Ce protocole décrit comment évaluer l'expression d'un large éventail de gènes au niveau clonal. Unicellulaire RT-qPCR produit des résultats très fiables avec une forte sensibilité pour des centaines d'échantillons et les gènes.
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Article de méthode
Unicellulaire Gene Expression utilisant Multiplex RT-qPCR à Caractériser Hétérogénéité des rares populations lymphoïdes
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'expression des gènes hétérogénéité est une caractéristique intéressante pour enquêter dans les populations lymphoïdes. L'expression des gènes dans ces cellules varie au cours de l'activation cellulaire, le stress, ou la stimulation. L' expression du gène de multiplexage unicellulaire permet l'évaluation simultanée de plusieurs dizaines de gènes 1, 2, 3. Au niveau d'une seule cellule, l' expression des gènes multiplex détermine la population hétérogénéité 4, 5. Il permet la distinction de l'hétérogénéité de la population en déterminant à la fois le mélange probable de stades précurseurs diverses entre les cellules matures et aussi la diversité des réponses cellulaires à des stimuli.
Cellules lymphoïdes innées (CIT) ont récemment été décrit comme une population de effecteurs innées de la réponse immunitaire 6, 7. Dans ce protocole, l'hétérogénéité des cellules de la CIT, ilcompartiment Patic est étudiée au cours de l'homéostasie.
Actuellement, la technique la plus largement utilisée pour évaluer l'expression du gène est RT-qPCR. Cette expression génétique méthode mesure seul gène à la fois. En outre, cette méthode ne permet pas d'estimer l'hétérogénéité de l'expression génique, étant donné que plusieurs cellules sont nécessaires pour un test. Cela conduit à la mesure de l'expression du gène moyen de la population. Lors de l'évaluation grand nombre de gènes, RT-qPCR devient une durée de vie, et la méthode d'échantillonnage consommant reagent-. Par conséquent, les compromis limitent le nombre de gènes ou de populations de cellules qui peuvent être évalués, ce qui augmente le risque de manquer l'image globale.
Ce mémoire décrit multiplex unicellulaire par RT-PCR quantitative peut être utilisée pour surmonter ces limitations. Cette technique a bénéficié de récentes avancées technologiques microfluidique 1, 2. Les réactions qui se produisent dans les puces multiplex RT-qPCR ne sont pas excEED niveau-nanolitre. Par conséquent, l'expression des gènes de cellules isolées, ainsi que l'expression des gènes multiples simultanées peuvent être effectuées dans un reagent-, échantillon-, et d'une manière rentable. Il est possible de tester le gène cellulaire signature hétérogénéité au niveau clonal entre les sous - ensembles de cellules dans une population à différents stades de développement ou dans des conditions différentes de 4, 5. Travailler sur les populations rares avec un grand nombre de conditions au niveau d'une seule cellule est plus une restriction.
Introduction
Au cours des dernières années, les cellules lymphoïdes innées (de ILC) ont été de plus en plus étudié. En dépit de leur manque de récepteurs spécifiques d'un antigène, ils appartiennent à la lignée lymphoïde et représentent des sentinelles importantes pour l'homéostasie tissulaire et une inflammation. CVA sont actuellement classés en trois groupes en fonction de leur expression de combinaisons spécifiques de facteurs de transcription ainsi que sur leur capacité à produire des cytokines 6, 7.
ILC contribuent à de nombreuses situations homéostatiques et physiopathologiques dans divers organes via la production de cytokines spécifiques 8, 9. Pour être en mesure de comprendre le rôle de ces cellules, il est important de déterminer les différentes sous-populations de la CDI par organe et d'identifier leurs relations de développement. En outre, des phénomènes de plasticité entre les différents sous-ensembles ont été liés. En étudiant l'hétérogénéitédes cellules présentes dans un organe, il est possible de délimiter leur stade de maturation et de distinguer leurs fonctions spécifiques.
