’une des espèces envahissantes les plus destructrices, causant le flétrissement et finalement la mort des pins. On pense que ce nématode pathogène est originaire des États-Unis, mais il a été transporté dans plusieurs pays, dont la Chine, le Japon, la Corée du Sud et le Portugal. Récemment, il a également été signalé en Espagne, tuant des millions de pins avec d’énormes pertes économiques et menaçant la production forestière et la stabilité écologique.

Une fois qu’un pin hôte est infecté par des nématodes du pin, des milliers de millions de descendants se propagent rapidement dans le tronc. Cela provoque un dysfonctionnement du xylème, entraînant le flétrissement et finalement la mort de l’arbre hôte⁶. Cependant, il n’existe actuellement aucun moyen efficace de contrôler cette maladie. Le comportement d’accouplement pourrait jouer un rôle important dans la fécondité élevée de ce nématode⁷. Nous avons donc étudié le comportement d’accouplement de B. xylophilus en laboratoire, en essayant de trouver un moyen efficace de perturber son accouplement et de diminuer sa fécondité.

Ce protocole a pour but d’introduire les méthodes détaillées pour obtenir les adultes vierges de B. xylophilus et pour observer et analyser le comportement d’accouplement à l’aide d’un enregistreur vidéo et d’un stéréomicroscope. Ce protocole peut également être utilisé comme référence pour les études comportementales d’autres nématodes.

Protocol

1. Acquisition de Virgin adultes Nématodes

1. Pinewood nematode isolat et des conditions de culture
   NOTE: Le B. xylophilus isoler Nxy61 a été extrait d'un massoniana Pinus malade dans la région de Ningbo de la province du Zhejiang en Chine.
   1. Préparer Potato Dextrose Agar (PDA, voir le tableau des matériaux) plaques pour la culture Botrytis cinerea.
   2. Pour l' inoculation, percer un morceau de tapis fongique avec un diamètre de 10 mm à partir d' un tapis B. cinerea et le mettre dans le milieu d'une nouvelle plaque de PDA. Culture B. cinerea pendant 5 jours à 25 ° C dans l'obscurité.
   3. Culture des nématode du pin dans la boîte de Pétri préparée contenant B. cinerea à 25 ° C dans l'obscurité.
2. Acquisition de B. xylophilus oeufs
   1. Placer un tube en caoutchouc serré en dessous d'un entonnoir et maintenir l'entonnoir disposé dans un rack pour assembler leAppareil d'entonnoir Baermann. Placer deux couches de papier filtre à la place de la gaze à l'embouchure de l'entonnoir.
   2. Transférer les cultures fongiques à la configuration de l'entonnoir et ajouter de l'eau jusqu'à ce que le tapis fongique est immergé. Attendre 2 h, et les nématodes sortiront de la culture fongique, traverser le papier filtre, et s'installer dans la partie la plus basse de l'entonnoir Baermann.
   3. Rassembler les deux premières gouttes d'eau à partir du fond du tube dans un tube de 15 ml et recueillir les nématodes en relâchant lentement la pince sur le tube.
   4. Centrifuger les collections ci-dessus à 3000 g pendant 2 min à température ambiante.
   5. Retirer la couche supérieure de l' eau avec une pipette et remettre en suspension avec 1 ml de stérile doublement distillée (dd) H ₂ O.
   6. Avec une pipette, transférer la remise en suspension au-dessus d'une boîte de Petri nouveau en verre (diamètre 6 cm). Ajouter 3 ml de stérile dd H ₂ O à la boîte de Pétri pour garantir que les nématodes sont capables de nager librement.
   7. Gardez les nématodes dans les glass boîte de Pétri pendant 10 min à 25 ° C dans l'obscurité. Les oeufs seront pondus par les femelles enceintes. En raison de leur surface de glycoprotéine, les œufs coller au fond du verre boîte de Pétri.
   8. Retirer l'eau et les vers soigneusement, sans déranger les œufs. Ajouter 3 ml de stérile dd H ₂ O au verre boîte de Pétri immédiatement pour empêcher les oeufs de se dessécher.
   9. Répétez l'étape 1.2.8 3x pour supprimer toutes les larves et les adultes, et d'obtenir des œufs purs. Ajouter un supplément de 2 mL (5 ml au total) de stérile dd H ₂ O à la boîte de Pétri.
3. Acquisition des juvéniles de quatrième stade (J4 larves)
   1. Hatch les œufs récoltés pendant 24 h dans l'obscurité à 25 ° C pour obtenir des larves de J2.
   2. Transfert des larves de J2 avec une pipette dans un tube de 15 ml, centrifuger à 3000 g pendant 2 min, et enlever la couche supérieure de l'eau.
   3. Resuspendre les larves de J2 avec 200 pi de stérile dd H ₂ O, puis les transférer àla plaque de PDA contenant B. cinerea.
   4. Culture de la larve de J2 pendant 52 h à 25 ° C dans l'obscurité. A ce point du temps, la plupart des larves J2 aura développé dans le stade précoce des larves J4.
4. Acquisition de nématodes adultes vierges
   1. Préparer une aiguille pour prélever des nématodes en dessinant un capillaire en verre après le chauffage au-dessus d'un brûleur à alcool.
      REMARQUE: La pointe de cette aiguille capillaire doit généralement être de 50 um de diamètre, à peu près la largeur du corps d'un nematode adulte, de sorte qu'il peut être utilisé comme outil pour ramasser un seul nématode.
   2. Assembler un entonnoir Baermann et extraire les nématodes des cultures fongiques pendant 2 h, comme décrit dans les étapes 1.2.1 - 1.2.3.
   3. Transférer le J4 avec de l'eau dans une boîte de Pétri propre.
   4. Observer les nématodes sous un stéréomicroscope et de distinguer entre les hommes et les femmes par la morphologie génitale, comme décrit par Mamiya et Kiyohara ⁸ (Figure 1 ). Ramasser un nématode du sexe désiré avec l'aiguille capillaire préparé et transférer à la plaque fongique-culture appropriée pour les hommes ou les femmes.
      NOTE: Il y a plus de femmes que d'hommes, avec le pourcentage de femmes à 60 - 70%. La vulve féminine est évidemment différent du spicule mâle. Par rapport à l'adulte, la spicule ou de la vulve au J4 stade précoce est plus petit, mais ils peuvent encore être facilement vu et distingué. Le nématode est toujours en mouvement dans l'eau, ce qui augmente parfois la difficulté de distinguer les mâles et les femelles.
   5. La culture des larves J4 pendant encore 24 heures à 25 ° C dans l'obscurité.
      REMARQUE: Tous les nématodes devraient devenir des adultes, mais comme ils sont déconnectés, ils sont considérés comme des adultes vierges.
   6. Assembler deux Baermann entonnoirs et extraire les adultes vierges des cultures de champignons pendant 2 h, comme décrit dans les étapes 1.2.1 - 1.2.3, et transférer les mâles et les femelles adultes vierges en deux, des boîtes de Petri propres séparés.

