Method Article

Conception et mise en œuvre d'un Illuminating automatisé, la culture, et du système d'échantillonnage pour Microbial optogénétiques Applications

DOI:

10.3791/54894

⸱

February 19th, 2017

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons conçu un appareil de culture en continu destiné à être utilisé avec des systèmes optogénétiques pour éclairer les cultures de micro-organismes et cellules d'image régulièrement dans l'effluent avec un microscope inversé. La culture, l'échantillonnage, l'imagerie et l'analyse d'images sont entièrement automatisées afin que les réponses dynamiques à l'éclairage peuvent être mesurés sur plusieurs jours.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

systèmes optogénétiques utilisent des protéines génétiquement codés qui changent de conformation en réponse à des longueurs d'onde spécifiques de la lumière pour modifier les processus cellulaires. Il existe un besoin pour la culture et la mesure de systèmes comprenant un éclairage programmé et la stimulation des systèmes optogénétiques. Nous présentons un protocole pour la construction et l'utilisation d'un appareil de culture en continu pour éclairer des cellules microbiennes avec des doses programmées de lumière, et automatiquement d'acquérir et analyser des images de cellules dans l'effluent. Le fonctionnement de cet appareil permet chémostat le taux de croissance et l'environnement cellulaire à être étroitement contrôlés. L'effluent de la culture cellulaire continue est régulièrement prélevé et les cellules sont imagées par microscopie à canaux multiples. La mise en culture, l'échantillonnage, l'imagerie et l'analyse d'image sont entièrement automatisées de sorte que les réponses dynamiques de l'intensité de fluorescence et de la morphologie cellulaire des cellules prélevées à partir de l'effluent de la culture sont mesurés sur plusieurs jourssans intervention de l'utilisateur. Nous démontrons l'utilité de cet appareil de culture en induisant de façon dynamique la production de protéines dans une souche de Saccharomyces cerevisiae conçu avec un système de optogenetic qui active la transcription.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systèmes optogénétiques utilisent la lumière pour contrôler une liste croissante des processus cellulaires , y compris l' expression des gènes, 1, 2, 3, 4, 5 localisation des protéines, l' activité 6 de protéines, 6, 7, liaison 8 protéines, 8, 9, 10 et la dégradation des protéines. 11 Un procédé de culture de cellules dans un environnement contrôlé avec une stimulation optique programmée et pour mesurer leur réponse sur des périodes biologiquement pertinentes est nécessaire pour exploiter le potentiel de ces outils pour la recherche en biologie cellulaire et la biotechnologie. Notre procédé met à profit chemostasis pour maintenir un taux de croissance de la constante de cellule dans un endroit bien mélangé, aenominale, et le récipient de culture en verre à température contrôlée 12, 13 qui est exposé à un éclairage programmé. Nous, l'image cellules individuelles dans l'effluent de la culture avec un microscope inversé pour mesurer la réponse de la culture à un éclairage programmé. La mise en culture, l'échantillonnage, l'imagerie et l'analyse d'image sont entièrement automatisées de sorte que l'intensité de la fluorescence et de la morphologie cellulaire de la culture cellulaire des effluents peuvent être mesurés sur plusieurs jours sans intervention de l'utilisateur.

Ce protocole peut être mis en oeuvre dans la plupart des laboratoires familiers avec la culture et la microscopie de cellules en croissance, et l'appareil utilisé est peu coûteux et constitué de composants facilement disponibles. Un récipient de culture transparente est placée au- dessus d' une matrice de diodes électroluminescentes (DEL) capables d'émettre une uW / cm 2 à 10 mW / cm2 de lumière. Les microbes sont cultivées dans un récipient de culture en continu; une pompe péristaltique est utilisée pour ajouter des médias à lataux de dilution, un autre sert à retirer la culture à un taux inférieur au microscope, et la différence sort par une sortie de trop-plein. Un coussin chauffant pour maintenir la température. De l'air est continuellement pompée dans le récipient de culture pour maintenir une pression positive, ainsi que pour mélanger et oxygéner la culture. À l'exception de la pompe à air, l'alimentation de ces dispositifs est régulée par un microcontrôleur qui reçoit également une entrée d'un thermomètre et d'un ordinateur connecté. La culture cellulaire effluent est pompé vers un dispositif microfluidique sur la platine d'un microscope inversé. Non-fluorescent et images fluorescentes sont automatiquement acquises. Les cellules dans les images sont caractérisées par un algorithme qui permet de localiser chaque cellule en tant que région d'intérêt (ROI) et mesure les propriétés de chaque ROI.