Pour illustrer la technique de multiplexage à cellule unique RT-qPCR, ILC hépatiques ont été choisis, avec un accent particulier sur leur hétérogénéité au sein du même groupe CIT (type 1 ILC) 10. Tout d'abord, grâce à l'utilisation de la cytométrie de flux, trois populations distinctes de la CDI ont été caractérisées dans le foie. Groupe 1 CIT représente environ 80% des effecteurs innés, tandis que les deux autres populations sont les populations ILC hépatiques rares (moins de 5% des effecteurs innés). Ces populations ont été triés à l'aide largement exprimées marqueurs de surface cellulaire des populations ILC. En conséquence, les populations triées ILC dans le foie semblent largement semblables l'un à l'autre.
Multiplex unique cellule RT-qPCR a émergé comme l' une des meilleures techniques pour enquêter rapidement sur l'hétérogénéité de ces populations 11 . Deux caractéristiques sont déterminées en prenant avantage du multiplex unicellulaire technique de RT-PCR quantitative. Tout d'abord, en regardant au niveau clonal, il est possible de récupérer l'expression génique spécifique d'une cellule pour une comparaison entre les cellules qui présentent apparemment des stades de développement similaires. Puis, en regardant une combinaison pré-sélectionnée de l'expression des gènes, nous allons déterminer de nouvelles signatures de gènes basée sur les profils d'expression génique simultanées à un point de temps. Ces éléments permettent la collecte d'une grande variété de données d'expression d'un grand nombre de cellules, même sur des populations rares, car la technique est réalisée au niveau clonal. Ainsi, l'hétérogénéité ILC dans le foie peut être évaluée de manière adéquate.
Ensuite, en triant toutes les cellules avec un phénotype ILC global, un large aperçu de l'expression multiple gène du foie populations ILC est obtenue, même si elles représentent des populations extrêmement rares. Une puce à base de microfluidique permet l'expérimentation de mêmeune petite quantité de matériau cellulaire. En conséquence, les profils d'expression génétique des populations de cellules rares peuvent être obtenus. Grâce à un logiciel en ligne de signature génétique d'analyse, les grappes de la population cellulaire et les relations cellulaires potentiels peut être étudiée. Par conséquent, les tests fonctionnels peuvent être effectués pour valider les données de classification au niveau in vivo.
Des dizaines d'expressions de gènes pourraient être évalués de manière concomitante sur des centaines ou des cellules plus simples sur la même puce 3, 11, 12. Conception de l'essai est la partie la plus longue et la plus importante de l'expérience. La détermination des gènes pertinents à l'hypothèse à tester est essentielle pour obtenir des résultats pertinents. Deuxièmement, le contrôle interne (tels que des marqueurs de surface connus utilisés pour le tri) et des contrôles spécifiques sont nécessaires. Ceci est crucial pour tester la spécificité amorce d'amplification, l'efficacité de l'amplification, et til absence de concurrence de l'amorce. Par conséquent, en travaillant avec une seule cellule multiplex RT-PCR quantitative est une technique qui fait gagner du temps, car l'expression de multiples gènes d'une cellule est évaluée en même temps.
En utilisant la même puce et la combinaison de réactifs pour toutes les cellules limite les éventuelles erreurs de manipulation et permet la reproductibilité entre les échantillons. Au total, les différents aspects de multiplex à cellule unique RT-qPCR permet la production de résultats très fiables au niveau clonal, avec un grand niveau de sensibilité pour une grande variété d'échantillons et de gènes. Les résultats obtenus offrent des données puissants et robustes pour les tests biostatistiques.
Ceci peut être réalisé en raison de l'aspect microfluidique du procédé, ce qui permet de travailler sur de très petites quantités de matériau et conduit à des résultats exhaustifs. Enfin, en utilisant un logiciel en ligne, il est possible de comparer les populations désirées.
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Protocole
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par le Comité de sécurité Institut Pasteur en accord avec le ministère français de l'Agriculture et des lignes directrices de l'UE.
