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Article de méthode

Anticancer efficacité de la thérapie photodynamique avec Lung Cancer-ciblée Nanoparticules

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DOI :

10.3791/54865

⸱

1 décembre 2016

 ,  , 
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University Bundang Hospital, 2College of Pharmacy, Kangwon National University, 3Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University College of Medicine

Dans cet article

Résumé

La thérapie photodynamique (PDT) est un choix alternatif pour le traitement du cancer du poumon. Pour augmenter l’effet thérapeutique de la PDT, des nanoparticules ciblant le cancer du poumon combinées à une chimiothérapie ont été développées. L’efficacité anticancéreuse in vitro et in vivo de la PDT avec des nanoparticules préparées a été évaluée.

Résumé

La thérapie photodynamique (PDT) est une méthode non invasive et non chirurgicale représentant un choix alternatif attrayant pour le traitement du cancer du poumon. Les photosensibilisants s’accumulent sélectivement dans le tissu tumoral et entraînent la mort des cellules tumorales en présence d’oxygène et de la bonne longueur d’onde de la lumière.

Pour augmenter l’effet thérapeutique de la PDT, nous avons développé des nanoparticules ciblant le cancer du poumon chargées d’agents photosensibilisants et anticancéreux. Le ciblage passif basé sur l’effet de perméabilité et de rétention améliorées (EPR) et le ciblage actif basé sur l’interaction acide hyaluronique-CD44 ont été appliqués. CD44 est un récepteur de l’acide hyaluronique bien connu qui est souvent présenté comme biomarqueur du cancer du poumon non à petites cellules.

De plus, une combinaison de PDT et de chimiothérapie est adoptée dans la présente étude. Ce concept de combinaison peut augmenter les effets thérapeutiques anticancéreux et réduire les effets indésirables.

Nous avons choisi l’hypocrélline B (HB) comme nouveau photosensibilisant dans cette étude. Il a été rapporté que l’HB entraîne une efficacité anticancéreuse plus élevée de la PDT par rapport aux dérivés de l’hématoporphyrine1. Le paclitaxel a été choisi comme médicament anticancéreux car il s’est avéré être un traitement potentiel pour le cancer du poumon2.

Les efficacités antitumorales de la solution photosensibilisante (HB), des nanoparticules d’acide hyaluronique-céramide encapsulées dans un photosensibilisant (HB-NPs) et des nanoparticules d’acide hyaluronique-céramide encapsulées dans un agent photosensibilisant et anticancéreux (PACLITAXEL) après PDT ont été comparées à la fois in vitro et in vivo. La phototoxicité in vitro dans les cellules A549 (adénocarcinome pulmonaire humain) et l’efficacité antitumorale in vivo chez les souris porteuses de tumeurs A549 ont été évaluées. Le groupe de traitement HB-P-NP a montré l’effet anticancéreux le plus efficace après PDT. En conclusion, les HB-P-NPs préparées dans la présente étude représentent un système potentiel et nouveau d’administration de photosensibilisants dans le traitement du cancer du poumon par PDT.

Introduction

La thérapie photodynamique (PDT) est composée de trois facteurs principaux : les photosensibilisants, la lumière et l’oxygène. La PDT est considérée comme un traitement prometteur pour divers cancers3. Lorsque les photosensibilisants sont administrés au patient cancéreux, ils s’accumulent sélectivement dans les tissus tumoraux. Lorsque la bonne longueur d’onde de lumière est appliquée, l’oxygène singulet hautement réactif et d’autres radicaux libres entraînent des dommages aux cellules tumorales4.

Le cancer du poumon a été introduit comme l’une des premières applications de la PDT au début des années 19805. La PDT offre plusieurs avantages dans le traitement du cancer du poumon. Étant donné que la PDT est un traitement non invasif et non chirurgical, il s’agit d’un choix alternatif attrayant pour les patients chez qui la résection chirurgicale n’est pas appropriée.