Pour démontrer une application de ce protocole, nous avons mesuré la réponse à différentes intensités lumineuses des cellules Saccharomyces cerevisiae modifiées avec une responsa lumière bleueve optogenetic système qui contrôle la transcription de la protéine fluorescente. S. cerevisiae, communément connu sous le nom de levure de boulanger, a été choisi parce que plusieurs systèmes optogénétiques pour contrôler l' expression génique dans ce système il existe déjà 14, 15, 16. En outre, cet organisme modèle est couramment utilisé pour les études de la biologie des systèmes 17 et en tant que châssis pour des applications biotechnologiques 18, 19, 20. Les résultats représentatifs montrent que ce protocole peut être utilisé pour contrôler la transcription d'une culture pendant plusieurs jours en faisant varier les intensités lumineuses d'entrée et en mesurant la production d'un rapporteur fluorescent.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-protocol-1

Figure 1: Le dispositif de culture continue. Ce schéma simplifié montre comment l'appareil doit être assemblé quand il est utilisé pour la culture, illuminer, et à mesurer les propriétés optiques des microbes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-protocol-2
Figure 2: Vue d' ensemble du protocole. Les étapes de la région ombrée doivent être répétées chaque fois que le protocole est utilisé. Le contrôle en boucle fermée est possible 34, mais n'a pas été mis en œuvre dans ce protocole.

1. Monter le thermomètre à la carte de circuit imprimé


Figure 3: Connexions à lire les valeurs du thermomètre. Ce diagramme montre comment le thermomètre numérique doit être connectée à la carte PCB de sorte que le microcontrôleur peut obtenir une rétroaction pour contrôler la température de la culture. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
  1. Souder le sol, des données et des lignes de tension positive du thermomètre numérique à leur respectif à travers des trous marqués "GD + V."
  2. Coupez une broche à partir d'une tête à 3 broches femelle et couper les 2 broches restantes avec un coupe-fil, de telle sorte qu'il peut tenir dans les deux trous traversants étiquetés «R2» et pas obstruer le microcontrôleur. Soudez cela en place. Connecter les deux broches soudées en insérant une résistance de 4,7 kQ dans l'en-tête de la broche.