1. Préparer une unique cellule Plate Tri 96 puits
- Préparer préamplification mélange dans un tube de 1,5 ml par addition de 5,0 pi de tampon spécifique rétrotranscription, 1,3 ul de faible teneur en acide éthylènediaminetétra-tampon (EDTA) TE (solution à 10 mM de TE, pH 8, et d'une solution 0,1 mM d'EDTA, 0,2 uM filtrée ) et 0,2 ul d'ADN polymerase Taq par puits (figure 1a).
- Sur une plaque à 96 puits, distribuer 6,5 pi de mélange de pré-amplification dans chaque puits (à 48 puits). Cette plaque est la seule cellule plaque de tri de 96 puits.
REMARQUE: L'utilisation d'une pipette électronique est recommandé pour ce protocole. Il permet des mesures de volume précis et reproductibles et un gain de temps.
(A) Sur la seule cellule à 96 puits plaque de triage, le mélange de pré-amplification est distribué en premier, suivi par le mélange d'essai à 0,2x. (B) Le dossier de chaque position à cellule unique doit être conservé sur une feuille de calcul. Un puits sans cellule est appelée "pas d'entrée" bien et peut être utilisé comme témoin. Deux rangées peuvent être épargnés pour contrôler l' efficacité primaire avec de l' ADNc (dilution des dilutions successives d' un sur dix de l'équivalent de 10 5 cellules à une cellule). (C) Sur la plaque de dosage à 96 puits, le réactif test de chargement est distribué en premier, suivi par l'addition des amorces. Ne pas oublier de garder une mise en page de chaque position primaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Préparer un mélange d'essai de 0,2 x dans un tube de 1,5 ml par addition de 1,4 pi de chaque amorce ( les amorces 20x, jusqu'à 48 sondes différentes, voir le tableau 1). Ajuster le volume final à 140 ul avec du tampon TE faible EDTA.
- Distribuer 2,5 ul du mélange de dosage de 0,2 x à 48 puits dans la plaque à 96 puits à cellule unique de tri contenant le mélange de pré-amplification.
NOTE: Le volume final dans chaque puits de la plaque d'échantillon de 96 puits devrait être de 9 pi. - Sceller la plaque avec un film de couverture. Vortex la plaque et le tourner vers le bas à 280 xg pendant 45 sec. Rangez la cellule unique plaque de tri de 96 puits à -20 ° C ou de l'utiliser immédiatement.
2. Single cellulaire Dissociation
- L' utilisation d' un système de distribution de CO 2, euthanasier une souris par l' hypoxie. Fixer la souris sur une plaque de dissection et ouvrir la cavité péritonéale longitudinalement avec des ciseaux.
- Récupérez ILC du foie.
- Avant l'isolement du foie, rincer la livcellules er-circulation.
- Pour faire ressortir la veine porte, déplacer le petit et le gros intestin vers le côté gauche de la souris; la veine porte apparaît comme la plus grande veine dans la cavité péritonéale.
- Avec une seringue de 10 ml et une aiguille de 0,45 mm, rincer le foie avec un milieu de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à travers la veine porte. Pour faciliter le rinçage du foie, couper l'artère gastrique avec des ciseaux.
- Pour enlever la vésicule biliaire, pincer la base de la vésicule biliaire avec une pince et le séparer du foie avec des ciseaux.
- Afin d'isoler le foie, pincer la base du foie avec une pince, et en utilisant des ciseaux, séparer le foie du reste de la cavité péritonéale.
- Transférer le foie dans un tube de potier avec 5 ml de rpmi (RPMI) sériques de 2% de veau foetal (FCS).
- Avant l'isolement du foie, rincer la livcellules er-circulation.
- Dissocier le foie avec une dissociation mécanique à l'aide d'un pilon. Transférer le milieu dans un tube de 15 ml. Amener le volume totalà 14 ml avec du RPMI 2% de FCS. Laisser la suspension de cellules sur la glace pendant 15-20 min pour décanter les hépatocytes.
