Method Article

Conjugatif Mating Assays pour l'analyse des protéines de transfert impliqués dans Conjugaison bactérienne spécifique à la séquence

DOI:

10.3791/54854

⸱

January 4th, 2017

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1Department of Chemistry, York University, 2The Centre for Research on Biomolecular Interactions, York University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons un protocole pour inactiver un gène d’intérêt impliqué dans la conjugaison plasmidique et analysons ensuite l’impact de son absence à l’aide de tests d’accouplement. La fonction du gène est explorée plus en détail dans une région spécifique de sa séquence à l’aide de délétions ou de mutations ponctuelles.

Abstract

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Le transfert de matériel génétique par conjugaison bactérienne est un processus qui se déroule via des complexes formés par des protéines de transfert spécifiques. Chez Escherichia coli, ces protéines de transfert constituent une machinerie de transfert d’ADN connue sous le nom de formation de paires d’accouplement, ou complexe de transfert d’ADN, qui facilite le transfert conjugatif de plasmides. L’objectif de cet article est de fournir une méthode qui peut être utilisée pour déterminer le rôle d’une protéine de transfert spécifique impliquée dans la conjugaison à l’aide d’une série de délétions et/ou de mutations ponctuelles en combinaison avec des tests d’accouplement. Le gène cible est inactivé sur le plasmide conjugatif et est ensuite fourni en trans par l’utilisation d’un petit plasmide de récupération hébergeant le gène cible. Les mutations affectant le gène cible sur le plasmide de récupération peuvent révéler des informations sur les aspects fonctionnels de la protéine cible qui entraînent l’altération de l’efficacité de l’accouplement des cellules donneuses hébergeant le gène muté. Les modifications de l’efficacité de l’accouplement donnent un aperçu du rôle et de l’importance de la protéine de transfert particulière, ou d’une région de celle-ci, dans la facilitation du transfert conjugatif de l’ADN. Le couplage de cet essai d’accouplement avec des études structurales tridimensionnelles détaillées permettra de comprendre complètement la fonction de la protéine de transfert conjugative et de fournir un moyen d’identifier et de caractériser les régions d’interaction protéine-protéine.

Introduction

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Le transfert de gènes et de protéines au niveau des micro-organismal joue un rôle central dans la survie des bactéries et de l'évolution ainsi que les processus d'infection. L'échange d'ADN entre les bactéries ou entre une bactérie et une cellule peut être obtenue par transformation, conjugaison ou transduction du vecteur. 1,2 Conjugaison est unique en comparaison à la transformation et la transduction en ce que pendant la conjugaison entre les bactéries Gram-négatives telles que Escherichia coli, le transfert d'ADN a lieu de façon contrôlée du donneur dans lequel un système complexe macromoléculaire relie les cellules du donneur et du receveur. Conjugaison est aussi le moyen le plus direct dans lequel les cellules bactériennes interagissent avec les cellules hôtes pour injecter des gènes, des protéines ou des produits chimiques pour les systèmes hôtes. 3 Très souvent, le transfert de ces agents a des effets remarquables sur l'hôte, allant de la pathogenèse et la carcinogenèse d'accueillir l' évolution et l' adaptation. Il a été démontré que recombinatio conjugatifn augmente le taux d'adaptation de 3 fois dans les bactéries avec des taux de mutation élevés dans des conditions de stress environnemental. 4 En outre, la conjugaison est de loin la voie la plus commune à travers laquelle les gènes de résistance aux antibiotiques dans les souches bactériennes sont réparties. 5,6

Les micro-organismes ont développé des systèmes de sécrétion spécialisés pour soutenir le transfert de macromolécules à travers les membranes cellulaires; il y a actuellement 9 types de systèmes de sécrétion (TSSS) dans les bactéries Gram négatives qui ont été décrites: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, ainsi que le Sec (sécrétion) et Tat (deux-arginine translocation) voies. 7,8 Chaque type de système de sécrétion est divisé en différents sous - types, une nécessité en raison de la diversité des protéines et la spécificité des voies impliquées dans différentes souches bactériennes. Par exemple, dans le système de sécrétion de type IV (T4SS), les systèmes Ti et Cag facilitent le transport effecteur tandis que le F-plasmide, un R27nd pKM101 T4SSs faciliter le transfert d'un plasmide conjugatif. 7,9,10 Une compréhension détaillée des mécanismes par lesquels les organismes assemblent leurs systèmes de sécrétion respectifs de leurs protéines et composants partagent contenu cellulaire avec un destinataire ou leur environnement est un facteur important dans le développement de stratégies ciblées pour lutter contre les micro - organismes et les processus de pathogènes infection cellulaire.

