Conjugatif Mating Assays pour l&#39;analyse des protéines de transfert impliqués dans Conjugaison bactérienne spécifique à la séquence

Fettah Erdogan; Cristina Lento; Ayat Yaseen; Roksana Nowroozi-Dayeni; Sasha Kheyson; Gerald F. Audette

doi:10.3791/54854

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Article de méthode

Conjugatif Mating Assays pour l'analyse des protéines de transfert impliqués dans Conjugaison bactérienne spécifique à la séquence

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DOI :

10.3791/54854

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4 janvier 2017

Fettah Erdogan¹ , Cristina Lento¹ , Ayat Yaseen¹ , Roksana Nowroozi-Dayeni¹ , Sasha Kheyson¹ , Gerald F. Audette¹^,²

¹Department of Chemistry, York University, ²The Centre for Research on Biomolecular Interactions, York University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour inactiver un gène d’intérêt impliqué dans la conjugaison plasmidique et analysons ensuite l’impact de son absence à l’aide de tests d’accouplement. La fonction du gène est explorée plus en détail dans une région spécifique de sa séquence à l’aide de délétions ou de mutations ponctuelles.

Résumé

Le transfert de matériel génétique par conjugaison bactérienne est un processus qui se déroule via des complexes formés par des protéines de transfert spécifiques. Chez Escherichia coli, ces protéines de transfert constituent une machinerie de transfert d’ADN connue sous le nom de formation de paires d’accouplement, ou complexe de transfert d’ADN, qui facilite le transfert conjugatif de plasmides. L’objectif de cet article est de fournir une méthode qui peut être utilisée pour déterminer le rôle d’une protéine de transfert spécifique impliquée dans la conjugaison à l’aide d’une série de délétions et/ou de mutations ponctuelles en combinaison avec des tests d’accouplement. Le gène cible est inactivé sur le plasmide conjugatif et est ensuite fourni en trans par l’utilisation d’un petit plasmide de récupération hébergeant le gène cible. Les mutations affectant le gène cible sur le plasmide de récupération peuvent révéler des informations sur les aspects fonctionnels de la protéine cible qui entraînent l’altération de l’efficacité de l’accouplement des cellules donneuses hébergeant le gène muté. Les modifications de l’efficacité de l’accouplement donnent un aperçu du rôle et de l’importance de la protéine de transfert particulière, ou d’une région de celle-ci, dans la facilitation du transfert conjugatif de l’ADN. Le couplage de cet essai d’accouplement avec des études structurales tridimensionnelles détaillées permettra de comprendre complètement la fonction de la protéine de transfert conjugative et de fournir un moyen d’identifier et de caractériser les régions d’interaction protéine-protéine.

Introduction

Le transfert de gènes et de protéines au niveau des micro-organismal joue un rôle central dans la survie des bactéries et de l'évolution ainsi que les processus d'infection. L'échange d'ADN entre les bactéries ou entre une bactérie et une cellule peut être obtenue par transformation, conjugaison ou transduction du vecteur. ^1,2 Conjugaison est unique en comparaison à la transformation et la transduction en ce que pendant la conjugaison entre les bactéries Gram-négatives telles que Escherichia coli, le transfert d'ADN a lieu de façon contrôlée du donneur dans lequel un système complexe macromoléculaire relie les cellules du donne....