- Récupérer le surnageant (sans les hépatocytes) dans un nouveau tube de 15 ml en utilisant une pipette de 1 ml (12 ml de surnageant peuvent être attendus). Isoler à 120 xg pendant 7 minutes à 10 ° C. Jeter le surnageant après centrifugation.
- Remettre en suspension le culot obtenu à l' étape 2.4 dans 14 ml de milieu de gradient de densité (par exemple de Percoll 40%). Isoler à 600 xg pendant 20 min à 20 ° C. Retirer le surnageant par aspiration.
- Remettre en suspension le culot dans 1 ml d'acétate de potassium (ACK). Laisser à température ambiante pendant 1 min. Au bout de 1 min, porter le volume total à 14 ml avec de l'équilibre salé solution de Hank (HBSS), 2% de FCS. Isoler à 120 xg pendant 7 minutes à 10 ° C. Jeter le surnageant.
- Colorer les cellules.
- Reprendre le culot dans 300 ul de mélange d'anticorps biotinylé (voir le tableau Matériaux; ajouter tous les anticorps biotinylés mentionnented) et transférer les cellules dans 1,5 ml tube. Laissez-le dans l'obscurité pendant 20 min à 4 ° C.
- Porter le volume total à 1 ml avec du HBSS 2% de FCS. Isoler à 120 xg pendant 7 minutes à 10 ° C. Reprendre le culot dans 300 ul de mélange d'anticorps fluorochrome couplé et conjugué à un fluorochrome streptavidine (voir le tableau des matériaux, ajouter tous les anticorps fluorochrome couplé mentionnés). Laissez-le dans l'obscurité pendant 20 min à 4 ° C.
- Porter le volume total à 1 ml avec du HBSS 2% de FCS. Isoler à 120 xg pendant 7 minutes à 10 ° C. Eliminer le surnageant à l'aide d'une pipette de 1 ml. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de HBSS et l'iodure de propidium (Pi; 1: 4000).
REMARQUE: Lorsque vous utilisez les marqueurs de cellules de surface ILC largement exprimées, 3 populations sont définies: NKp46 + IL-7Rα -, NKp46 + IL-7Rα + et NKp46 - IL-7Rα +. Toutes les populations triées sont lignée - CD3 - CD4 - CD45.2 +.
3. Single-cellule Fluorescence-tri cellulaire activé (FACS)
- Utilisez FACS pour trier les cellules individuelles 13.
REMARQUE: Différents types de cellules peuvent être triés sur le même 96 puits à cellule unique plaque de tri (Figure 2).- Utiliser FACS pour trier une cellule par puits contenant le mélange de dosage de 0,2 x et le mélange de pré-amplification de la cellule unique plaque de triage à 96 puits. Utiliser une cellule unique plaque de tri de 96 puits fraîchement préparé ou dégeler si stocké à -20 ° C.
- Mettre une plaque de 96 puits scellée sur le support de plaque FACS. Utiliser une plaque à 96 puits vide comme un test. Positionner la plaque avec le A1-bien sur la gauche et vers l'expérimentateur.
- Ajuster le support de plaque afin d'obtenir une chute du centre du puits A1 avec des billes de vérification.
- Répétez l'étape 3.1.1.2 avec tous les puits dans la ligne A.
- Retirez le joint de la plaque à 96 puits et trier 100 perles de vérification par puits. Vérifiez dla formation de ROP dans le centre du puits.
- Lorsqu'il est correctement ajusté, placez le 96 puits à cellule unique plaque de tri sur le support de plaque. Dessinez le plan de plaque et trier 1 cellule par puits.