Suite à la conjugaison bactérienne initiale d'identification dans E. coli par Lederberg et Tatum, 11 un grand nombre de plasmides conjugatifs et mobiles ont été identifiés et caractérisés. 12 Ces plasmides mobiles montrent gamme considérable est la taille (de 1 à plus de 200 kilobases (kb)), mais tous les plasmides mobiles contiennent un relaxase, qui reconnaît l'origine du transfert (ORIT) permettant ainsi la transmission du plasmide. les plasmides conjugatifs autres gènes codent pour l'assemblage d'un T4SS fonctionnel ainsi que d'un typeIV protéine de couplage. 12 Par exemple , le F 100 kb du plasmide de E. coli code pour l' ensemble des gènes conjugatifs dans une région 33,3 kB de transfert (tra). 13 Les gènes de la région tra du plasmide F encode les protéines qui facilitent la formation de pili, l' accouplement formation de paires (MPF), le transfert de l' ADN et des fonctions d'exclusion pendant le transfert du plasmide conjugatif. 10,14,15 Un important corpus de connaissances est disponible pour conjugatif T4SSs, cependant détaillé des études structurales des protéines et des complexes de conjugaison ne sont plus récemment devenues disponibles. 16-28

Pour assembler une vue d'ensemble du processus de conjugaison, un couplage des études structurales détaillées mutationnelle analyses de protéines de transfert de conjugaison est nécessaire. Ceci peut être réalisé grâce à des essais d'accouplement de conjugaison. Pour le plasmide F, chaque protéine codée dans la région de tra joue un rôle dans la co F médiationnjugation; par conséquent, le knock - out / suppression d'un gène de transfert abolira la capacité de conjugaison de la cellule (Figure 1). Tandis que les petits plasmides mobiles sont plus propices à la procédure d'effacement standard, pour les plasmides de conjugaison plus grandes telles que F, knock-out de gène sont plus facilement atteints par l'intermédiaire d'une recombinaison homologue dans laquelle le gène cible est remplacée par une transporter un gène de résistance aux antibiotiques distincts. Dans le protocole actuel, nous employons la recombinaison homologue pour remplacer un gène de transfert d'intérêt avec le chloramphénicol acétyltransférase (CAT) dans le 55 kb F plasmide dérivé pOX38-Tc; 29,30 plasmide résultant knock-out, pOX38-Tc :: cm Δgene facilite la résistance à la présence de chloramphénicol (Cm) dans les milieux de croissance. Les cellules donneuses qui hébergent pOX38-Tc :: cm sont Δgene incapable d'affecter le transfert d'ADN par conjugaison / accouplement comme observé par l'utilisation d'un essai d'accouplement; l'efficacité de l'accouplement d'une cellule donneuse pOX38-Tc :: Δgene cm et une normale recipient diminuera ou, plus souvent, être aboli. transfert conjugatif du pOX38-Tc Δgene :: Cm plasmidique peut être restauré par un petit plasmide de récupération hébergeant le gène de transfert ciblé. Ce plasmide de récupération peut être celle qui fournit une expression constitutive, tels que le plasmide pK184 (pK184 gène), 31 ou qui fournit une expression inductible tant que ce plasmide cible correctement le gène à l'emplacement approprié dans la cellule (cytoplasme ou le périplasme). Par conséquent, dans des essais d'accouplement entre ce nouveau donneur (hébergeant pOX38-Tc Δgene plasmides :: Cm + pK184 gène) et une cellule receveuse, l'efficacité de l'accouplement est prévu pour rendre à peu près celle d'un test d'appariement donneur-receveur normal. Ce système une permet de sonder la fonction du gène éliminé par la génération d'une série de constructions pK184 gène (délétions ou mutations ponctuelles) et en testant la capacité de chaque construction pour rétablir la capacité d'accouplement de la pOX38-Tc Δgene :: cm recel cellule donneuses.

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Protocol

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1. Génération de constructions d'ADN

