Ce protocole utilise à la fois sous-unité coexpression et sous-unité postlysis mélange pour un examen plus approfondi de l'ensemble de protéasome recombinant.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Ce protocole utilise à la fois sous-unité coexpression et sous-unité postlysis mélange pour un examen plus approfondi de l'ensemble de protéasome recombinant.
Protéasomes se trouvent dans tous les domaines de la vie. Ils fournissent la principale voie de dégradation intracellulaire des protéines chez les eucaryotes, bien que leur montage ne soit pas complètement compris. Tous les protéasomes contiennent une particule de noyau structurellement conservée (CP), ou le protéasome 20S, contenant deux sous-unités ß des anneaux de heptamériques pris en sandwich entre deux anneaux de sous-unités α heptamériques. Archaea 20S protéasomes ont une composition plus simple par rapport à leurs homologues eucaryotes, mais ils partagent tous deux un mécanisme d'assemblage commun. Par conséquent, 20S archées proteasomes continuent à être des modèles importants pour l'assemblage du protéasome eucaryote. Plus précisément, l'expression recombinante de 20S archées proteasomes couplée à l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (PAGE) a donné de nombreuses informations sur protéasome biogenèse. Ici, nous discutons un moyen d'améliorer la stratégie habituelle de coexpression des archées protéasome α et sous-unités ß avant nondenaturing PAGE. Nous démontrons que, bien que rapide et efficace, une approche de coexpression seul peut manquer des intermédiaires d'assemblage clés. Dans le cas du protéasome, coexpression peut ne pas permettre la détection de la demi-protéasome, un contenant un α-anneau complet intermédiaire et un β-anneau complet. Cependant, cet intermédiaire est facilement détectée par lysat mélange. Nous suggérons que la combinaison coexpression avec lysat mélange donne une approche plus approfondie dans l'analyse de l'assemblage, mais il reste encore du travail non intensif. Cette approche peut être utile pour l'étude d'autres complexes multiprotéiques recombinantes.
Complexes multiprotéiques effectuent de nombreuses activités cellulaires critiques 1. Pour beaucoup de ces complexes, beaucoup plus on connaît leur structure et leur fonction que de leur assemblage 2,3. Le protéasome est un tel complexe et se retrouve dans tous les domaines de la vie. Chez les eucaryotes, cette machine moléculaire est au cœur du système protéasome / Ubiquitin (UPS) et fournit la principale voie de dégradation des protéines intracellulaires 4. Le protéasome eucaryote (dénommé protéasome 26S) est composé de deux ensembles principaux sous: un protéasome 20S, ou Core particules (CP) 5, qui peut être coiffé sur une ou deux extrémités par une particule réglementaire 19S (RP) 6.
Le protéasome 20S est une grande protéase compartimentée. Sa structure quaternaire est complètement conservée dans tous les domaines de la vie et se compose d'un empilement de quatre cycles à sept chaînons contenant au moins deux types de sous-unités de structure apparentée, α; et ß 5,7,8. Chez les eucaryotes, les deux bagues extérieures sont chacune composées de sept sous-unités a différentes et les deux bagues intérieures sont constitués chacun de sept sous-unités ß distinctes; une activité protéolytique réside dans trois des sous-unités ß. En revanche, les anneaux de CP de archéobactéries et des bactéries sont habituellement constituées d'un seul type de α et une sous-unité β type. Proteasomes Archaea ont fourni un important système modèle pour étudier l' assemblage du protéasome due à la fois à leur simplicité de composition et de leur partager un mécanisme d'assemblage commun avec leurs homologues eucaryotes 9-13. En bref, les sous-unités alpha assemblent en anneaux d'a d'abord, qui servent comme un échafaudage sur lequel ß sous-unités se rassemblent. Les demi-protéasomes résultant (α 7 β 7) dimériser, donnant lieu à des entièrement assemblés CP (α 7 β 7 β 7 α 7). Au cours de la dimérisation, les propeptides présents sur les sous-unités ßsont enlevées par voie autocatalytique, ce qui expose les thréonines catalytique N-terminal. L'utilisation des protéasomes archéobactéries pour modéliser l' assemblage prend souvent l' avantage de la production de protéines recombinantes dans protéasome archéobactéries Escherichia coli. Cette approche est utile, car elle permet aux sous-unités à produire dans diverses combinaisons, à la fois comme WT et versions mutantes, dans un organisme hôte qui ne produit pas ses propres protéasomes.
Contrôle de l'assemblage des complexes multi-protéiques nécessite biochimiquement une sorte de méthode de fractionnement qui sépare les complexes entièrement assemblés à partir des intermédiaires d'assemblage et de précurseurs. En raison de sa capacité de résoudre supérieure, non dénaturant sur gel de polyacrylamide L' électrophorèse (PAGE) est avéré être particulièrement utile pour le fractionnement de divers grands complexes multiprotéiques 14-17. La combinaison de la production de protéasome Archaea recombinant et PAGE dénaturant est devenue une approche puissante en dissecting assemblage de protéasome 9,11,12,18. Cependant, la méthode habituelle par laquelle cette approche est appliquée ( par exemple. Par la co - expression recombinante de sous - unités a et ß) présente un inconvénient important. Les réactions de l' Assemblée sont coopératifs et fortement dépendante de la concentration 3. Étant donné que la concentration de la protéine dans les cellules est très élevée 19, en raison des effets de volume exclu, les réactions d'assemblage se déroulent rapidement in vivo. Il est donc possible de manquer des intermédiaires d'assemblage importants lorsque a et ß sous-unités sont coexprimaient.