NOTE: Le positionnement correct de chaque cellule sur la plaque de tri de 96 puits à cellule unique est essentielle. Une disposition de la plaque doit être conservée sur un logiciel de tableur. La disposition de la plaque sera utilisée dans les prochaines étapes (figure 1b) 14. Laissez un puits contenant mélange d'essai de 0,2x et de pré-amplification mélange sur la plaque de l'échantillon de 96 puits sans cellules. Ce puits est utilisé comme témoin non-entrée. Laisser deux rangées de 6 puits pour une dilution d'ADNc. Ces puits sont utilisés comme témoins pour l' efficacité primaire (figure 1b). - Rangez la cellule unique plaque de tri de 96 puits à -20 ° C ou de l'utiliser immédiatement.
- Utiliser FACS pour trier une cellule par puits contenant le mélange de dosage de 0,2 x et le mélange de pré-amplification de la cellule unique plaque de triage à 96 puits. Utiliser une cellule unique plaque de tri de 96 puits fraîchement préparé ou dégeler si stocké à -20 ° C.
4. Pré-amplification
- Utilisez une seule plaque-tri cellulaire obt frais ou décongelé 96 puitsained à l'étape 3.1.1.6. Vortex la plaque et le tourner vers le bas (280 g pendant 45 sec).
- Placez le 96 puits à cellule unique plaque de tri sur le thermocycleur. Effectuer une transcription inverse et de préamplification selon le programme indiqué dans la figure 3 et le tableau 2.
Figure 3: programme de pré-amplification. Afin d'obtenir suffisamment de matériel, de pré-amplification de gènes cibles spécifiques sur des cellules individuelles triées est nécessaire. La cellule unique plaque de tri de 96 puits est chargé sur un thermocycleur à suivre le programme de pré-amplification. Les produits de pré-amplification sont ensuite dilués avec du tampon TE faible EDTA et peuvent être utilisées immédiatement ou congelées à -20 ° C. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Diluer le pré-amplilified échantillons par addition de 36 ul de tampon TE faible EDTA dans chaque puits.
- Sceller la plaque avec un film de couverture. Vortex la plaque et le tourner vers le bas (280 g pendant 45 secondes). Rangez le 96 puits à cellule unique plaque pré-amplifiée, le tri à -20 ° C ou de l'utiliser immédiatement.
5. Préparer une plaque d'échantillon de 96 puits
- Préparer 191 pi de mélange maître en ajoutant 175 pi de mélange maître qPCR et 17,5 pi de réactif de chargement d'échantillon.
- Sur une nouvelle plaque de 96 puits, distribuer 3,6 pi de mélange maître dans chaque puits (jusqu'à 48 puits). Ceci est la plaque d'échantillons à 96 puits.
- Transférer 2,9 ul d'ADNc pré-amplifié à partir de la plaque d'échantillon de 96 puits à la nouvelle plaque de 96 puits. Gardez la même position pour chaque échantillon entre la plaque de tri cellulaire 96 unique et la plaque d'échantillon de 96 puits.
- Sceller la plaque avec un film de couverture. Vortex la plaque et le tourner vers le bas (280 g pendant 45 sec). Placez la nouvelle plaque de 96 puits sur la glace à l'abri de la lumière. Rangez le 96 puits sample plaque à -20 ° C ou de l'utiliser immédiatement.
6. Préparer une plaque de dosage à 96 puits
- Sur une nouvelle plaque de 96 puits, 3 ul de distribuer le réactif test de chargement dans chaque puits (à 48 puits). Cette plaque est appelée la plaque de dosage à 96 puits.
- Ajouter 3 ul d'amorces à chaque puits. Gardez une mise en page sur un logiciel de feuille de calcul (figure 1c et le tableau 1; utiliser toutes les amorces énumérées dans le tableau 1). Le bon positionnement de chaque amorce sur la plaque d'essai de 96 puits est essentiel pour les prochaines plusieurs étapes.
- Si le nombre d'échantillons est inférieur à 48, ajouter de l'eau au lieu d'amorces pour les puits non utilisés.
- Sceller la plaque avec un film de couverture. Vortex la plaque et le tourner vers le bas (280 g pendant 45 sec). Rangez la plaque essai de 96 puits à -20 ° C ou de l'utiliser immédiatement.