  1. Conception Oligomères pour recombinaison homologue du gène cible
    1. Concevoir une seule 55-72 pb oligomère avant la manière suivante: (a) prendre une longue séquence de nucleotides 19 à 32 pb qui est homologue à une séquence d'ADN dans la région 10 à 100 pb en amont du site de l'extrémité 5 'du début du gène de la chloramphénicol acétyltransférase dans le pBAD33 plasmide commercial, 32 et (b) sélectionner une longue séquence nucléotidique homologue 36-54 pb à une région 10-150 pb en aval du site de 5 'de début du gène cible d'intérêt.
      1. Join 'extrémité de la séquence nucléotidique choisi en (b) à l'extrémité 5' de la 3 fin de la séquence nucléotidique choisi en (a), donnant ainsi une seule longue 55-72 oligomère avant.
    2. Concevoir une seule 55-72 pb inverse oligomère comme suit: (a) prendre une longue séquence de nucleotides 19 à 32 pb qui est homologue à une séquence d'ADN dans la région 10 à 100 pb en avalde l'extrémité 3 'du gène de la chloramphénicol dans le pBAD33 plasmide commercial, et (b) sélectionner une longue séquence nucléotidique homologue 36-54 pb à une région à l'intérieur de 10 à 150 pb en amont du site 3' du gène cible d'intérêt final .
      1. Joignez-vous à «fin de séquence nucléotidique choisi dans (b) à la 5 '3 fin de la séquence nucléotidique choisi dans (a) pour en faire un seul oligomère.
      2. Copiez cet oligomère dans un logiciel de bioinformatique disponible et convertir la séquence dans son complément inverse. Cela donnera une seule 55-72 pb oligomère inverse.
    3. L' utilisation d' un programme d' oligo-analyseur disponible, vérifiez que les oligomères de recombinaison ont une teneur en GC entre 40-60%, faible en épingle à cheveux température de fusion (T m), à faible autonomie et l 'hétéro-dimérisation T m. Commandez les amorces pour la synthèse et l'expédition de toute société de biotechnologie préférée.
  2. Amplification de la CAT Cassette de pBAD33 (Cm R ) Le plasmide utilisant Oligomères Conçu pour Pairing Homologue
    1. Cultivez un (O / N, 16-18 h) culture d'une nuit de cellules DH5a abritant le plasmide pBAD33 dans un bouillon Lysogénie stérile (LB) avec 20 pg / ml de chloramphénicol (Cm) avec agitation à 200 tours par minute et 37 ° C.
    2. Centrifugeuse 6-8 ml de la culture O / N à la température ambiante, 5000 g pendant 3 min. Décanter le surnageant et on extrait le plasmide pBAD33 à partir du culot en utilisant un mini-kit de préparation de plasmide (tableau Materials) et le protocole du fabricant.
    3. Faites un condensé de l'ADN plasmidique pBAD33 en ajoutant ce qui suit dans un tube stérile dans l'ordre donné: volume approprié d'eau distillée deux fois (ddH 2 O) à un volume final de 50 ul, volume de 1 pg de pBAD33 plasmide, 5 ul 10x un tampon de réaction enzymatique, et 0,5 ul d'enzyme de restriction Aval (RE). Mélanger doucement par pipetage et laisser la réaction se déroule pendant 1 h à 37 ° C. Heat inactiver la réaction pendant 20 minutes (min) à 80° C. Conserver les échantillons à -20 ° C pour plus de 24 h pour minimiser la dégradation collant fin.
    4. Préparer un agarose à 1,2% de séparation du gel en mélangeant 1,2 g d'agarose avec 100 ml de TAE 1X (Tris 40 mM, pH 8,5, de l'acide acétique 20 mM, EDTA 1 mM) de tampon dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml. Chauffer et agiter pour dissoudre complètement dans un four micro-ondes. Arrêter le chauffage immédiatement lorsque le liquide commence à bouillir et agiter le flacon.
      1. Refroidir l'agarose liquide pendant 3 min à température ambiante en agitant, ajouter 2 pi de 10 mg / ml de bromure d'éthidium et agiter pour mélanger. Verser de l'agarose dans un plateau de gel à l'aide d'un peigne de puits et de lui permettre de se solidifier pendant 1 h à température ambiante. gels Conserver à 4 ° C pendant jusqu'à 2 jours dans un tampon TAE 1x.
    5. Mélanger chaque RE digérer à partir de 1.2.3 avec 0,2 volume d'ADN colorant de chargement (10 pi de colorant par 50 réaction ul) par pipetage. Charge 5 pi de 500 pg / mL échelle d'ADN dans le premier puits et la totalité du mélange RE digest-colorant dans un autre puits sur ungel garose. Utiliser 2-3 puits pour charger la totalité du volume réactionnel sur le gel.
      1. Exécuter le gel à peine immergé dans le tampon TAE 1X et fonctionnant à 45 à 50 V (4,5 à 5 V / cm) pendant 65 min dans un dispositif d'électrophorèse sur gel.
    6. En utilisant un boîtier UV et une lame de rasoir stérile, couper rapidement la bande de 2,8 kb correspondant à la séquence CAT du gel pour réduire au minimum l'exposition aux UV de l'ADN. Extraire l'ADN à partir de la tranche de gel découpée en utilisant un kit d'extraction de gel (tableau des matériaux) selon le protocole du fabricant.
      Remarque: Prenez soin de ne pas exposer la peau directement sous UV et de gérer le rasoir avec soin.
    7. Amplifier la cassette CAT extraite de 1,2,6 par réaction en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant les amorces conçues à 1,1 surplombs qui contiennent des homologues à la séquence du gène pour permettre la recombinaison homologue. Les réactions de PCR sont mis en place sur la glace en utilisant les directives du fabricant (tableau Matériaux) dans l'ordre suivant:
      1. Dans unetube stérile PCR, ajouter un volume approprié de ddH 2 O pour un volume final de 50 ul, suivi par 10 pi de tampon de PCR, 1 pi d'mM dNTP 10, 2,5 pi de 10 pM d' amorce avant, 2,5 pi de 10 pM Amorce , 1-25 ng de l'ADN matrice à partir 1.2.6 et 0,5 pi de 100 unités / ul d'ADN polymerase.