2. Connectez le Con PuissanceComposants TROL au Circuit Board

figure-protocol-3
Figure 4: Connexions pour contrôler l' alimentation du coussin chauffant. Ce diagramme montre comment les parties de PCB et accessoires doivent être assemblés afin de contrôler l'alimentation du coussin chauffant. Les pièces à contrôler les pompes péristaltiques sont reliées d'une manière similaire. On notera que les composants pour le thermomètre ont été supprimés pour plus de clarté. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Coupez 1 cm des broches de cinq embases femelles 3 broches. Soudez les aux positions sur la carte de circuit imprimé (PCB) marqué comme "# 1", "# 2", "# 3", "# 4" et "CB E."
  2. Coupez 1 cm des broches d'un 6 broches et 8 broches connecteur femelle. Souder celles-ci côte à côtela colonne des trous à travers marqué K1 par K14.
  3. Connectez le coussin chauffant à la carte de circuit imprimé.
    1. Insérez les extrémités d'une résistance de 100 kQ dans le K1 trous traversants étiquetés et K2 sur le PCB. Insérer un transistor à effet de champ métal-oxyde-semiconducteur (MOSFET) dans la position marquée # 1 sur le circuit imprimé, l'étiquette du MOSFET tournée vers l'K1 à travers K14 trous traversants de sorte que l'axe de la source est plus proche de la "# "étiquette, et la tige d'évacuation est la plus éloignée du label" # ".
    2. Couper la ligne de la (DC) Câble d'alimentation 5 V courant de terre et le connecter à J2. Connectez la ligne du coussin chauffant à J1 au sol. Connectez K3 à la broche 3 avec une résistance de 1 kQ. Actuel devrait maintenant seulement couler de J1 à J2 lorsque la broche 3 est réglé sur + 5V.z
      REMARQUE: Les fonctions de réglage de résistance / MOSFET comme un interrupteur qui permet au courant de circuler de la broche J1 à J2 lorsque la broche 3 du microcontrôleur est réglé sur +5 V.
  4. Relierla pompe péristaltique lente.
    1. Insérer les extrémités d'une résistance de 100 kQ dans le K4 trous traversants marqués et K5 sur le PCB. Insérer un transistor MOS dans la position marquée # 2 sur le circuit imprimé, l'étiquette du MOSFET tournée vers l'K1 à travers K14 trous traversants de sorte que l'axe de la source est plus proche de l'étiquette "#", et l'axe d'écoulement est la plus éloignée du label "#".
    2. Couper la ligne du DC câble 12 V d'alimentation de la pompe péristaltique lente du sol. Raccorder la pompe péristaltique face fin à J3 et la verrue mur face fin à J4. Connectez K6 à la broche 4 avec une résistance de 1 kQ. Actuel devrait maintenant seulement couler de J3 à J4 lorsque la broche 4 est réglé sur +5 V.
  5. Raccorder la pompe péristaltique rapide
    1. Insérez les extrémités d'une résistance de 100 kQ dans la K7 trous traversants étiquetés et K9 sur le PCB. Insérez un MOSFET dans la position marquée n ° 3 sur le circuit imprimé, avec l'étiquette du MOSFET tournée vers le K1 par K14 à travers des trous s o que la broche de source est plus proche de l'étiquette "#", et la tige de vidange est le plus éloigné de l'étiquette "#".
    2. Couper la ligne du DC câble 12 V d'alimentation de la pompe péristaltique rapide au sol. Raccorder la pompe péristaltique face fin à J5 et la verrue mur face fin à J6. Connectez K9 à la broche 5 avec une résistance de 1 kQ. Actuel devrait maintenant seulement couler de J5 à J6 lorsque la broche 5 est fixé à +5 V.

3. Branchez la matrice LED à la carte de circuit imprimé

figure-protocol-4
Figure 5: Connexions pour contrôler la matrice de LED. Ce diagramme montre comment la matrice de LED doit être connecté à la carte. Elle montre également que le circuit imprimé peut être empilé sur le microcontrôleur. On notera que les composants pour le thermomètre et pour commander l'alimentation CC à d'autres dispositifs ont été supprimés pour plus de clarté.es / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Soudez le 6 broches, 10 broches, et les deux têtes de broches femelles 8 broches dans les trous traversants sur les côtés du PCB de telle sorte qu'il peut être empilé sur le dessus du microcontrôleur.
  2. Soudez le 100 nF et les 10 condensateurs uF à leurs positions marquées sur le PCB, en notant que la borne négative du 10 condensateur de pF (plomb plus courte) doit être relié au trou de passage marqué d'un signe négatif.
  3. Souder le conducteur de LED à l'ensemble 2 par 12 des trous traversants, dans le renfoncement sur le conducteur loin de la traversée des trous réservés à la matrice de LED.
  4. Soudez 2 colonnes de têtes de broches mâles aux trous traversants marqués pour la matrice de LED, et couper les extrémités de ceux-ci sous le breadboard de telle sorte qu'ils ne seront pas obstruer le microcontrôleur. Reliez ces deux bandes 8 fils de fils de connexion femelle / femelle. Connecter un second jeu de sexe masculintêtes de broches à l'autre extrémité des fils de connexion.
  5. Insérez la matrice de LED sur la médiane de la planche à pain, puis insérez le deuxième jeu de têtes de broches pour les colonnes de chaque côté de la matrice. Faire en sorte que les connexions électriques sont les mêmes que si la matrice de LED a été directement reliée au circuit imprimé avec la face imprimée de la matrice correspondant à la colonne marquée de trous traversants.
  6. Coupez une broche à partir d'une tête à 3 broches femelle et couper les 2 broches restantes avec un coupe-fil, de telle sorte qu'il peut tenir dans les deux trous traversants étiquetés "R1" et pas obstruer le microcontrôleur. Soudez cela. Connecter les deux broches soudées en insérant une résistance de 1 kohm dans l'en-tête de broche.
    Remarque: Le récipient de culture est empilé au-dessus de la matrice de LED. Si les rubans de fils obstruer le vaisseau, les décalé par rapport à la matrice. Ensuite, utilisez un fil de base solide pour combler l'écart entre les broches de la matrice et les broches de ruban de fil, tels que les connexions électriques ne pas change.

