La combinaison humide et Techniques de laboratoire sec Guide pratique du Cristallisation de grandes superhélice contenant des protéines

Résumé

Nous décrivons un cadre intégrant une analyse biochimique et computationnelle simple pour guider la caractérisation et la cristallisation de grands domaines de bobines enroulées. Ce cadre peut être adapté aux protéines globulaires ou étendu pour incorporer une variété de techniques à haut débit.

Résumé

Obtenir des cristaux pour la détermination de la structure peut être une proposition difficile et longue pour n’importe quelle protéine. Les protéines et les domaines de bobine enroulée se trouvent dans toute la nature, cependant, en raison de leurs propriétés physiques et de leur tendance à s’agréger, ils sont traditionnellement considérés comme étant particulièrement difficiles à cristalliser. Ici, nous utilisons une variété de techniques simples et rapides conçues pour identifier une série de limites de domaine possibles pour une protéine à bobine enroulée donnée, puis caractériser rapidement le comportement de ces protéines en solution. Avec l’ajout d’une étiquette fortement fluorescente (mRuby2), la caractérisation des protéines est simple et directe. La protéine cible peut être facilement visualisée sous un éclairage normal et peut être quantifiée à l’aide d’un imageur approprié. L’objectif est d’identifier rapidement les candidats qui peuvent être retirés du pipeline de cristallisation parce qu’ils ont peu de chances de réussir, ce qui donne plus de temps aux meilleurs candidats et moins de fonds dépensés pour des protéines qui ne produisent pas de cristaux. Ce processus peut être itéré pour intégrer les informations obtenues lors des efforts de criblage initiaux, peut être adapté pour les procédures d’expression et de purification à haut débit, et est complété par un criblage robotisé pour la cristallisation.

Introduction

Détermination de la structure par cristallographie aux rayons X a apporté des contributions fondamentales à tous les domaines de la biologie moderne; fournissant une vue atomique des macromolécules qui soutiennent la vie et comment ils interagissent les uns avec les autres dans une variété de contextes; ce qui nous permet de comprendre les mécanismes qui causent les possibilités de maladies et de fournir à la conception rationnelle des médicaments pour traiter la maladie. Cristallographie a longtemps été la technique expérimentale dominante pour déterminer la structure macromoléculaire, et représente actuellement 89,3% de la base de données structurelle (www.rcsb.org). Cette technique présente de nombreux avantages, y compris le potentiel de très haute résolution, la possibilité de visualiser des macromolécules avec un large éventail de tailles, la collecte de données relativement facile, et la possibilité de visualiser comment la macromolécule interagit avec le solvant ainsi que des ligands.

Malgré de nombreuses améliorations technologiques dans l' expression de protéines recombinantes ^1,2, purification ^3, et la biologie moléculaire utilisé pour générer ces systèmes ^4, le principal obstacle dans le processus cristallographique reste la capacité à produire des cristaux de qualité de diffraction. Cela a été particulièrement vrai pour les protéines qui contiennent de grands domaines coiled-coil. Il a été estimé que jusqu'à 5% de tous les acides aminés se trouvent dans les bobines enroulées ^5,6, ce qui en fait une caractéristique structurelle très commun ^7, mais ces protéines sont souvent plus difficiles à purifier et cristalliser que les protéines globulaires ^8-10 . Ceci est encore aggravé par le fait que les domaines bispiralés sont souvent trouvées dans le contexte d'une protéine plus grande, par conséquent prédire correctement les limites de ces domaines est essentielle pour éviter l'inclusion d'une séquence non structurée ou flexible qui est souvent préjudiciable pour la cristallisation.

Ici, nous présentons un cadre conceptuel combinant calcul basé sur le Web avec des analyses experimental données sur le banc, pour aider les utilisateurs de guidage à travers les étapes initiales du processus cristallographique, notamment: comment sélectionner fragment (s) de protéines pour des études structurales, et la façon de préparer et de caractériser des échantillons de protéines avant les tentatives de cristallisation. Nous concentrons notre analyse sur deux protéines contenant de grands domaines coiled-coil, Shroom (SHRM) et Rho-kinase (Rock). Ces protéines ont été choisis car ils contiennent tous les deux des domaines bispiralés et sont connues pour former un complexe biologiquement pertinente ^11-16. Shroom et Rho-kinase (Rock) sont prévus pour contenir ~ 200 et 680 résidus de superhélice respectivement, de nombreuses portions qui ont été caractérisés structurellement ^17-20. La méthode décrite ici fournit un flux de travail simplifié pour identifier rapidement des fragments de superhélice contenant des protéines qui se prêter à la cristallisation, cependant, les techniques décrites peuvent être facilement adaptés pour la plupart des protéines ou complexes protéiques ou modifiés pour incorporer à haut débit approChes comme disponible. Enfin, ces méthodes sont généralement peu coûteux et peuvent être effectuées par les utilisateurs à presque tous les niveaux d'expérience.