      2. Mettre en place un contrôle négatif qui porte les mêmes composants que ceux 1.2.7.1, mais à l'exception de l'ADN matrice. Utiliser un volume approprié de ddH 2 O au lieu de l' ADN matrice. Mettre en place un contrôle positif en utilisant l'ADN matrice et des amorces qui ont été prouvés pour travailler dans une réaction PCR, tels que ceux fournis comme témoin positif par le fabricant.
      3. Mélanger tous les contenus de réaction doucement par pipetage.
      4. Amplifier par PCR en utilisant les paramètres suivants: Dénaturation initiale pendant 30 s à 98 ° C, 30 cycles de dénaturation pendant 10 s à 98 ° C, l'hybridation des amorces pendant 20 s, extension pour 20 s par kilobase d'amplicon à 72 ° C et un ailettel'extension al pendant 10 min à 72 ° C. Conserver les échantillons à -20 ° C.
    8. Vérifiez la taille correcte de l'amplification par électrophorèse sur gel d'agarose (voir 1.2.4-1.2.5) en utilisant seulement 5 pi de chaque réaction. Purifier l'amplicon de PCR en utilisant un kit de purification PCR et le protocole du fabricant. Magasin ADN purifié à -20 ºC.
  3. Le plasmide de récupération pK184 gène
    1. Concevoir une amorce avant de commencer à partir de son extrémité 5 'et en allant vers l'extrémité 3' dans l'ordre suivant: (a) prendre 4 nucléotides aléatoires (une combinaison de adénine, thymine, guanine et cytosine) pour l'efficacité de clivage, attachés à (b) l'enzyme de restriction EcoRI (RE) séquence de site de coupure (GAATTC), suivie par (c) une longue séquence de nucléotides de 21 à 25 pb qui est homologue à l'extrémité 5 'du gène d'intérêt, y compris le codon d'initiation. Si le gène cible contient un site EcoRI, choisir un autre RE approprié à partir du site de clonage multiple de pK184.
    2. Concevoir une amorce inverse dans l'ordre suivant: (a) prendre 4 nucléotides aléatoires pour l'efficacité de clivage, suivie par (b) une séquence de site HindIII de coupe (AAGCTT) suivie (c) le 21-25 pb de complément inverse de la 3 'extrémité du gène d'intérêt, y compris le codon d'arrêt. Si le gène cible contient un site HindIII, choisir un autre RE dans le site de clonage multiple de pK184.
    3. Dans le cas des gènes codant pour des protéines périplasmiques, inclure une séquence de tête supplémentaire entre le site de RE et le codon de démarrage sur l'amorce sens.
    4. L' utilisation d' un oligo-analyseur disponible, vérifiez que les amorces ont une teneur en GC entre 40-60%, en épingle à cheveux à faible T m, faible autonomie et l 'hétéro-dimérisation T m. Commandez les amorces pour la synthèse.
    5. Cultiver un rapport O / N culture de cellules DY330R pOX38-Tc dans du milieu LB stérile contenant 10 pg / ml de tetracycline (Tc) en agitant à 32 ° C et 200 tours par minute. Centrifugeuse 6-8 ml de la culture O / N à la température ambiante, 5000 g pendant 3 min. Décanter lesurnageant et on extrait l'ADN plasmidique à partir de la pastille en utilisant un mini-kit de préparation de plasmide (tableau Materials) et le protocole du fabricant.
    6. Amplifier le plein gène d'intérêt avec les amorces de 1.3.1-1.3.5 utilisant pOX38-Tc comme modèle (voir 1.2.7.1-1.2.7.3).
    7. Vérifiez la taille correcte de l'amplification par électrophorèse sur gel d'agarose (voir 1.2.4-1.2.5) en utilisant seulement 5 pi de chaque réaction. Purifier l'ADN amplifié en utilisant un kit de purification PCR et le protocole du fabricant. Magasin ADN purifié à -20 ° C.
    8. Faites un double digestion de l'ADN à la fois pK184 plasmidique disponible dans le commerce et le gène amplifié (de 1.3.7.), Par adjonction, dans un tube stérile dans l'ordre donné: volume approprié de ddH 2 O à un volume final de 50 pi , volume 1 pg de plasmide pK184, 5 pi de tampon de réaction 10X de l'enzyme, et 1 ul de chaque Eco RI et Hind III.
      1. Mélanger doucement par pipetage et laisser la réaction se déroule pendant 1 hà 37 ºC. Inactivent la chaleur de la réaction pendant 20 min à 80 ° C. Conserver les échantillons à -20 ° C pour plus de 24 h pour minimiser la dégradation collant fin.
        Remarque: Le type de restriction nucléase utilisé ici dépend du site de restriction nucléase qui a été conçu dans les amorces dans les étapes 1.3.1 et 1.3.2.
      2. En tant que contrôle positif, mettre en place les digestions simples du plasmide pK184 en préparant la même réaction que dans 1.3.8, sauf ajouter qu'un seul des REs à un tube de réaction. Pour ce faire, séparément avec les deux REs.
    9. Exécuter les digestions sur un gel d'agarose à 1,2% en utilisant des protocoles 1.2.4-1.2.5 extrait l'ADN double fragments de digestion à la fois pK184 et le gène d'intérêt selon l'étape 1.2.6.
    10. Ligaturer l'insert de gène dans le vecteur d'pK184 en ajoutant des composants dans un tube stérile dans l'ordre suivant: 2 pi de 10x T4 DNA Ligase Buffer, un total de 100 ng d'ADN composé d'un 1: vecteur 3: insérer (pK184: gène) rapport, ddH 2 O jusqu'à unvolume total de 20 pl et 1 ul d'ADN ligase de T4. Comme témoin négatif, mis en place une réaction similaire en utilisant 100 ng de vecteur sans le gène d'insertion.
      1. Mélanger délicatement tous les contenus de réaction en utilisant une micropipette et incuber pendant 30 min à 25 ° C. Inactivent la chaleur de la réaction de ligature pendant 10 min à 65 ° C, puis placer sur la glace.