Il y a eu de nombreux défis à relever pour améliorer l’efficacité des photosensibilisants contre le cancer. L’augmentation de l’accumulation de photosensibilisant dans les sites cancéreux et la diminution de l’accumulation dans les tissus normaux sont les mêmes objectifs pour les études de ciblage du cancer. Une variété de systèmes d’administration de médicaments ciblés, tels que les polymères, les liposomes et les nanoparticules, sont adoptés comme porteurs de photosensibilisations6-8. Dans nos études précédentes, les nanoparticules ont effectivement augmenté les capacités de ciblage du cancer des photosensibilisants9,10. Les nanoparticules sont des vecteurs idéaux pour le cancer car elles possèdent des capacités de ciblage passives et actives. Les vaisseaux tumoraux perméables qui fuient permettent aux transporteurs de taille nanométrique de s’accumuler facilement dans les tumeurs, ce qui est bien connu sous le nom d’effet de perméabilité et de rétention améliorées (EPR)11,12. L’interaction entre les nanoparticules et les récepteurs spécifiques des cellules cancéreuses permet un ciblage actif du cancer. Dans cette étude, nous avons préparé des nanoparticules à base d’acide hyaluronique pour interagir avec CD44, le principal récepteur de l’acide hyaluronique qui est surexprimé sur les cellules cancéreuses du poumon13.

Pour maximiser l’efficacité anticancéreuse, une combinaison de PDT et de chimiothérapie est adoptée dans la présente étude. Ce concept de combinaison peut permettre d’augmenter l’effet thérapeutique. De plus, une diminution des doses de photosensibilisant et de médicament anticancéreux peut diminuer les effets indésirables. Nous avons sélectionné l’hypocrélline B (HB) comme nouveau photosensibilisant dans la présente étude. HB est isolé du champignon médicinal chinois Hypocrella bambuase. Shang et al. ont rapporté que la PDT à base de HB possède une efficacité anticancéreuse plus élevée que la PDT1 à base de dérivé de l’hématopophyrine. Le paclitaxel a été choisi comme médicament anticancéreux car il s’est avéré être un traitement potentiel pour divers cancers, y compris le cancer du poumon2.

Dans ce cadre, nous avons comparé l’efficacité anticancéreuse d’une solution photosensibilisante (hypocrélline B, HB), de nanoparticules d’acide hyaluronique-céramide encapsulées dans un photosensibilisateur (HB-NPs) et de nanoparticules d’acide hyaluronique-céramide encapsulées dans un agent photosensibilisant et anticancéreux (paclitaxel) après PDT. La phototoxicité in vitro dans les cellules A549 (adénocarcinome pulmonaire humain) et l’efficacité antitumorale in vivo chez les souris porteuses de tumeurs A549 ont été évaluées.

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Protocole

NOTE: Tous les protocoles d'études animales ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Comité institutionnel de l'hôpital Bundang Université nationale de Séoul (BA1308-134 / 072-01).

1. Synthèse de l'Acide Hyaluronique-céramide (HACE)

  1. Solubiliser 12,21 mmol d'acide hyaluronique (HA) oligomère et 9,77 mmol de tétra n - butylammonium hydroxyde (TBA) dans 60 ml d'eau distillée deux fois (DDW). On agite pendant 30 min.
  2. Pour synthétiser l'agent de liaison DS-Y30, on dissout 8,59 mmol de DS-Y30 céramide et 9,45 mmol de triéthylamine dans 25 ml de tétrahydrofuranne (THF). Mélanger avec 8,59 mmol de chlorure de 4-chlorométhylbenzoyle dans le THF. Agiter pendant 6 heures à 60 ° C.
  3. On dissout le 8,10 mmol synthétisé de HA-TBA et 0,41 mmol de liaison DS-Y30 dans un mélange de THF et d'acétonitrile (4: 1, v / v). Remuez pendant 5 heures à 40 ° C.
  4. Éliminer les impuretés par filtration avec un agent de filtration et éliminer le solvant organique par évaporation sous vide. On purifie le produit en utilisant une membrane de dialyse (poids moléculaire de coupure: 3,5 kDa) et lyophiliser.

