Examiner Assemblée protéasome avec recombinant Archaeal Protéasomes et dénaturant PAGE: le cas pour une approche combinée

Résumé

Ce protocole utilise à la fois sous-unité coexpression et sous-unité postlysis mélange pour un examen plus approfondi de l'ensemble de protéasome recombinant.

Résumé

Protéasomes se trouvent dans tous les domaines de la vie. Ils fournissent la principale voie de dégradation intracellulaire des protéines chez les eucaryotes, bien que leur montage ne soit pas complètement compris. Tous les protéasomes contiennent une particule de noyau structurellement conservée (CP), ou le protéasome 20S, contenant deux sous-unités ß des anneaux de heptamériques pris en sandwich entre deux anneaux de sous-unités α heptamériques. Archaea 20S protéasomes ont une composition plus simple par rapport à leurs homologues eucaryotes, mais ils partagent tous deux un mécanisme d'assemblage commun. Par conséquent, 20S archées proteasomes continuent à être des modèles importants pour l'assemblage du protéasome eucaryote. Plus précisément, l'expression recombinante de 20S archées proteasomes couplée à l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (PAGE) a donné de nombreuses informations sur protéasome biogenèse. Ici, nous discutons un moyen d'améliorer la stratégie habituelle de coexpression des archées protéasome α et sous-unités ß avant nondenaturing PAGE. Nous démontrons que, bien que rapide et efficace, une approche de coexpression seul peut manquer des intermédiaires d'assemblage clés. Dans le cas du protéasome, coexpression peut ne pas permettre la détection de la demi-protéasome, un contenant un α-anneau complet intermédiaire et un β-anneau complet. Cependant, cet intermédiaire est facilement détectée par lysat mélange. Nous suggérons que la combinaison coexpression avec lysat mélange donne une approche plus approfondie dans l'analyse de l'assemblage, mais il reste encore du travail non intensif. Cette approche peut être utile pour l'étude d'autres complexes multiprotéiques recombinantes.

Introduction

Complexes multiprotéiques effectuent de nombreuses activités cellulaires critiques ^1. Pour beaucoup de ces complexes, beaucoup plus on connaît leur structure et leur fonction que de leur assemblage ^2,3. Le protéasome est un tel complexe et se retrouve dans tous les domaines de la vie. Chez les eucaryotes, cette machine moléculaire est au cœur du système protéasome / Ubiquitin (UPS) et fournit la principale voie de dégradation des protéines intracellulaires ^4. Le protéasome eucaryote (dénommé protéasome 26S) est composé de deux ensembles principaux sous: un protéasome 20S, ou Core particules (CP) ^5, qui peut être coiffé sur ....

Protocole

1. Expression bactérienne.

Nota: Les plasmides d'expression utilisés dans cette étude sont décrits dans le tableau 1. Solutions, les médias et les tampons utilisés dans cette étude sont décrits dans le tableau 2. Le clonage des gènes de sous - unités du protéasome archées et la génération de plasmides d'expression sont décrits ailleurs ^18,20. En bref, des plasmides pour coexpression recombinant de sous - unités emploient une stratégie de opéron bicistronique qui aide à obtenir des niveaux d'expression comparables de sous - unités individuelles ^18,20. Les pa....

Résultats

Protéasome assemblage (Figure 1) commence lorsque les sous - unités alpha se combinent pour former des anneaux ^9. Ceci peut être illustré lorsque a sous - unités de l'archée Methanococcus maripaludis S2 sont exprimés dans E. coli C-terminale hexahistidine marqué (son-tagged) dérivés (tableau 1). Lorsque le recombinant α-sa protéine a été purifiée par ICAR et analysé par PAGE non dénaturant, deux bandes ont été observées (Figure 2A, piste.......

Discussion

Nous démontrons au profit d'une approche combinée à l'analyse de l'assemblage du protéasome par dénaturants PAGE en utilisant proteasomes archées recombinantes. La méthode habituelle ^9,11 de coexpression bactérienne des sous - unités du protéasome permet une analyse rapide , mais peut ne pas révéler des intermédiaires d'assemblage clés. Nous vous suggérons de combiner coexpression avec lysat de mélange pour développer une image plus large des événements de l'Assemblée.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution d’acrylamide (40 %)	Biorad	1610104 L’acrylamide	non polymérisé est une neurotoxine. Porter un équipement de protection approprié
Filtres centrifuges Amicon ultra 0,5 mL	EMDMillipore	UFC501024
Persulfate d’ammonium	Sigma	A3678
ATP	Sigma	A7699
Kit de dosage BCA	Pierce	23225
Solution de bisacrylamide (2 %)	Biorad	1610142
Bleu	de bromophénolSigma	B8026
DNaseI	Sigma	DN25
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher	BP172
E. coli BL21 cellules compétentes	EMD Millipore	69450
GelCode Blue	Thermo Fisher	24592	Réactif de coloration colloïdale de Coomassie pour gels
Gel doc EZ system	Biorad	1708270	Système de documentation du gel
Libérateurs de gel	Biorad	1653320	Plastique en forme de coin utilisé pour séparer les plaques de gel ; utile pour l’épandage de liquide.
Tige en verre	Thermo Fisher	11-380B
Glycérol	Sigma	49767
Glycine	Thermo Fisher	BP3865
Seringue Hamilton	Thermo Fisher	14-813-38	Seringue en verre pour le chargement des
gels HEPES	US Biologicals	H2010
HMW Kit d’étalonnage natif	GE Healthcare	170445-01	Étalons protéiques de haut poids moléculaire
Hoefer SG30	Thermo Fisher	03-500-277	Fabricant
de gradient Imidazole	US Biologicals	280671
IPTG	US Biologicals	I8500	Pour l’induction de l’expression des protéines
Isopropanol	Thermo Fisher	BP26181
Sulfate de kanamycine	US Biologicals	K0010
Lysozyme	Sigma	L6876
MgCl2	Fluka analytique	630680
Mini Protean Tetra Cell	Biorad	1658002EDU	Appareil d’électrophorèse sur gel
NaCl	Thermo Fisher	S640-3
NaOH	Thermo Fisher	S318-1
Pefabloc SC	Roche	11429876001	Inhibiteur de protéase
pET42	EMD Millipore	70562	Expression plasmide
Precision plus all blue standard	Biorad	1610373	Molecular protein standard pour SDS-PAGE
Kit de mutagenèse Quickchange	Agilent technologies	200521
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Thermo Fisher	BP166
Suc-LLVY-AMC	Enzo lifesciences	BML P802-0005	Substrat fluorogénique
Talon Metal Affinity Resin	Clontech	635502	Immobilized Cobalt Affinity Resin
TEMED	Sigma	T7024
Tris	US Biologicals	T8600
Triton-X100	Sigma	93426
Tryptone	Bacto BD
Plateau d’échantillonnage UV	Biorad	1708271	Pour l’imagerie UV des gels
Extrait de levure	Bacto BD	212720

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