4. Installer le logiciel et se connecter au matériel

  1. Empilez le PCB sur le microcontrôleur.
  2. Suivez les liens dans la liste des matériaux pour télécharger l'environnement de développement intégré (IDE) et un code personnalisé pour le microcontrôleur.
  3. Connectez le microcontrôleur à l'ordinateur via un câble microscope universel AB bus série (USB). Compiler et télécharger le code personnalisé au microcontrôleur.
  4. Télécharger Micro-Manager 21, 22 et FIDJI 23. Configurer Micro-Manager comme un plugin FIDJI en copiant tous les fichiers ".DLL", le répertoire "mmplugins" et le répertoire "mmautofocus" dans le répertoire où Micro-Manager a été téléchargé dans le répertoire "Fiji.app". Aussi, copier les "plugins / Micro-Manager" répertoire dans le répertoire "Fiji.app/plugins".
  5. Télécharger le "BioreactorController.jar" fichier into le répertoire "Fiji.app/mmplugins".
  6. Ouvrez Micro-Manager de FIDJI> Plugins> Micro-Manager> Micro-Studio Manager. Utilisez l'Assistant de configuration du matériel pour configurer le logiciel pour contrôler le microscope. Inclure le dispositif "FreeSerialPort" dans l'Assistant avec l'étiquette du port auquel le câble USB AB est connecté.

5. Assurez-vous et Caractériser le boîtier étanche à la lumière pour le récipient de culture

  1. Empiler trois supports de circuits intégrés 8 broches en tant que blocs de construction sur la carte de test à chaque coin de la matrice de LED de telle sorte que le récipient de culture peut reposer sur eux au-dessus de la matrice.
  2. Fixer une partie du papier de diffusion sous la couche supérieure des douilles, de telle sorte que la lumière frappant le récipient de culture à partir de la matrice de LED est diffuse.
  3. Découpez trois 8 "par 6" portions de mousse noire. Couper une partie qui est la même taille que la carte de test électronique (2,3 "x 3,5") à partir de l'intérieur de la première two et d'une partie qui correspond à la taille du rectangle réalisé par les supports de circuits intégrés (0,9 "x 1,8") à partir de l'intérieur de la troisième. Empiler ces couches sur la matrice de LED de telle sorte que la couche finale contenant le "x 1,8" 0,9 se trouve l'ouverture, même avec la partie supérieure des supports de circuits intégrés, et entoure la matrice LED.
  4. Coupez une feuille supplémentaire de mousse noire en deux pour faire un rectangle 6 "par 24". Rouler dans cette colonne creuse de mousse noire que le récipient de culture peut loger dans la chambre avec des tubes et des câbles, de telle sorte qu'il thermiquement et isoler optiquement le récipient de culture.
  5. Centre de la colonne creuse de mousse noire sur la matrice de LED, et marquer la limite de la colonne sur la couche de mousse noire en dessous. Cette frontière marquera où il doit être centré dans l'avenir.
  6. Découpez un 3 "x 3" portion de mousse noire. Utilisez plus tard comme un couvercle qui peut être collé sur le haut de la colonne pour bloquer la lumière extérieure.
  7. Fixez le capteur de puissance de photodiode à th e la culture casquette de navire avec du ruban adhésif, fixer le capuchon, et insérer le récipient de culture dans l'enceinte.
  8. Dans Micro-Manager, accédez à Plugins> bioréacteur Controller. Réglez la matrice pour éclairer à un sous-ensemble de la gamme d'intensités possibles à 30 s d'intervalle.
  9. Enregistrer les intensités lumineuses comme montré sur la console wattmètre reliée au capteur de courant. Ces mesures permettront à l'intensité réelle de la lumière pour être connu lorsque le nombre de voyants qui sont allumés et (PWM) courant de largeur d'impulsion modulée à ces DEL est réglé.