    11. Alors que sur la glace, ajouter 15 ul du pK184 gène réaction de ligature de l'étape 1.3.10 à 100 uL de cellules DH5a chimiquement compétentes dans un tube stérile de 1,5 ml. Mélanger doucement par pipetage et incuber sur de la glace pendant 10 min. Faites de même pour l'échantillon témoin négatif. Pour un contrôle positif, utilisez 20-100 ng d'un plasmide tel que pBAD33 et la transformer en 50 cellules ul de DHα.
    12. transférer directement les échantillons de la glace dans un bain d'eau C 42 ° et incuber pendant 90 secondes. Cela fournit aux cellules un choc thermique et leur permet l'absorption de l'ADN plasmidique.
    13. La place des cellules de retour sur la glace pour une autre5 min, puis ajouter 900 pi de LB. stérile Incuber à 37 ° C pendant 1 h en agitant à 125 rpm.
    14. Aliquoter un volume de 100 pi d'échantillon de chaque réaction de ligature dans 01/03/13 sur une plaque de gélose contenant 50 pg / ml de kanamycine (Km) et étaler les cellules à l'aide d'une spatule stérile. La plaque de contrôle positif devrait avoir des antibiotiques appropriés. Garder la zone stérile et travailler à proximité d'une flamme. Incuber la plaque à l'envers à 37 ° C pendant la nuit.
    15. En utilisant une pipette ou une boucle stérile, récolter une seule colonie distincte de cellules et ensemencer mL stérile LB 20 avec 50 pg / ml Km. Garder la zone stérile et travailler à proximité d'une flamme. Cultiver les cellules O / N à 37 ° C sous agitation à 200 tours par minute.
    16. Faire 3-5 stocks de glycérol des cellules DH5a transformées en mélangeant 500 ul de la culture O / N avec 500 ul de 100% de glycerol stérile (50% final v / v) dans des tubes stériles cryoprotecteurs. Conserver à -80 ° C.
    17. En outre centrifugeuse 6-8 ml de O / N culture à température ambiante, 5,000 xg pendant 3 min. Décanter le surnageant et on extrait le gène pK184 récupération du plasmide à partir de la pastille en utilisant un mini-kit de préparation de plasmide (tableau Materials) et le protocole du fabricant.
  4. pK184 - Mutants géniques
    Note: Amorces conçus pour des délétions, insertions et / ou des mutations ponctuelles peuvent être facilement générés en utilisant les outils disponibles en ligne des fabricants.
    1. Concevoir chaque amorce sens en choisissant une longue séquence de nucleotides 18 à 32 pb qui est homologue à l'extrémité 5 'du gène d'intérêt, y compris le codon d'initiation. Concevoir des amorces telles que chaque amorce directe recuits 30-180 bp en aval du précédent, ce qui entraîne des mutants de délétion dépourvus de fragments de peptides N-terminaux de longueurs appropriées.
    2. Concevoir une amorce inverse en sélectionnant une longue séquence de nucleotides 18 à 32 pb qui est homologue à l'extrémité 3 'du gène d'intérêt, y compris le codon d'arrêt. Copiez cette amorce dans unny programme de bioinformatique disponibles et convertir la séquence dans son complément inverse. Ceci est l'amorce inverse.
      1. Dans le cas des gènes codant pour des protéines périplasmiques, la conception de l'amorce inverse qui est le complément inverse de l'extrémité d'une séquence de tête qui flanque l'extrémité 5 'de la 3 du gène et est nécessaire pour la localisation correcte du produit de protéine dans le périplasme.
    3. L' utilisation d' un programme d' oligo-analyseur disponible, vérifier que les amorces de deletion ont une teneur en GC entre 40-60%, faible en épingle à cheveux température de fusion (T m), à faible autonomie et l 'hétéro-dimérisation T m. Commandez les amorces pour la synthèse et l'expédition de toute société de biotechnologie disponible.
    4. Utilisation de la construction pK184-gène obtenu dans le protocole 1.3 comme matrice et les lignes directrices en 1.2.7-1.2.8, PCR amplifient les constructions de deletion avec les amorces conçues dans les étapes 1.4.1-1.4.3 pour générer pK184 gène amplicons Dx . Magasin ADN amplifié unt -20 ° C.
    5. Ligaturer la construction amplifiée en utilisant toute trousse de mutagenèse (Tableau Matériaux).
    6. Transformez chacun des ligation de Dx pK184 gène séparément dans des cellules DH5a chimiquement compétentes en utilisant un protocole de choc thermique standard (voir 1.3.11-1.3.13).
    7. Aliquoter un volume de 100 pi d'échantillon de chaque réaction de ligature dans 01/04/12 sur une plaque de gélose contenant 50 pg / ml de Km et étaler les cellules à l'aide d'une spatule stérile. Garder la zone stérile et travailler à proximité d'une flamme. Incuber la plaque à l'envers à 37 ° C pendant la nuit.
    8. À l'aide d'une pipette stérile ou une boucle, la récolte d'une seule colonie distincte de cellules et inoculer à 20 ml de milieu LB stérile avec 50 pg / ml de Km. Garder la zone stérile et travailler à proximité d'une flamme. Cultiver les cellules O / N à 37 ° C sous agitation à 200 tours par minute.
    9. Faire 3-5 stocks de glycérol des cellules DH5a transformées en mélangeant 500 ul de la culture O / N avec 500 pi de stériles 100% de glycérol (finale 50% v / v) dans des tubes stériles cryoprotecteurs. Conserver à -80 ° C.
    10. Centrifugeuse 6-8 ml de la culture O / N à la température ambiante, 5000 g pendant 3 min. Décanter le surnageant et on extrait le gène pK184 AX construction plasmidique à partir de la pastille en utilisant un mini-kit de préparation de plasmide (tableau Materials) et le protocole du fabricant. ADN Conserver à -20 ° C.