2. Observation et enregistrement vidéo de Mating Comportement

1. Préparer plusieurs diapositives concaves et ajouter 200 ul d' eau stérile jj H ₂ O à chacun de leurs puits.
2. Décrochez le mâle préparé vierge adulte ou et femelle avec une aiguille capillaire et de mettre un seul nématode dans l'eau de chaque diapositive concave.
3. Gardez les adultes vierges à l'intérieur du puits pendant 1 h pour permettre leur adaptation au nouvel environnement aqueux.
4. Associez un mâle vierge et femelle en transférant l'un d'entre eux d'un puits à l'autre en utilisant une pipette.
5. Observez le comportement d'accouplement de la 1♀ 1♂ combinaison + dans la glissière concave sous un stéréomicroscope.
6. Pour analyser l'efficacité d'accouplement des adultes vierges, calculer leur taux de succès d'accouplement (R) et le comparer à celui des couples d'adultes choisis au hasard. Calculer R comme le pourcentage de réplications dans lequel copulation a été observée par rapport au nombre total de répétitions étudiées.
7. Pour étudier le choix de l'accouplement et de la concurrence intrasexuelle, groupe et observer les nématodes vierges de deux combinaisons différentes: 1♀ + 3♂ et 3♀ + 1♂.
8. Afin de recueillir des données pour l'analyse qualitative et quantitative, filmer le comportement d'accouplement en utilisant la microscopie vidéo. En règle générale, l'ensemble du processus d'accouplement, à partir du moment où les nématodes sont placés dans le puits de la lame concave au moment où ils se déplacent à une distance après la copulation, est achevée en 2 heures. Par conséquent, enregistrer le processus d'accouplement en continu pendant au moins 2 h comme une répétition. Remplir au moins 30 répétitions au total pour chaque combinaison.
   NOTE: Ajouter plus stérile dd H ₂ O (habituellement 50 pi) toutes les 0,5 h au puits pour compenser l'évaporation pendant le processus d'enregistrement.