Protocole

NOTE: Un diagramme du cadre conceptuel ou flux de travail est décrit dans la figure 1 pour référence. Le protocole peut être décomposé en quatre étapes: calcul des prédictions basées ou séquence, expression de protéines et de purification, caractérisation biochimique, et de cristallisation. Les exemples ci analysent les domaines Shroom SD2 et / ou complexes Shroom-Rock, mais ils peuvent être utilisés avec toute protéine.

1. Utilisez Établi outils Web pour générer des prédictions de calcul des limites du domaine superhélice

1. Collecter un Set Evolutionarily Diverse des séquences homologues.
   1. Allez à www.uniprot.org et tapez Shroom dans la barre de recherche supérieure.
   2. Sélectionnez les séquences à télécharger en cochant la case à côté de leur numéro d'accession. Sequences avec une étoile indiquent les séquences examinées par Uniprot et sont généralement plus fiables. Prenez soin de veiller à ce que toutes les séquences sont complètes et exactes.
   3. Enregistrer les s sélectionnésequences en cliquant sur le bouton Télécharger.
   4. Alignez la collection de séquences Shroom utilisant Clustal-Omega ²¹ (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Cliquez sur le bouton "Parcourir" pour sélectionner le fichier avec les séquences Shroom puis appuyez sur Soumettre.
   5. Après l'alignement est terminé, cliquez sur le bouton "Télécharger alignement File".
   6. Ouvrez l'alignement de séquences multiples généré en 1.1.5 en utilisant Jalview (Fichier | Alignement d'entrée | À partir du fichier). Dans la nouvelle fenêtre d'alignement, la couleur par l'identité (couleur | Pourcentage d'identité).
2. Calculer des prédictions de la structure secondaire, les prédictions de séquences souples ou désordonnée, et prédit les régions de superhélice dans la protéine (s) d'intérêt.
   1. Allez à http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, pour calculer les prévisions superhélice. Copiez et collez la séquence dans la boîte de séquence et cliquez sur Envoyer.
      NOTE: Cette analyse peut prendre quelques heures pour complete. Depuis séquences champis sont assez grandes, peuvent avoir besoin d'être divisé en blocs de moins de 1000 acides aminés pour tenir dans la contrainte de taille de la webserver les séquences. Lors de l'analyse Shrm2, il est recommandé que les C-terminaux de 1000 acides aminés sont utilisés comme cette section contient le domaine SHRM SD2 qui est connu pour contenir des régions bispirales. Lors de la répétition de cette analyse avec d'autres protéines, il est recommandé d'utiliser les séquences de protéines de pleine longueur, si possible. Si cela ne constitue pas une option, utilisez le plus grand fragment possible ou disséquer la séquence en fonction des données biochimiques ou fonctionnelles connues.
   2. Allez à http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, pour calculer les prévisions superhélice. Copiez et collez la séquence dans la boîte de séquence et cliquez sur Envoyer.
3. Combiner les résultats des étapes 1.1 à 1.2.2 en une seule annotation complète de la séquence Shroom.
   NOTE: Il est fortement encouragé à inclure également toute i pertinentenformation qui peuvent être tirées de la littérature ou d'autres sources au sujet de la fonction des protéines ou la purification à ce stade.
4. En utilisant cette séquence annotée complète, prédire les limites du domaine (ou une série de limites possibles) pour la protéine, en essayant d'optimiser la conservation et prédit les caractéristiques structurelles, tout en minimisant la quantité de séquence désordonnée ou flexible. Si elle est connue, la protéine résultante devrait conserver les propriétés fonctionnelles d'intérêt.

2. Express et purifier des protéines avec les limites du domaine identifiés dans la section 1

NOTE: Le but de cette section est d'utiliser une série de tests rapides et facilement quantifiables pour dépister les limites du domaine hypothétiques générés dans la section 1.