2. Génération de pOX38-Tc Δgene :: Cm Souches

  1. DY330R pOX38-Tc Δgene :: cm KOs
    1. Préparer un rapport O / N culture de cellules DY330R pOX38-Tc dans 10 ml stérile LB contenant 10 pg / ml de Tc. Cultiver la culture O / N à 32 ° C et 200 rpm.
    2. Faire une dilution 1:70 de la culture O / N dans 20 ml de LB. frais stérile Faire croître les cellules à 32 ° C jusqu'à ce que la croissance en phase mi-log (DO à 600 nm de 0,4 à 0,6).
    3. Transférer 10 ml de la culture dans un flacon stérile et laisser incuber à 42 ° C pendant 15 min à 150 tours par minute dans une secousse d'eau bae. Cela va induire l'expression des protéines de recombinaison spécifiques dans DY330R.
    4. Refroidir la culture dans un bain d'eau glacée pendant 10 minutes. Préparer les cellules électrocompétentes comme suit.
      1. Transférer les cellules réfrigérées dans des tubes coniques pré-réfrigérés et centrifuger à 4000 xg pendant 7 min à 4 ° C. Tous les tubes et pipettes à utiliser dans les étapes à venir doivent être placés à 4 ° C ou sur de la glace pour refroidir.
      2. Retirer le surnageant et doucement remis en suspension les cellules dans 1 ml de glace froide ddH 2 O. Ajouter un autre 30 ml de glace froide ddH 2 O.
      3. Centrifuger les cellules (4000 g, 7 min, 4 ° C), jeter le surnageant et doucement remis en suspension les cellules dans 1 ml de glace froide ddH 2 O.
      4. Transférer les cellules remises en suspension dans pré-réfrigérées 1,5 ml microtubes et centrifuger à 15 000 xg pendant 1 min à 4 ° C.
      5. Remis en suspension doucement le culot dans 200 pi de glace froide ddH 2 O et aliquote dans 50 volumes ul. Electrocompetecellules nt peuvent être conservés à -80 ° C
    5. Ajouter 300 ng de la cassette de CAT amplifié de 1,2 dans 50 ul de cellules DY330R pOX38-Tc électrocompétentes tout en mélangeant sur la glace, doucement par pipetage de haut en bas. Répétez cette étape en utilisant non modifié plasmide pBAD33 comme témoin positif.
    6. Transférer les cellules dans un (-20 ° C) de 1 mm cuvette d'électroporation prérefroidie. Électroporation les cellules à 1,8 kV avec une constante de temps de 5,5 ms, en utilisant une électroporation. Immédiatement après l'application de l'impulsion, diluer les cellules avec 1 ml de SOC médias et transfert à un tube de microcentrifugation frais. Incuber les cellules à 32 ° C pendant 2 h.
    7. Aliquote de 100 pi de chaque échantillon sur des plaques d'agar-agar contenant 10 pg / ml de Tc et 20 pg / ml de Cm et la propagation à l'aide d'une spatule stérile. Garder la zone stérile et travailler à proximité d'une flamme. Incuber la plaque à l'envers à 32 ° C pendant la nuit pour sélectionner les recombinants réussis. La cassette de CAT introduit dans la cellule va subir un nouvel homologuecombinaison avec le gène d'intérêt et de créer le DY330R pOX38-Tc Δgene :: cm (RifR, TcR, CmR) clone.
      Remarque: il est important de cultiver des cellules DY330R à 32 ° C, à l'exception de 15 min à induction à 42 ° C de l'étape 2.1.3 avant de générer des cellules électrocompétentes, la croissance prolongée à des températures élevées, les risques de mort cellulaire due à la production de produits toxiques de la p l opéron responsable des fonctions de recombinaison dans DY330R. 33,34
    8. Préparer un rapport O / N DY330R pOX38-Tc :: cm Δgene cellules en récoltant une colonie unique distincte de cellules avec une pipette ou une boucle stérile et inoculer un milieu stérile, 20 ml de LB avec 10 pg / ml de Tc et 20 pg / ml Cm. Garder la zone stérile et travailler à proximité d'une flamme. Cultiver les cellules O / N à 32 ° C sous agitation à 200 tours par minute.
    9. Faire 3-5 stocks de glycérol de l'O / N en mélangeant 500 ul de la culture O / N avec 500 pi de 100% stérile glycerol (définitif 50% v / v) dans des tubes stériles cryoprotecteurs. Conserver à -80 ° C.
    10. Centrifugeuse 6-8 ml de la culture O / N à la température ambiante, 5000 g pendant 3 min. Décanter le surnageant et extraire le pOX38-Tc Δgene :: Cm construire à partir du culot en utilisant un mini-prep kit de plasmide (tableau Materials) et le protocole du fabricant; stocker l'ADN purifié à -20 ° C.
    11. Effectuer un test d'accouplement conjugatif utilisant XK1200 cellules comme le destinataire pour confirmer la perturbation de la conjugaison par KO du gène selon le protocole 3.1.
  2. DY330R pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184 gène
    1. Transformer des cellules DY330R pOX38-Tc Δgene :: cm électrocompétentes avec 300 ng de la construction pK184 gène par électroporation selon les étapes 2.1.4-2.1.7. Tous les milieux sélectifs doivent contenir 20 pg / mL Cm et 50 pg / ml Km. Incuber à 32 ° C. Le plasmide de récupération dans les cellules électroporées va maintenant restaurer la fonction du gène assommé dans le DY330R pOX38-Tc Δgene :: cellules cm.
    2. Préparer un rapport O / N DY330R pOX38-Tc :: cm + Δgene pK184 gènes des cellules recombinées en récoltant une colonie unique distincte des cellules avec une pipette ou une boucle stérile et inoculer un milieu stérile, 20 ml de LB avec 20 ug / ml de Cm et 50 pg / ml de Km. Garder la zone stérile et travailler à proximité d'une flamme. Cultiver les cellules O / N à 32 ° C sous agitation à 200 tours par minute.
    3. Faire 3-5 stocks de glycérol de l'O / N en mélangeant 500 ul de la culture O / N avec 500 ul de 100% de glycerol stérile (50% final v / v) dans des tubes stériles cryoprotecteurs. Conserver à -80 ° C.
    4. Également effectuer le protocole 3.1 pour générer XK1200 pOX38-Tc Δgene :: Cm cellules recombinantes.
  3. XK1200 pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184 gène et Mutants
    1. Préparer les cellules électrocompétentes XK1200 pOX38-Tc Δgene :: cm (de l'étape 2.2.4).
    2. Séparément électroporation 300 ng de pK184 gène ou pK184 gène plasmides mutants dans 50 ul de electrocompetent XK1200 pOX38-Tc Δgene :: Les cellules Cm comme par étapes 2.1.4-2.1.7. Tous les milieux sélectifs doivent contenir de l'acide 10 pg / mL nalidixique (Nal), 20 pg / ml Cm, et 50 pg / ml Km et être incubées à 37 ° C.
    3. Préparer un rapport O / N XK1200 pOX38-Tc Δgene :: cm + pK184 gènes des cellules recombinées en récoltant une colonie unique distincte des cellules avec une pipette ou une boucle stérile et inoculer un milieu de 20 ml stérile LB avec Nal, 20 pg / ml cm et 50 pg / ml de Km. Garder la zone stérile et travailler à proximité d'une flamme. Cultiver les cellules O / N à 37 ° C sous agitation à 200 tours par minute.
    4. Faire 3-5 stocks de glycérol de l'O / N en mélangeant 500 ul de la culture O / N avec 500 ul de 100% de glycerol stérile (50% final v / v) dans des tubes stériles cryoprotecteurs. Conserver à -80 ° C.

