Céfopérazone traité Souris Modèle de Cliniquement pertinentes Clostridium difficile Strain R20291

Summary

Ce protocole décrit le modèle de souris céfopérazone d'infection à Clostridium difficile (CDI) en utilisant une souche cliniquement pertinente et génétiquement traitable, R20291. L' accent mis sur la surveillance clinique de la maladie, C. énumération bactérienne difficile, la toxine cytotoxicité, et des changements histopathologiques tout au long de CDI dans un modèle de souris sont détaillés dans le protocole.

Abstract

Clostridium difficile est un pathogène entérique anaérobie, à Gram positif et sporulé qui est associé à une morbidité et à une mortalité croissantes et constitue par conséquent une menace urgente pour la santé publique. La récurrence d’une infection à C. difficile (ICD) après un traitement antibiotique réussi est élevée, survenant chez 20 à 30 % des patients, nécessitant ainsi la découverte de nouvelles thérapies contre cet agent pathogène. Les modèles animaux actuels d’ICD entraînent des taux de mortalité élevés et ne se rapprochent donc pas des manifestations chroniques et insidieuses de la maladie observées chez l’homme atteint d’ICD. Pour évaluer les traitements contre C. difficile, il est nécessaire de disposer d’un modèle murin se rapprochant de la maladie humaine à l’aide d’une souche cliniquement pertinente. Ce protocole décrit le modèle murin de céfopérazone de l’ICD à l’aide d’une souche cliniquement pertinente et génétiquement traitable, R20291. Les techniques de surveillance clinique de la maladie, de dénombrement bactérien de C. difficile, de cytotoxicité des toxines et de changements histopathologiques tout au long de l’ICD dans un modèle murin sont détaillées dans le protocole. Comparé à d’autres modèles murins d’ICD, ce modèle n’est pas uniformément létal à la dose administrée, ce qui permet d’observer une évolution clinique prolongée de l’infection concordant avec la maladie humaine. Par conséquent, ce modèle murin de céfopérazone de l’ICD s’avère une plate-forme expérimentale précieuse pour évaluer les effets de nouvelles thérapies sur l’amélioration de la maladie clinique et sur la restauration de la résistance à la colonisation contre C. difficile.

Introduction

Clostridium difficile est un anaérobie, bacillus sporulé Gram positif qui provoque la vie en danger de la diarrhée ^1. Infection à C. difficile (ICD) est associée à une augmentation de la morbidité et la mortalité humaines et les résultats dans plus de 4,8 milliards $ en coûts de soins de santé par an ^1-4. En 2013, les Centers for Disease Control and Prevention catégorisés C. difficile comme un risque urgent de résistance aux antibiotiques, ce qui indique qu'il constitue une menace urgente pour la santé publique ^1. Actuellement, le traitement antibiotique vancomycine et métronidazole sont considérés comme....

Protocol

Déclaration éthique:
La Commission institutionnelle animale soin et l'utilisation (IACUC) à la North Carolina State University College of Veterinary Medicine (NCSU) a approuvé cette étude. Le NCSU Animal Care et Utiliser la politique applique les normes et les lignes directrices énoncées dans la Loi sur la Loi et Extension de recherche en santé du bien - être des animaux de laboratoire 1985. animaleries à NCSU adhérer aux lignes directrices énoncées dans le Guide pour le soin et l' utilisation des animaux de laboratoire. Les états de santé Les animaux ont été évalués de tous les jours, et les animaux moribonds ont été euthanasiés sans cru....

Results

Au cours d'une étude représentative, 5-week-old C57BL / 6 souris WT ont été prétraités avec céfopérazone dans leur eau potable (0,5 mg / ml) pendant 5 jours et autorisés par jour 2 se laver avec de l'eau potable régulière. Les souris ont été provoquées avec ⁵ à 10 spores de C. difficile R20291 par gavage oral au jour 0 (figure 1A). Les souris ont été surveillés pour la perte de poids et les signes cliniques (léthargie, inappétence, la diarrhée et une .......