2. Préparation des nanoparticules

  1. Dissoudre 1 mg de HB et 1 mg de paclitaxel dans 0,5 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) et mélanger avec 0,5 ml de DDW par vortex le mélange pendant 5 min. Ensuite, solubiliser HACE en ce que le mélange par tourbillons engendrés par le mélange pendant encore 5 min.
  2. Pour éliminer le solvant, la chaleur à 70 ° C pendant 4 heures sous un léger courant d'azote gazeux.
  3. Reprendre le film composé de HACE, HB, et le paclitaxel avec 1 ml de DDW. Filtrer avec un filtre à seringue (0,45 um de taille des pores) pour éliminer les médicaments non encapsulés.

3. In Vitro phototoxicité

  1. L'absorption des nanoparticules dans des lignées cellulaires de cancer du poumon
    1. Préparer (v / v) de sérum de fœtus bovin RPMI-1640 contenant 10% de milieu et 1% (p / v) de pénicilline-streptomycine.
    2. Cellules de pépins A549 dans des plaques à 24 puits de culture de cellules à une densité de 1 x 10 5 cellules / puits ( en triple pour chaquegroupe). Incuber pendant 24 heures à 37 ° C dans un CO 2 et 95% d'une atmosphère d'air humidifiée à 5%.
    3. Après la fixation des cellules, éliminer le milieu et laver les cellules en ajoutant 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    4. Dissoudre les nanoparticules dans du PBS à une concentration finale de 2 uM / ml de HB. Ensuite, incuber les cellules avec 1 ml de PBS, NPs vides, HB-NPs, ou HB-P-NPs dans chaque puits pendant 4 heures dans l'obscurité.
    5. Retirez tout de la solution et laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS froid. Répéter l'étape de lavage une fois de plus. Ajouter milieu de culture frais.
  2. test de viabilité cellulaire
    1. Placer la plaque de culture cellulaire sous la fibre PDT (avec 1 cm de distance de la fibre PDT pour le bien). Porter des lunettes de sécurité laser et illuminer les cellules avec un laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) dans l'obscurité pendant diverses périodes de temps: 0, 5, 10, 20, 30, et 40 sec (0, 2, 4 , 8, 12 et 16 J / cm 2). Ensuite, incuber les cellules pendant 24 heures dans l'obscurité.
    2. Aspirer le milieu et laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS froid. Répéter l'étape de lavage une fois de plus.
    3. Ajouter 10 pi de solution cytotoxicité de mesure dans chaque puits. Incuber dans l'obscurité pendant 2 heures.
    4. Mesurer l'absorbance à 450 nm en utilisant un lecteur de microplaques.
  3. L'analyse microscopique
    1. Placer la plaque de culture cellulaire sous la fibre PDT (avec 1 cm de distance de la fibre PDT pour le bien). Porter des lunettes de sécurité laser et illuminer les cellules avec un laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) dans l'obscurité pendant 0, 20, ou 40 sec (0, 8, ou 16 J / cm 2). Ensuite, incuber les cellules pendant 24 heures dans l'obscurité.
    2. Aspirer le milieu et laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS froid. Répéter l'étape de lavage une fois de plus.
    3. Ajouter 50 pi d'annexine V-FITC et 50 ul de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1,5 pg / ml). Secouer doucement la plaque et incuber pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
      REMARQUE: Utilisez annexine V-FITC du kit fluorescence microscope.
    4. Laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS froid. Répéter l'étape de lavage une fois de plus. Gardez les cellules dans du PBS frais. Identifier les cellules apoptotiques en utilisant la microscopie optique à grossissement 100X.
  4. tri Fluorescence cellulaire activé (FACS)
    1. Placer la plaque de culture cellulaire sous la fibre PDT (avec 1 cm de distance de la fibre PDT pour le bien). Porter des lunettes de sécurité laser et illuminer les cellules avec un laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) pour 0, 20, ou 40 sec (0, 8, ou 16 J / cm 2). Ensuite, incuber les cellules pendant 24 heures dans l'obscurité.
    2. Aspirer le milieu et laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS froid. Répéter l'étape de lavage une fois de plus.
    3. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de 1 x tampon de liaison (dilution 1 partie du tampon de liaison 10x, 0,1 M HEPES / NaOH (pH 7,4), 1,4 M de NaCl et 25 mM de CaCl 2 à 9 parties d' eau distillée) et transférer 100 pl de la solution d'échantillon à une 5 mltube de culture.
    4. Ajouter 5 pi d'annexine V-FITC et 5 pi d'iodure de propidium (PI). vortexer doucement le tube et incuber pendant 15 min à température ambiante (RT) dans l'obscurité. Ajouter 400 pi de 1 x tampon de liaison.
      REMARQUE: Utilisez annexine V-FITC et PI à partir du kit de fluorescence au microscope.
    5. Identifier les cellules apoptotiques en utilisant FACS 14. Les rayons laser d'excitation et de l'IP à l'annexine V-FITC sont 488 nm et 635 nm, respectivement. Mesurer l'émission de fluorescence de PI et de l'annexine V-FITC à 610 ± 20 nm et 660 ± 20 nm, respectivement. Recueillir les cellules acquises sur le cytomètre de flux pour 10.000 événements.