3. conjugatif Mating Assays

  1. Conjugatif Mating pour générer XK1200 pOX38-Tc Δgene :: cm Cellules
    1. Préparer une solution stérile de 20 ml LB O / N culture de DY330R pOX38-Tc Δgene :: cellules Cm + pK184 gène à l'aide d'une pipette ou une boucle stérile pour inoculer un mL stérile LB 20 contenant 20 pg / ml Cm et 50 pg / ml Km avec un stock de glycérol ou d'une colonie unique sur une plaque de gélose. Cultivez à 32 ° C sous agitation à 200 tours par minute. Préparer le même pour XK1200 cellules dans 20 ml stérile LB avec 10 pg / ml Nal, croître à 37 ° C.
    2. Faire des dilutions de 1:70 de chaque culture séparément dans 2 ml de LB stérile ayant le même contenu d'antibiotiques; ajouter du glucose à une concentration finale de 100 mM à toutes les cellules du donneur. Cultiver les cellules à la phase mi-log (DO 600 0,5-0,7) à 37 ° C sous agitation à 200 tours par minute.
    3. Centrifugeuse (4000 xg pendant 5 min à 4 ° C) pour sédimenter les cellules, éliminer le surnageant, laver une fois par le froid LB stérile pour éliminer les antibiotiques, et remettre les cellules dans 2 ml froid LB. stérile
    4. Aliquoter 100 pi de chaque culture dans 800 pi de milieu LB stériles et leur permettre de s'accoupler à 32 ° C pendant 1 h sans agitation.
    5. Vortex les cellules pendant 30 s pour perturber les paires d'accouplement et les placer sur de la glace pendant 10 minutes pour empêcher la reproduction.
    6. Aliquote de 100 ul du mélange de cellules sur une plaque de gélose contenant 10 pg / ml de Nal et 20 pg / ml de Cm pour sélectionner les cellules XK1200 pOX38-Tc Δgene :: cm. Répartir les cellules à l'aide d'un épandeur stérile. Garder la zone stérile et travailler à proximité d'une flamme. Incubé la plaque O / N à 37 ° C à l'envers.
    7. Récolter une seule colonie du gène nouveau XK1200 pOX38-Tc Δ :: Cm souche knockout en utilisant une pipette ou une boucle stérile et croître dans LB stérile avec 20 pg / mL Cm, O / N à 37 ° C sous agitation à 200 tours par minute. Faire 3-5 stocks de glycérol de l'O / N en mélangeant 500 ul de la culture O / N avec 500 ul de 100% de glycerol stérile (50% final v / v) dans des tubes stériles cryoprotecteurs. Conserver à -80 ° C.
      Remarque: Les cellules résultantes peuvent maintenant être compétentes pour la transformation avec les constructions pK184-géniques (protocoles 1.3 et 1.4) pour le culessing le gène et ses mutants sur la capacité à récupérer le transfert conjugatif dans le protocole 3.2.
  2. Conjugatif Mating Assay de XK1200 donateurs aux bénéficiaires de MC4100
    1. Préparer un O / N culture de XK1200 pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184 gène cellules dans 20 ml de LB stérile avec 20 ug / Cm ml, 50 pg / ml Km et MC4100 cellules dans 5 ml LB avec 50 pg / ml de streptomycine (Sm) en utilisant des cellules à partir d'un stock de glycérol ou d'une colonie unique sur une plaque de gélose et stérile une pipette ou d'une boucle. Cultivez cultures à 37 ° C avec 200 rpm agitation.
    2. Effectuer des dilutions 1:70 de chaque culture O / N séparément dans 2 ml de LB stérile avec les mêmes antibiotiques. Ajouter du glucose à une concentration finale de 100 mM à toutes les cellules du donneur. Cultiver les cellules à la phase mi-log (DO 600 0,5-0,7) à 37 ° C sous agitation à 200 tours par minute.
    3. Centrifugeuse (4000 xg pendant 5 min à 4 ° C) pour sédimenter les cellules, éliminer le surnageant, laver une fois par le froid LB stérile pour éliminer antibiotics, et remettre les cellules dans 2 ml de LB. stérile froide
    4. En double, aliquote de 100 pi de chaque culture dans 800 pi de milieu LB stériles et leur permettre de s'accoupler à 37 ° C pendant 1 h sans agitation.
    5. Vortex les cellules pendant 30 s pour perturber les paires d'accouplement et les placer sur la glace pendant 10 min pour empêcher la reproduction.
    6. En utilisant les cultures mi-log de l' étape 3.2.2 et LB frais stérile, préparer 6 dilutions en série des cellules du donneur et du receveur de 10 -2 à 10 -7.
    7. Sur chacune des deux moitiés d'une plaque de gélose contenant 10 pg / ml de Nal, 20 pg / ml de Cm et 50 pg / ml de Km, repérer aliquotes de 10 pi de chaque dilution de XK1200 cellules du donneur, comme le montre la figure 2. Répéter les dilutions des cellules MC4100 receveur sur des plaques de gélose contenant 50 pg / ml Sm. Incuber les plaques O / N à 37 ° C.
    8. En utilisant le mélange de l' étape 3.2.5 tourbillonnement et LB stérile frais, la préparation de 6 dilutions (10 -2 à 10 -7 ) Des transconjugants. Sélectionner pour le transconjugant cellules MC4100 pOX38-Tc :: cm Δgene en repérant aliquotes de 10 pi de chaque dilution sur chacune des moitiés de plaques de gélose contenant 50 pg / ml de Sm et 20 pg / ml de Cm, comme dans la figure 2. Répétez l'opération pour les deux mélanges en double. Garder la zone stérile et travailler à proximité d'une flamme. Incuber les plaques O / N à 37 ° C.
    9. Déterminer l'efficacité d'accouplement de chaque produit d'assemblage tel que décrit dans le protocole 3.3.
    10. Répétez ce protocole pour tous les plasmides de récupération afin d'évaluer l'effet d'une mutation particulière sur l'efficacité de la conjugaison.
  3. Calcul de l' efficacité Mating
    1. Compter le nombre de colonies de la même spotting de dilution pour chaque donneur, receveur et cellules transconjugants sur leurs plaques respectives.
    2. Compter les colonies de bénéficiaires pour tester toute partialité qui aurait pour résultat d'avoir un plus grand nombre de transconjugants que les bénéficiaires à cette dilution donnée.
    3. Calculez l'efficacité de l'accouplement comme étant le nombre de colonies de transconjugants divisé par le nombre de colonies de donneurs. Multiplier par 100 pour obtenir la valeur d'efficacité pour 100 cellules du donneur.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le procédé de conjugaison bactérienne F induite par le plasmide est un processus coordonné qui implique des protéines de transfert dans la région de tra du F-plasmide qui assemble un T4SS pour faciliter la synthèse du pili et le transfert d'ADN par conjugaison. La protéine TRAF (GenBank # BAA97961; UniProt ID P14497) est nécessaire pour la formation conjugatif F-pili. 10,14,35 - 37 La protéine contient un domaine semblable à la thiorédoxine C-ter...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