1. En utilisant des techniques classiques de biologie moléculaire, de générer un plasmide d'expression avec la séquence codante désirée dans le cadre à l' intérieur His ₁₀ -mRuby2-XH2 plasmide (voir la Figure 3 pour la carte d' un vecteure plus de détails).
2. Les niveaux d'expression de test pour chaque plasmide d'expression en utilisant BL21 (DE3) de E. coli ou d'une autre souche d'expression appropriée dans les médias autoinduction ¹ à la température ambiante pendant 18-24 h.
   1. Transformer des plasmides d'expression, ainsi que d'un contrôle plasmidique vide dans BL21 (DE3) en suivant les instructions fournies avec les cellules ou en utilisant le protocole de transformation robuste, comme celle ici (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial -transformation/).
   2. De la plaque fraîchement transformé, choisissez une seule colonie et développer une culture de départ de 5 ml à 37 ° C pendant la nuit dans Lysogénie Broth (LB) médias avec 34 pg / ml de kanamycine.
   3. Le lendemain, sédimenter la culture et laver le culot avec LB. frais
   4. Ajouter la culture starter à 50 ml de milieu de autoinduction avec 34 pg / ml de kanamycine. Permettre à la culture de se développer à la saturation soit à la température ambiante ou 37 ° C. En règle générale, pour croître ~ 18-24 h.
   5. cellule Pellets et congeler les culots cellulaires résultants à -80 ° C avant la purification indéfiniment.
   6. Comparer les extraits de cellules entières de chaque souche d'expression et le contrôle de vecteur vide par SDS-PAGE pour déterminer la souche qui produit le plus efficacement la protéine de fusion souhaitée. Pour ses ₁₀ protéines de fusion -mRuby2-Shroom SD2, exécutez 10% de gels de SDS-PAGE à 180 V pour ~ 50 min ou jusqu'à ce que le front de colorant atteigne le fond du gel ^22.
   7. Gel Stain au bleu de Coomassie pour visualiser les protéines cellulaires totales dans chaque souche ^23.
3. Effectuer une étape de chromatographie d'affinité initiale sur chaque souche qui a exprimé avec succès la protéine mRuby2-fusion. En règle générale, effectuer les étapes de purification 2.3.2-2.3.7 à la température ambiante, à moins que la protéine bénéficiera de conditions modifiées telles que l'épuration à 4 ° C.
   1. culots cellulaires Décongeler de l'étape 2.2.5.
   2. Remettre en suspension chaque culot cellulaire dans 1,5 ml de tampon de lyse (10% de glycerol, 500 mM de NaCl, 40mM d'imidazole, 20 mM de Tris pH 8,0, 1 mM de bêta-mercaptoéthanol). Compléter le tampon de lyse avec des inhibiteurs de la protéase, le cas échéant.
   3. Ajouter 30 ul de 10 mg / ml de lysozyme et on incube à température ambiante pendant 20 min. Soniquez suivant les instructions de l'instrument utilisé.
   4. Transférer dans un tube de 1,5 ml et centrifuger dans une centrifugeuse de table pendant 30 minutes à 14.000 xg pour sédimenter les matières insolubles ou des cellules non lysées. Enregistrer la fois surnageant et le culot pour une analyse ultérieure par SDS-PAGE.
   5. Réaliser une purification par affinité au nickel, l'incubation de la fraction soluble avec 100 ul de billes de Ni-NTA. Incuber les perles avec lysat soluble pendant 5-10 minutes, retournant plusieurs fois pour mélanger des billes.
   6. Centrifuger à 800 g pendant 30 secondes dans une centrifugeuse de table pour pastiller les billes. Laver ensuite le culot 3-5 fois avec du tampon de lyse pour nettoyer des contaminants non spécifiques.
   7. Éluer Ruby protéine de fusion des billes avec du tampon de lyse supplémenté avec 1M d'imidazole.
   8. Utilisez SDS-PAGE pour comparer le comportement de ses-mRuby2-Shroom protéines dans la purification "rapide et sale" ci-dessus.