4. anticancéreuse in vivo l' efficacité chez les souris porteuses de tumeurs

  1. modèle de souris induite par le cancer du poumon
    1. Préparer 1 × 10 6 cellules A549 dans 0,1 ml de milieu RPMI-1640; le garder dans la glace.
    2. Anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de xylazine et un mélange de tilétamine et zolazépam (1: 2, 1 ml /kg). Confirmez anesthetization appropriée en pinçant doucement un petit pli de la peau de la souris. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
      NOTE: Si aucun mouvement est observé, l'animal est suffisamment anesthésié pour commencer les expériences.
    3. Injecter les cellules sous-cutanée dans les flancs gauche de BALB / C mâle souris nude (6 - 7 semaines, 20 - 22 g).
    4. Gardez l'observation de la souris jusqu'à ce qu'ils commencent à se déplacer autour de la cage.
      REMARQUE: Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à ce qu'il ait complètement récupéré. Gardez les souris sous (SPF) conditions exempts d'agents pathogènes spécifiques.
    5. Mesurer la taille de la tumeur avec étriers tous les jours. Calculer le volume de la tumeur (mm 3) (longueur x largeur 2) / 2. Lorsque la taille de la tumeur atteint environ 200 mm3 en volume, de commencer l'expérience.
  2. Anticancer étude d'efficacité
    1. Diviser aléatoirement les souris en 4 groupes (n = 10 pour chaque groupe).
    2. Anesthésier les souris avec une injection ip d'un xylazine et un mélange de tilétamine et zolazépam (1: 2, 1 ml / kg). Confirmez anesthetization appropriée en pinçant doucement un petit pli de la peau de la souris. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
      NOTE: Si aucun mouvement est observé, l'animal est suffisamment anesthésié pour commencer les expériences.
    3. Dissoudre les nanoparticules dans du PBS à une concentration finale de 2 mg / ml de HB. Injecter PBS, libre HB, HB-NPs, ou HB-P-NPs via la veine de la queue (2 mg / kg comme HB) deux fois aux jours 0 et 7.
    4. Gardez l'observation de la souris jusqu'à ce qu'ils commencent à se déplacer autour de la cage.
      REMARQUE: Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à leur entièrerétabli. Gardez les cages sombres et dans des conditions SPF spécifiques.
    5. 24 heures après chaque injection, anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de xylazine et un mélange de tilétamine et zolazépam (1: 2, 1 ml / kg). Confirmez anesthetization appropriée en pinçant doucement un petit pli de la peau de la souris. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
      NOTE: Si aucun mouvement est observé, l'animal est suffisamment anesthésié pour commencer les expériences.
    6. Placer le site de la tumeur sous la fibre de TPD (1 cm de distance de la fibre TPD à la tumeur). Porter des lunettes de sécurité laser, éteindre l'interrupteur, et illuminer la tumeur avec un laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) pour 500 sec (200 J / cm 2) deux fois aux jours 1 et 8.
    7. Gardez l'observation de la souris jusqu'à ce qu'ils commencent à se déplacer autour de la cage. Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Ne retournez pas un animal qui a undergonchirurgie de e à la compagnie d'autres animaux jusqu'à ce que complètement rétabli.
    8. Gardez les cages dans des conditions SPF. Maintenir les cages dans l'obscurité pendant 24 heures après le traitement au laser.
    9. contrôler visuellement le volume de la tumeur et les changements au niveau du site de la tumeur chaque jour. Mesurer la taille de la tumeur avec des étriers, et calculer le volume que (longueur x largeur 2) / 2 (mm 3). Prenez des photos de sites tumoraux tous les jours pour vérifier les modifications de la surface de la tumeur après PDT.
    10. Le jour 16, sacrifier cinq souris par groupe par l'anesthésie terminaux utilisant l'isoflurane.
    11. Avec des pinces et des ciseaux, couper la peau extérieure et exposer les tumeurs 15. les récolter avec précaution. Les fixer dans 10% de formaline, les incorporer dans de la paraffine, et les tacher avec de l' hématoxyline et de l' éosine (H & E) pour l'analyse histologique 16.
    12. Après 45 jours de surveillance, sacrifier les souris restantes par l'anesthésie terminaux utilisant l'isoflurane.