NOTE: Pour éviter la congélation et la décongélation répétées des amorces, distribuer les amorces pour le mélange de pré-amplification et pour le 96-well plaque d'essai en même temps.
7. unicellulaire Gene expression Chip
- Placez le circuit microfluidique intégré (IFC) sur le banc et vérifier les valves en utilisant la seringue plafonné. Ouvrez la seringue, le placer perpendiculairement à la valve, et appuyez fermement. Le joint torique doit se déplacer. Remplir la puce avec le fluide de la ligne de commande (0,3 ml de tuberculine).
- Répétez l'étape 7.1 avec la deuxième vanne.
REMARQUE: Aucun liquide ne doit être déversé sur la puce. - Retirez le film bleu du fond de la puce. Chargez la puce dans le contrôleur IFC. Sur l'écran du contrôleur IFC, sélectionnez "PRIME", puis "Exécuter". Le contrôle des lignes microfluidiques dure 10 min.
- Ejecter la puce et re-sceller le film bleu sur le fond de la puce.
Figure 4: une seule cellule multiplex expression génique puce chargement. Ces étapes nécessitent gprécision reat, en particulier lors du transfert de la plaque de 96 puits au multiplex puce gène d'expression unique cellule. Pour éviter les erreurs de chargement et mauvais placement, il est fortement recommandé de travailler de manière séquentielle. Le volume prélevé pour chaque transfert doit être contrôlée pendant le processus de pipetage. Enfin, il est important d'éviter les bulles et pour les enlever en cas de formation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- À l'aide d'une pipette à 8 canaux, de transfert 5 ul de la plaque de dosage à 96 puits sur le côté A1 (côté gauche) de la puce. Remplir la partie gauche de la puce, comme il est indiqué sur la figure 4. Veillez à toujours tirer le même volume dans les conseils.
- Ne pas créer de bulles. Si des bulles apparaissent, retirez-les en utilisant 10 conseils ul. Modifier conseils pour chaque puits de la puce.
- Répétez l'étape 7.5 sur le côté droit of la puce en utilisant 5 ul de la plaque d'échantillon de 96 puits.
- Retirez le film bleu du fond de la puce. Chargez la puce dans le contrôleur IFC. Sur l'écran du contrôleur IFC, sélectionnez "RUN SCRIPT", puis "Exécuter". Le chargement des lignes fluidiques dure 45 min.
- Ejecter la puce et re-sceller le film bleu sur le fond de la puce.
8. Exécutez la puce
- Sur l'ordinateur qPCR microfluidique, sélectionnez le logiciel "Data Collection". Une fois qu'il commence, sélectionnez "Nouveau Exécuter".
- Sélectionnez "Ejecter", retirer le film bleu du fond de la puce, et charger la puce. Placez la puce pour obtenir le puits A1 sur la gauche et vers l'expérimentateur.
- Le "cadre du projet", sélectionnez "None" puis "Suivant".
- Sélectionnez "run New chip", "répertoire Nouvelle puce" (créer un dossier pour l'expérience), et «Suivant».
- Sur "l'expression de gènes", sélectionnez "; Référence passive = ROX "(carboxy-x-rhodamine) et" sonde unique; "sélectionner le filtre approprié selon les amorces Sélectionnez." Suivant ".
- Sélectionnez "Parcourir" et sélectionnez le programme approprié en fonction des amorces utilisées.
NOTE: "Default-10min-Hotstart.pcl" est le programme le plus couramment utilisé pour les multiplex à cellule unique RT-qPCR. - Sélectionnez "Start Run". La réaction dure environ 90 min.
- Une fois terminé, sélectionnez "Ejecter-Done."
Analyse 9. Données
- Ouvrez le logiciel "Real-Time PCR Analyse", sélectionnez "Fichier" et "Ouvrir", trouver le dossier d'expérience, et sélectionnez "fichier ChipRun.bml."