3. Caractériser Protein échantillon pour identifier ceux avec des propriétés avantageuses

1. Utilisez un ensemble de spectrophotomètre à 280 nm pour mesurer la concentration de la protéine de fusion Ruby, puis évaluer l'homogénéité de l'échantillon en chargeant 1-5 pg de protéine de fusion sur un gel PAGE natif ^24. Exécutez le gel à 10% PAGE native à 4 ° C pendant 140 min à 175 V.
   1. Imager la PAGE native en utilisant un imageur équipé pour visualiser la fluorescence, l'observation où la fusion étiquetée mRuby migre dans cet essai.
      REMARQUE: Veillez à respecter la protéine de fusion qui est coincé dans le puits de cette protéine est probablement agrégées. Si un imageur de fluorescence ne sont pas disponibles, on peut souvent visualiser et image concentrée échantillons de Ruby tagged protéines sous une lumière noire ou avec une boîte de lumière UV.
2. Effectuer une protéolyse limitée pour identifier les domaines de manière stable pliées. Incuber 95 pi de Ruby-SHRM SD2 fusion à ~ 1 mg / ml avec 5 pi de 0,025% subtilisine A.
   1. Échantillonner la réaction à des points de temps de 0, 0,5, 2, 5, 15, 60 et 120 minutes, en enlevant 10 ul de la réaction pour chaque point de temps et de visualiser la progression de la réaction par SDS-PAGE en utilisant un gel d'acrylamide à 15% .
   2. Se colorent en bleu de Coomassie comme à l'étape 2.2.7 et à évaluer si une espèce résistant à la protéase peuvent être identifiés.
3. Intégrer les données de l'efficacité de la purification, le comportement en PAGE natif, et la protéolyse limitée sur les protéines de fusion mRuby2-Shroom partiellement purifiés à une évaluation globale du comportement global de ces protéines en solution.
   1. (Facultatif) Si un test fonctionnel approprié est disponible, vérifier l'activité à ce stade.

4. Produire des cristaux de haute qualité de la Coiled-coil SD2Domaine de Shroom

NOTE: Toutes les étapes dans la section 4.1 sont réalisées à température ambiante, sauf la protéine bénéficierait d'une purification à une température différente, habituellement de 4 ° C.

1. En utilisant les 50 ml excroissances comme une estimation approximative de l'expression et le potentiel de purification, effectuer de grandes expressions à l'échelle de mRuby2-Shroom SD2 dans le but de parvenir à 5-20 mg d'échantillon complètement purifié. Typiquement 2 L de la culture fournit du matériel de départ adéquat. Après que les cellules de granules de croissance par centrifugation à 8000 xg pendant 10 min.
   1. Reprendre le culot de la croissance de 2 L dans un tampon de lyse comme avant, en utilisant ~ 2 ml de lyse par gramme de culot cellulaire congelé en cas d'utilisation du lysozyme pour la lyse. Alternativement, resuspendre à ~ 8 ml / g de granulés en cas d'utilisation d'un homogénéisateur ou presse française. Pellet débris cellulaires par centrifugation à 30.000 xg pendant 30 min.
   2. Lier par lots à partir de la fraction soluble 4.1.1 en utilisant 10 ml de résine Ni-NTA. Verser dans la colonne de gravité appropriéeet permettent les protéines non liées à écouler.
   3. Résine de lavage 3-5 fois avec 40 ml de tampon de lyse, suivis d'un lavage avec du tampon de lyse additionné de 1 M de NaCl.
   4. Résine lavage avec 40 ml de tampon de lyse supplémenté avec 80 mM d'imidazole.
   5. Éluer la protéine de fusion rubis Shroom avec 40 ml de tampon de lyse additionné de 1 M d'imidazole. fractionner manuellement la protéine éluée dans 4-10 ml fractions.
   6. Confirmer les fractions contenant rubis Shroom protéine de fusion en utilisant 10% de SDS-PAGE.
   7. Dialyser fractions appropriées (fractions typiquement 2-4) dans 8% de glycérol, 250 mM de NaCl, mM imidazole 15, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM β-ME, en utilisant 6-8 tube de dialyse MWCO kDa. Ajouter 1 mg de protéase TEV 25-50 pour chaque mg de protéine de fusion. Dialyser nuit à température ambiante sous agitation lente.
   8. Répéter la purification d'affinité de nickel étapes 4.1.2. à 4.1.6. Le domaine Shroom SD2 devrait maintenant rester dans la fraction non liée tandis que le son ₁₀ -mRuby2 restera lié àla résine et se trouvent dans les fractions d'élution. Confirmez cela en utilisant 12% de SDS-PAGE coloration au bleu de Coomassie.
   9. Dialyser les fractions contenant Shroom SD2 dans le domaine de 8% de glycerol, 100 mM de NaCl, 20 mM de Tris pH 8,0, tampon de bêta-mercaptoéthanol 5 mM pendant une nuit.
   10. Effectuer une chromatographie d'échange d'anions en utilisant un ²⁵ FPLC, et en éluant avec un gradient de NaCl 0,1 à 1,0 M de NaCl. Analyser les fractions en utilisant 12% de SDS-PAGE.
   11. En utilisant un concentrateur de filage (MWCO de 10 kDa ou plus en fonction de la protéine à l'étude), on concentre les fractions pics à ~ 0 mg / ml, puis effectuer une chromatographie d' exclusion de taille ^26, l' analyse des fractions de pic par 12% de SDS-PAGE.
   12. Piscine fractions de pic et dialyser dans 20 mM de Tris pH 8,0, NaCl 50 mM, 2% de glycerol, 1 mM β-ME et concentrées à 10 mg / ml avant la cristallisation.
       Facultatif: Au cours de cette étape, enlever des échantillons de 5 ul à des concentrations de 1, 2, 5 et 10 mg / ml au cours de la concentration de l'échantillon.Exécuter un natif PAGE loading 2-5 pi de chaque échantillon à examiner le comportement de l'échantillon au cours de cette étape.
2. Screen un petit tableau de 12 conditions pour identifier une concentration optimale en protéines pour les essais de cristallisation. La composition de ces conditions est décrit dans la figure 7.
   1. À l'aide de 24 puits assis déposer des plateaux de cristallisation, effectuer des essais de cristallisation selon la méthode de diffusion de la vapeur, le pipetage de 500 ul de chacun des 12 conditions dans des puits séparés, suivie par les gouttes contenant initialement 1 pi de solution bien et 1 pi d'échantillon de protéine sur les lamelles couvre- . S'il vous plaît voir ²⁷ pour plus d' informations sur cette technique.
   2. sceller rapidement le plateau avec du ruban adhésif transparent et déplacer le plateau dans un environnement contrôlé de température appropriée qui est exempt de vibrations. La température utilisée peut varier, mais 4 ° C, 16 ° C et 20 ° C sont très fréquentes.
   3. Examiner les gouttes dans les bacs au cours de la 3 suivante days à l'aide d'un microscope à grossissement jusqu'à 100x. A la fin de la période de 3 jours, marquer chaque goutte comme contenant pas de précipitation (clair), de faibles précipitations, de fortes précipitations (brun), ou de cristaux. Une concentration de protéine appropriée ne doit pas contenir plus de 6 fortes précipitations.
   4. En utilisant la concentration de la protéine identifiée dans 4.2, cribler une large gamme d'écrans de cristallisation disponibles dans le commerce. L'utilisation d'un robot de manipulation ou d'une cristallisation du liquide accélère grandement le processus, tout en minimisant les erreurs dans les gouttes. Elle exige beaucoup moins de protéines aussi bien, permettant à l'utilisateur de l'écran plusieurs conditions avec un seul échantillon.
   5. Améliorer les conditions initiales identifiées à partir de larges écrans en faisant varier systématiquement chacune des variables à l'intérieur de la goutte de cristallisation en utilisant les 24 puits des plateaux de criblage comme précédemment.