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Résultats

Nous avons préparé deux HB-NPs et HB-P-NPs avec les techniques mentionnées ci-dessus. Les diamètres moyens de HB-NPs et HB-P-NPs étaient 220,9 ± 3,2 nm et 211,9 ± 1,6 nm, respectivement.

La viabilité cellulaire des cellules A549 après 4 heures d'incubation avec du PBS, NPs vides, HB-NPs et HB-P-NPs suivie d' une irradiation de lumière (0 à 16 J / cm 2) est représentée sur la figure 1. Sans l...

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Discussion

L'étape la plus critique dans cette étude est de choisir les conditions de laser appropriés: longueur d'onde, la puissance et le temps d'irradiation. La longueur d'onde appropriée de lumière appropriée pour le photosensibilisateur spécifique est nécessaire pour la PDT. Nous avons utilisé un laser 630-nm qui était approprié pour hypocrelline B. La puissance de sortie est un autre facteur important, qui a été fixé à 400 mW / cm 2 sur la base de nombreuses études pilotes. Puissances de sortie sup...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par aucune subvention. 14-2014-017 du Fonds pour la recherche SNUBH.

Les auteurs remercient J. Patrick Barron, professeur émérite, Université de médecine de Tokyo et professeur adjoint, Hôpital Bundang Université nationale de Séoul pour sa pro bono édition de ce manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
acide oligo-hyaluroniqueBioland Co., Ltd._
DS-Y30 (céramide 3B ; principalement N-oléoyl-phytosphingosine)Doosan Biotech Co., Ltd.dihydrazide
d’acide adipiqueSigma AldrichA0638
N-(3-diméthylaminopropyl)-N&prime ; -éthylcarbodiimideSigma Aldrich39391
chlorure de 4-(chlorométhyl)benzoyleSigma Aldrich270784
Tween 80Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.T0546
Filtre à seringueSartorius Stedim Biotech GmbH1776215 mm, RC, PP, 0,45 & micro ; m
triéthylamineSigma AldrichT0886
Mini-GeBAflex tubesGene Bio-Application Ltd.D070-12-100
PaclitaxelTaihua Corporations_
RPMI-1640Gibco Life Technologies, Inc.11875
Pénicilline&ndash ; streptomycineGibco Life Technologies, Inc.15070
Sérum fœtal bovinGibco Life Technologies, Inc.
Célite (Agent filtrant)Sigma Aldrich6858Voir étape 1.4
16140071

Références

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