- Cliquez sur "Analyse de la vue", "Résultats Table" et "Heat Map View»; boîtes marquées d'un "X" sont en dessous du niveau de détection de seuil et / ou eu de mauvaises courbes d'amplification.
- Nommez les échantillons. Allez dans "Sample Setup" et select "New SBS 96." Cliquez sur "Mapping" et sélectionnez "..." Copier et coller la conception échantillon de mise en page à partir du logiciel de tableur. Définir la mise en page collé comme "Nom de l'échantillon."
- Nommez les essais. Répétez l'étape 9.3 avec les noms d'amorces dans «Configuration du détecteur." Définir la mise en page collé comme «Detector Nom."
- Cliquez sur "vue de l'analyse" et "Analyser"; les noms des échantillons et l' amorce seront attribués automatiquement aux échantillons et les amorces (figure 7).
- Calculer Ct, Delta Ct, et Pliez Change pour chaque échantillon. Utilisez un gène de ménage comme un contrôle interne (ici, Gapdh):
ACt = échantillon Ct - contrôle interne Ct
Pliez Change = 2 - (contrôle ΔCtsample-ΔCtnegative)- Cliquez sur "Configuration du détecteur" et sélectionnez le puits sans contrôle d'entrée (utilisez le gène de ménage comme un contrôle interne pour normaliser l'expression des gènes). Sélectionnez "Editor "," définir la référence, "et" Mise à jour ".
- Sélectionnez tous les puits à laquelle le contrôle interne défini ci-dessus sera appliqué. Sélectionnez "Editor" et "définir comme test." Sélectionnez un gène de référence approprié et cliquez sur "Update".
- Sélectionnez "Sample Setup" pour sélectionner ainsi le contrôle négatif. Sélectionnez "Editor" et définir "Référence". Cliquez sur "Update".
- Sélectionnez "Analyse de la vue" et "Analyser"; le Delta Ct et le changement Fold seront automatiquement calculés.
- Exporter les données. Sélectionnez "Fichier" et "Exporter, enregistrer sous" Tableau Résultats ", sélectionnez le dossier de destination, et cliquez sur" Enregistrer "et" Quitter ".
- Répétez l'étape 9.7, mais au lieu de "Résultats de la table," Enregistrer sous "Résultats HeatMap."
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Résultats
populations lymphoïdes présentent une grande diversité dans l'expression des gènes. Dans ce protocole, le foie compartiment ILC hétérogénéité a été étudiée en utilisant une seule cellule multiplex RT-qPCR expression génique. Contrairement à d'autres techniques d'expression génique, multiplex unicellulaire RT-qPCR expression génique permet de travailler sur plusieurs populations, même les plus rares, dans le même temps. Cette spécificité, associée à une sensibilité élevée au niveau clonal...