Ici, nous plaidons pour une approche combinée à l'étude de l'ensemble de protéasome en utilisant des sous-unités du protéasome archées recombinantes. Dans cette approche, les deux méthodes de mélange coexpression et lysat sont utilisés. La première permet une analyse rapide de l'ensemble parce coexpression est moins de travail. Celle-ci dépend de l'expression séparée des sous-unités a et ß, suivi par le mélange. Bien que ce requires un peu plus d'effort que coexpression, il est plus que compensée par la capacité à détecter les intermédiaires qui sont manqués pendant coexpression. Ensemble, ces deux méthodes peuvent fournir une image plus complète de l'ensemble de protéasome.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
1. Expression bactérienne.
Nota: Les plasmides d'expression utilisés dans cette étude sont décrits dans le tableau 1. Solutions, les médias et les tampons utilisés dans cette étude sont décrits dans le tableau 2. Le clonage des gènes de sous - unités du protéasome archées et la génération de plasmides d'expression sont décrits ailleurs 18,20. En bref, des plasmides pour coexpression recombinant de sous - unités emploient une stratégie de opéron bicistronique qui aide à obtenir des niveaux d'expression comparables de sous - unités individuelles 18,20. Les paramètres d'expression énumérés ci-dessous ont été déterminées de façon empirique comme étant optimale pour les sous-unités du protéasome dans cette étude. Il peut être nécessaire pour optimiser l'expression d'autres mutants protéasome, pour proteasomes d'autres espèces d'archées, ou pour d'autres complexes de protéines recombinantes (voir Discussion).
2. Lyse bactérienne et Lysat de mélange.
Remarque: Pour les échantillons étudiés par coexpression, suivez la section 2.1 (et ses sous-sections). Pour les échantillons nécessitant lysat mélange, suivez la section 2.2 (et ses sous-sections). L'analyse TSP (Total, soluble, Pellet) qui est inclus dans le protocole est utile pour optimiser l'expression des protéines qui peuvent aider à assurer que des quantités à peu près égales de sous-unités a et ß sont combinés lors de lysat de mélange (voir Discussion). Il fournit également un contrôle important si les résultats en aval ne sont pas comme prévu (il vérifie que la protéine a été exprimée et soluble). Ainsi, nous recommandons fortement, y compris l'analyse de TSP initialement. Une fois un protocole optimal a été atteint pour une combinaison de sous-unité particulière, l'analyse TSP est pas strictement nécessaire, ce qui est la raison pour laquelle il est décrit comme option ci-dessous.
3. Purification de la protéine par affinité Immobilisé cobalt Résine(I VOITURE).
4. dénaturant gel de polyacrylamide électrophorèse (PAGE).
Attention: acrylamide non polymérisé est une neurotoxine. Porter gea de protection appropriér.
Activité 5. Visualisation et coloration des protéines.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protéasome assemblage (Figure 1) commence lorsque les sous - unités alpha se combinent pour former des anneaux 9. Ceci peut être illustré lorsque a sous - unités de l'archée Methanococcus maripaludis S2 sont exprimés dans E. coli C-terminale hexahistidine marqué (son-tagged) dérivés (tableau 1). Lorsque le recombinant α-sa protéine a été purifiée par ICAR et analysé par PAGE non dénaturant, deux bandes ont été observées (Figure 2A, piste...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Nous démontrons au profit d'une approche combinée à l'analyse de l'assemblage du protéasome par dénaturants PAGE en utilisant proteasomes archées recombinantes. La méthode habituelle 9,11 de coexpression bactérienne des sous - unités du protéasome permet une analyse rapide , mais peut ne pas révéler des intermédiaires d'assemblage clés. Nous vous suggérons de combiner coexpression avec lysat de mélange pour développer une image plus large des événements de l'Assemblée.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Ce travail a été soutenu en partie par un soutien des fonds de subvention de la recherche (RSFG) de l'Indiana University-Purdue, Indianapolis, et en partie par un prix de l'American Heart Association 14GRNT20390154, à ARK
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Solution d’acrylamide (40 %) | Biorad | 1610104 L’acrylamide | non polymérisé est une neurotoxine. Porter un équipement de protection approprié |
| Filtres centrifuges Amicon ultra 0,5 mL | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Persulfate d’ammonium | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Kit de dosage BCA | Pierce | 23225 | |
| Solution de bisacrylamide (2 %) | Biorad | 1610142 | |
| Bleu | de bromophénolSigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E. coli BL21 cellules compétentes | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Réactif de coloration colloïdale de Coomassie pour gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Système de documentation du gel |
| Libérateurs de gel | Biorad | 1653320 | Plastique en forme de coin utilisé pour séparer les plaques de gel ; utile pour l’épandage de liquide. |
| Tige en verre | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycérol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Seringue Hamilton | Thermo Fisher | 14-813-38 | Seringue en verre pour le chargement des |
| gels HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Kit d’étalonnage natif | GE Healthcare | 170445-01 | Étalons protéiques de haut poids moléculaire |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Fabricant |
| de gradient Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | Pour l’induction de l’expression des protéines |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Sulfate de kanamycine | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytique | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Appareil d’électrophorèse sur gel |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Inhibiteur de protéase |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmide |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard pour SDS-PAGE |
| Kit de mutagenèse Quickchange | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Substrat fluorogénique |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized Cobalt Affinity Resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | ||
| Plateau d’échantillonnage UV | Biorad | 1708271 | Pour l’imagerie UV des gels |
| Extrait de levure | Bacto BD | 212720 |
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.