Résultats

Un diagramme illustrant le flux utilisé dans ce système est représenté sur la figure 1 et comprend trois étapes principales. analyse computationnelle de la séquence est utilisée pour formuler des hypothèses sur les limites du domaine de la protéine superhélice d'intérêt. Un exemple d'une analyse annotée du domaine Shrm2 SD2 est représenté sur la figure 2. Dans ce schéma, l'objectif était d'identifier les limites possibles de domaine pour un domaine conse...

Discussion

Le protocole décrit ici est conçu pour aider l'utilisateur à identifier les limites du domaine au sein de grandes protéines superhélice pour faciliter leur cristallisation. Le protocole repose sur une intégration globale d'une série de données à partir des prédictions de calcul et d'autres sources pour générer une série de limites des domaines potentiels. Ils sont suivis par une série d'expériences biochimiques qui sont rapides et peu coûteux, et qui sont utilisés pour affiner ces premières hypothèses. E...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BL21(DE3) Rosetta	Emd Millipore	70954-3
BL21(DE3) Star	ThermoFisher Scientific	C601003
BL21(DE3) Codon Plus	Agilent Technologies	230245
Lysozyme	Spectrum Chemical Mfg Corp	L3008-5GM
Résine Ni-NTA	Life Technologies	25216
SubtilisinA	Spectrum Chemical Mfg Corp	S1211-10ML
24 puits Cryschem Plate	Hampton research	HR3-160
INTELLI-PLATE   ; 96 :	Art Robbins Instruments	102-0001-03
PEG 3350	Hampton research	HR2-591
PEG 8000	Hampton research	HR2-515
PEG 400	Hampton research	HR2-603
PEG 4000	Hampton research	HR2-605
pcDNA3.1-Clover-mRuby2	Addgene	49089
Overnight Express Autoinduction System 1	Emd Millipore	71300
Lysogeny Bouillon en poudre	ThermoFisher Scientific	12795027  ;