processus de conjugaison bactérienne fournit un moyen par lequel les bactéries peuvent se propager des gènes offrant un avantage évolutif pour la croissance dans des environnements difficiles, tels que la propagation de marqueurs de résistance aux antibiotiques. Étant donné que la plupart des plasmides de conjugaison sont si grandes, 12 des études fonctionnelles sur les protéines impliquées dans l' assemblage du dispositif de transfert par mutation des gènes cibles sur le plasmide conjugatif se sont diffi...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche a été soutenue par une subvention à la découverte des sciences et en génie du Conseil naturel du Canada (CRSNG).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GeneJet Plasmid Mini-Prep KitFisher ScientificK0503
Kit d’extraction de gel GeneJetFisher ScientificK0692
Kit de purification PCR GeneJetFisher Scientific K0702
Q5 Kit de mutagénèse dirigée NewEngland BiolabsE0554S
Échelle d’ADN à large gammeNew England BiolabsN0303A
Boîtes de PétriFisher ScientificFB0875713
ÉlectroporateurEppendorf4309000027
Les cuvettes d’électroporationFisher ScientificFB101ont un espace de 1 mm.
Enzymes
AvaINew England BiolabsR0152S
EcoRINew England BiolabsR0101S
HindIIINew England BiolabsR0104L
NdeINew England BiolabsR0111S
Phusion DNA PolymeraseNew England BiolabsM0530L
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202S
DpnINew England BiolabsR0176S
AntibiotiquesConcentrations finales
Chloramphénicol (cm)Fisher ScientificBP904-10020 µ ; g/mL
de Kanamycine (Km)BioBasic Inc.DB028650 et micro ; g/mL
Acide nalidixique (Nal)Sigma-AldrichN8878-25G10 & micro ; g/mL
de rifampicine (Rif)Calbiochem55730320 & micro ; g/mL
de tétracycline (Tc)Fisher ScientificBP912-10010 & micro ; g/mL
de streptomycine (Sm)Fisher ScientificBP910-5050 & micro ; g/mL

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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