3. Collecte de données

1. Voir toutes les vidéos avec précaution sur un écran d'ordinateur et de caractériser les sous-comportements qualitativement.
2. Mesurer la durée d'accouplement à l'aide ièmee fonction image par image de l'enregistreur vidéo. Manuellement soustraire le temps à partir du point d'extrémité.
3. Pour la combinaison 1♀ + 1♂, analyser chaque enregistrement vidéo et de mesurer la durée des événements suivants:
   1. Mesurer la durée de la recherche ( à savoir le moment à partir duquel la femelle et mâle sont introduits dans le puits de la lame concave pour le moment qu'ils rencontrent et communiquer entre eux).
   2. Mesurer la durée de mise en contact (ie, le temps depuis le premier contact jusqu'au moment où le mâle est précisément positionné à la vulve de la femme pour la première copulation).
   3. Mesurer la durée de copuler (ie, le temps entre le moment où le mâle est précisément positionné à la vulve de la femelle jusqu'à ce qu'il glisse vers le bas du corps de la femelle après l' éjaculation). Remarque: Certains nématodes peuvent copuler plusieurs fois dans 2 h. Dans de tels cas, de mesurer la durée de copulation de la première copulation à la fin de la last-ci, y compris le temps entre les deux.
   4. Mesurer la durée persistante ( par exemple, la période après l' accouplement jusqu'à ce que la nage mâle et femelle loin de l'autre et sont séparés par une distance supérieure à la longueur du corps de nematodes ( le plus souvent 1 mm)).
4. Compter la fréquence de copulation et la durée de chaque copulation et la durée moyenne de l' ensemble des copulations en 2 h pour chacune des combinaisons différentes (c. -à 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ et 1♀ + 3♂).
5. Calculer le taux de succès d'accouplement pour le premier contact (P) pour les différentes combinaisons que le taux de réussite de l'accouplement après le premier contact, qui est conduit immédiatement et sans interruption. Dans la phase en contact, plusieurs contacts peuvent être observés avant la copulation réelle.
   1. Lorsque la distance entre deux individus est supérieure à la longueur du corps, envisager un contact pour être terminée. Pour une répétition, record P 100% lorsque la copulation is observé immédiatement après le premier contact, sans interruption, ou 0,00% si aucune copulation a été observée ou s'il y avait copulation mais après deux ou plusieurs contacts.
      NOTE: Il y avait 30 répétitions pour chaque combinaison décrite ici.

Results

Le taux de succès d'accouplement (R) des adultes vierges était 86,67% en moyenne, ce qui est nettement plus élevé que celui des adultes choisis au hasard: 13,33 ± 4,65% (F = 1301,71, df = 1, P = 0,0001) (figure 2). Cette découverte suggère qu'il est plus facile d'observer le comportement d'accouplement de B. xylophilus avec des adultes vierges que les adultes choisis au hasard.

Quand...

Discussion

Les tests comportementaux sont un aspect fondamental de l'écologie chimique, la neurobiologie, la biologie moléculaire et la génétique. Nématodes, et en particulier C. elegans, sont largement utilisés pour des études dans ces domaines. Le comportement d'accouplement de C. elegans a été étudiée précédemment ^10-11. Cependant, B. xylophilus est gonochorique et différent des C. elegans hermaphrodites, et son processus d'accouplement a différentes caractéristiques co...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolat de B. xylophilus Nxy61			Extrait de Pinus massoniana dans la région de Ningbo en Chine
Souche			Obtenue de l’Académie forestière de Chine
Entonnoirs Baermann	Sengong
Centrifugeuse	Sengong
pipette	Sengong
stérile dd H2O			Stérilisée par haute pression de vapeur à 121 ° ; C pendant 30 min.
Boîtes de Pétri	Sengong
PDA medium	Huankai Bio.	021050
incubateur	Sengong
Flux laminaire	Sengong
verre capillaire	Sengong
Stéréoscope	Leica	LED5000 RL
stéréomicroscope inversé	Zeiss	A1
lames concaves	Sengong