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Discussion
Ce protocole décrit comment obtenir des informations d'expression génique exhaustive au niveau clonal. Ici, nous avons étudié le foie ILC compartiment hétérogénéité. Après un tri à cellule unique des différentes populations de la CIT (basées sur des marqueurs de surface ILC largement exprimés), les échantillons ont été pré-amplifiées pour les gènes présélectionnés spécifiques. Ensuite, l'ADNc obtenu et des amorces ont été chargées sur une RT-qPCR puce microfluidique multiplex. Enfin, nous avons obtenu l'expr...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par l’Institut Pasteur, l’INSERM, l’Université Paris Diderot et par le Ministère de la Recherche (à S.C.) ; l’Association pour la Recherche sur le Cancer (à S.C. et R.G.) ; le Programme d’Investissements d’Avenir REVIVE et l’Agence Nationale de Recherche (ANR ; subvention ''Twothyme'' à A.C.) ; Bourse ANR ''Myeloten'' (à R.G.) ; et l’Institut National du Cancer (Rôle du microenvironnement immunitaire au cours de la carcinogenèse hépatique, à R.G.). Nous remercions la plateforme du Centre d’immunologie humaine et de cytométrie de l’Institut Pasteur pour son soutien.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems ; | 11753100 | Kit de détection de sonde d’amorçage. Contient 2x mélange réactionnel, enzyme SSIII Platinium. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| Plaques 96 puits | Thermofisher Scientific | AB 1100 | Plaques 96 puits adaptées au tri cellulaire et au thermocyclage Film |
| de couverture | Dominique Dutscher | 106570 | Film de couverture en aluminium ; éviter la contamination et l’évaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20x amorce |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20x amorce |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20x amorce |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20x amorce |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20x amorce |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20x amorce |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20x amorce |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20x amorce |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20x amorce |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20x amorce |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20x amorce |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20x amorce |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20x amorce |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20x amorce |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20x amorce |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20x amorce |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20x amorce |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20x amorce |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20x amorce |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20x amorce |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20x amorce |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20x amorce |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20x amorce |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20x amorce |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20x amorce |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20x amorce |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20x amorce |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20x amorce |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20x amorce |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20x amorce |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20x amorce |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20x amorce |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20x amorce |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20x amorce |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20x amorce |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20x amorce |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20x amorce |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20x amorce |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20x amorce |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20x amorce |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20x amorce |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20x amorce |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20x amorce |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20x amorce |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20x amorce |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20x amorce |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20x amorce |
| qPCR Master mix ; | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Dosage spécifique du milieu à charge dans une puce microfluidique multiplex RT-qPCR. ; |
| 2x Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Milieu de densité spécifique pour charger des échantillons dans une puce microfluidique multiplex RT-qPCR. ; |
| 48.48 multiplex RT qPCR puce microfluidique | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC pour l’expression des gènes ; puce pour réaction RT-qPCR multiplexe à cellule unique |
| 48.48 multiplex RT qPCR contrôleur de puce microfluidique | Fluidigm | 89000020 | 48.48 Contrôleur IFC ; contrôle de la puce système fluidique interne, chargement des échantillons et dosages dans des chambres de réaction |
| multiplexe RT qPCR thermocycleur microfluidique | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycleur à 96 |
| puits | Thermofisher Scientific | AB 1100 | Plaques 96 puits adaptées au tri cellulaire et au thermocyclage |
| Souris C57Bl/6 | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| Seringue de 10 ml | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard sérum de veau fœtal |
| Tube Potter | N/A | ||
| Tube de 15 ml | Tube de Corning | 352097 | |
| de 1,5 ml | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Machine FACS | N/A | ||
| centrifugeuse ; | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1 000 & micro ; l conseils | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 ; | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Tube Facs | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Anticorps de souris à la biotine | Sony | 1103520 | anticorps |
| anti-CD19 Anticorps de souris à la biotine | Sony | 1177520 | anticorps |
| anti-TCRab Anticorps de souris à la biotine BioLegend | Anticorps | lignée | |
| anti-TCRgd Anticorps de souris à la biotine | BD Biosciences | Anticorps de 553176 | lignée |
| anti-Ter119 Anticorps de souris à la biotine | BD Biosciences | Anticorps de 553672 | lignée |
| anti-Gr1 Anticorps de souris à la biotine | BD Biosciences | Anticorps de 553125 | lignée |
| anti-CD45.2 Anticorps de souris PerCPCy5.5 | BioLegend | 109828 | |
| anticorps anti-IL7ra PeCy7 anticorps | anti-souris ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anticorps anti-CD3 BV510 anticorps anti-souris | BD Biosciences | 563024 | |
| anticorps anti-CD4 BV786 anticorps murin | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE anticorps de souris | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Iodure de propidium | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Pipette électronique | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0,1 ml | Eppendorf | 30089405 | |
| Pipette multicanaux | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | billes de vérification pour FACS |
Références
- Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
- Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
- Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
- Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
- Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue - inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
- Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells - a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
- Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
- Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
- Monticelli, L. a, Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
- Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
- Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
- Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
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- Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
- Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
- Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).
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