Ce protocole utilise à la fois sous-unité coexpression et sous-unité postlysis mélange pour un examen plus approfondi de l'ensemble de protéasome recombinant.
Article de méthode
Ce protocole utilise à la fois sous-unité coexpression et sous-unité postlysis mélange pour un examen plus approfondi de l'ensemble de protéasome recombinant.
Protéasomes se trouvent dans tous les domaines de la vie. Ils fournissent la principale voie de dégradation intracellulaire des protéines chez les eucaryotes, bien que leur montage ne soit pas complètement compris. Tous les protéasomes contiennent une particule de noyau structurellement conservée (CP), ou le protéasome 20S, contenant deux sous-unités ß des anneaux de heptamériques pris en sandwich entre deux anneaux de sous-unités α heptamériques. Archaea 20S protéasomes ont une composition plus simple par rapport à leurs homologues eucaryotes, mais ils partagent tous deux un mécanisme d'assemblage commun. Par conséquent, 20S archées proteasomes continuent à être des modèles importants pour l'assemblage du protéasome eucaryote. Plus précisément, l'expression recombinante de 20S archées proteasomes couplée à l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (PAGE) a donné de nombreuses informations sur protéasome biogenèse. Ici, nous discutons un moyen d'améliorer la stratégie habituelle de coexpression des archées protéasome α et sous-unités ß avant nondenaturing PAGE. Nous démontrons que, bien que rapide et efficace, une approche de coexpression seul peut manquer des intermédiaires d'assemblage clés. Dans le cas du protéasome, coexpression peut ne pas permettre la détection de la demi-protéasome, un contenant un α-anneau complet intermédiaire et un β-anneau complet. Cependant, cet intermédiaire est facilement détectée par lysat mélange. Nous suggérons que la combinaison coexpression avec lysat mélange donne une approche plus approfondie dans l'analyse de l'assemblage, mais il reste encore du travail non intensif. Cette approche peut être utile pour l'étude d'autres complexes multiprotéiques recombinantes.
Complexes multiprotéiques effectuent de nombreuses activités cellulaires critiques 1. Pour beaucoup de ces complexes, beaucoup plus on connaît leur structure et leur fonction que de leur assemblage 2,3. Le protéasome est un tel complexe et se retrouve dans tous les domaines de la vie. Chez les eucaryotes, cette machine moléculaire est au cœur du système protéasome / Ubiquitin (UPS) et fournit la principale voie de dégradation des protéines intracellulaires 4. Le protéasome eucaryote (dénommé protéasome 26S) est composé de deux ensembles principaux sous: un protéasome 20S, ou Core particules (CP) 5, qui peut être coiffé sur ....
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1. Expression bactérienne.
Nota: Les plasmides d'expression utilisés dans cette étude sont décrits dans le tableau 1. Solutions, les médias et les tampons utilisés dans cette étude sont décrits dans le tableau 2. Le clonage des gènes de sous - unités du protéasome archées et la génération de plasmides d'expression sont décrits ailleurs 18,20. En bref, des plasmides pour coexpression recombinant de sous - unités emploient une stratégie de opéron bicistronique qui aide à obtenir des niveaux d'expression comparables de sous - unités individuelles 18,20. Les pa....
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Protéasome assemblage (Figure 1) commence lorsque les sous - unités alpha se combinent pour former des anneaux 9. Ceci peut être illustré lorsque a sous - unités de l'archée Methanococcus maripaludis S2 sont exprimés dans E. coli C-terminale hexahistidine marqué (son-tagged) dérivés (tableau 1). Lorsque le recombinant α-sa protéine a été purifiée par ICAR et analysé par PAGE non dénaturant, deux bandes ont été observées (Figure 2A, piste.......
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Nous démontrons au profit d'une approche combinée à l'analyse de l'assemblage du protéasome par dénaturants PAGE en utilisant proteasomes archées recombinantes. La méthode habituelle 9,11 de coexpression bactérienne des sous - unités du protéasome permet une analyse rapide , mais peut ne pas révéler des intermédiaires d'assemblage clés. Nous vous suggérons de combiner coexpression avec lysat de mélange pour développer une image plus large des événements de l'Assemblée.
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Ce travail a été soutenu en partie par un soutien des fonds de subvention de la recherche (RSFG) de l'Indiana University-Purdue, Indianapolis, et en partie par un prix de l'American Heart Association 14GRNT20390154, à ARK
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
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| Kit de dosage BCA | Pierce | 23225 | |
| Solution de bisacrylamide (2 %) | Biorad | 1610142 | |
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