Discussion

Ce protocole caractérise l’évolution clinique, y compris la perte de poids, la colonisation bactérienne, la cytotoxicité des toxines et les changements histopathologiques dans le tractus gastro-intestinal, de souris traitées aux antibiotiques et exposées par des spores de C. difficile R20291. Le protocole comporte plusieurs étapes critiques où l’attention portée aux détails est essentielle. Il est essentiel de calculer avec précision l’inoculum des spores de C. difficile . Ce calcul est basé sur le déno.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#62 Perisept Nettoyant Désinfectant Sporidicial  ;	SSS Navigator	48027	Ce produit nécessitera une dilution telle que recommandée par le fabricant
0,22 &mu ; m filter	Fisherbrand	09-720-3	Alternative à la plaque filtrante pour les échantillons individuels testés dans le Vero Cell Assay
0,25 % Trypsine-EDTA	Gibco	25200-056	Doit être chauffé au bain-marie à 37 ° ; C avant utilisation
0,4 % Trypan Blue	Gibco	15250-061
1 % Péniciline/Streptomycine	Gibco	15070-063
10 % inactivé par la chaleur	FBS Gibco	16140-071	Doit être chauffé au bain-marie à 37 ° ; C avant utilisation
Seringue en plastique de 1 ml  ;	BD Medical Supplies	309628
1x PBS	Gibco	10010-023
2 ml Micro centrifugeuse Bouchon à vis	Corning	430917
96 puits culture cellulaire plaque à fond plat	Costar Corning	CL3595
96 puits plaque filtrante	Millipore	MSGVS2210
Adhesive Seal	ThermoScientific	AB-0558
Bacto Agar	Becton Dickinson	214010	Partie des plaques TCCFA (voir ci-dessous)
Bacto Proteose Peptone	Becton Dickinson	211684	Partie des plaques TCCFA (voir ci-dessous)
Cefoperazone	MP Bioworks	199695
Cefoxitine	Sigma	C47856	Partie des plaques TCCFA (voir ci-dessous)
Clostridium difficile Antitoxin Kit	Tech Labs	T5000	Utilisé comme contrôle pour le test Vero Cell
Toxine Clostridium difficile A	List Biological Labs	152C	Contrôle positif pour le test Vero Cell
D-cycloserine	Sigma	C6880	Partie des plaques TCCFA (voir ci-dessous)
Eau distillée	Gibco	15230
DMEM 1x Media	Gibco	11965-092	Doit être chauffé au bain-marie à 37 ° ; C avant utilisation
Fructose	Fisher	L95500	Partie des plaques TCCFA (voir ci-dessous)
Hémocytomètre	Bright-Line, Sigma	Z359629
KH2PO4	Fisher	P285-500	Partie des plaques TCCFA (voir ci-dessous)
MgSO4 (anhydre)	Sigma	M2643	Partie des plaques TCCFA (voir ci-dessous)
Millex-GS 0.22 &mu ; m filter	Millex-GS	SLGS033SS	Filtre pour plaques TCCFA
Na2HPO4	Sigma	S-0876	Partie des plaques TCCFA (voir ci-dessous)
NaCl	Fisher	S640-3	Partie des plaques TCCFA (voir ci-dessous)
Lame de scalpel jetable numéro 10	Miltex, Inc	4-410
Plaques PCR	Fisherbrand	14230244
Boîte de Pétri en plastique	Kord-Valmark Brand	2900
Épandeur de cellules en forme de L en plastique stérile	Fisherbrand	14-665-230
Seringue pas à pas	Dymax Corporation	T15469
Taurocholate	Sigma	T4009	Partie des plaques TCCFA (voir ci-dessous)
Eau distillée ultrapure	Invitrogen	10977-015
C57BL/6J Souris	Le laboratoire Jackson	664	Les souris doivent être âgées de 5 à 8 semaines
Microscope optique Olympus BX43F	Appareil
	Life Science
cellSens Dimension logiciel  ;	Olympus Sciences de