6. Préparer le récipient de culture

figure-protocol-5
Figure 6: les connexions des navires. Ce diagramme montre comment le récipient et le tube de l'appareil doivent être connectés avant d'être passés à l'autoclave.blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Marquer la hauteur correspondant à chaque incrément de 2 ml de liquide dans la plage de 10 ml à 30 ml dans le récipient de culture. Insérez 10 ml d'eau déminéralisée stérile, marquer le niveau d'eau, ajouter 2 mL, marquer le niveau d'eau, et répéter jusqu'à ce que le niveau de 30 ml est marqué. Couvrir les marques avec du ruban adhésif transparent de sorte qu'ils ne sont pas faciles à enlever et éliminer le liquide.
  2. Placer la partie longue de l'orifice d'aluminium à travers le joint de silicone, dans le récipient de culture. Visser le bouchon.
  3. Couvrir une sortie de port court aluminium avec 1/16 "tube ID de silicium. Branchez l'extrémité distale par l' insertion d' un luer lock femelle, puis la connexion d' un bouchon luer lock mâle. Cette sortie est complémentaire, et ne sera pas utilisé (tube 6 sur la figure 6 ).
  4. Connectez deux courts segments de 1/16 "tube de silicone d'identité avec des serrures mâles et femelles luer. Branchez une extrémité à une prise de port court d'aluminium et de brancher le distal extrémité avec un luer mâle et femelle luer prise serrure. Le navire sera inoculé à travers ce tube (tube 7 / 7.1 à la figure 6).
  5. Connecter deux 1/16 "tubes d'identité aux extrémités du 1/16" ID tubes et connecteurs péristaltique. Branchez une extrémité à un port d'aluminium court et branchez l'autre (tube 4 sur la figure 6). Par la suite, ce sera reliée au flacon de support.

7. Préparer le Flask Média

  1. Connecter un "tube de diamètre interne (ID) de silicone sur le port d'aluminium le plus long. Le tube doit être assez long pour atteindre le ballon de médias. Connecter un 1/8" 1/16 luer serrure ID mâle à un court segment de 1/16 " tube ID, connectez ce au tube précédent ,, puis insérer ce court segment dans le bouchon en caoutchouc sur le ballon des médias (tube 3 dans la figure 6).
  2. Fixer le tube. Cette connexion permet à l'air de circuler de la fiole de support au récipient de culture. Lorsque le ballon de médias est ensuite pompée avec un aird ce tube est desserrée, la culture sera mélangé, aéré, et maintenu à une pression positive par les bulles entrants.
  3. Insérez un «tube ID assez long pour atteindre le fond du flacon dans le bouchon, à travers laquelle les médias seront transférés. Branchez un autre 1/16" 1/16 tube ID à celui-ci, puis un tube 3/16 "ID à que. Branchez cela avec un "ID luer lock femelle 3/16 et un bouchon luer lock mâle (tube 1 / 1.1 sur la figure 6).
  4. Le troisième trou dans le bouchon doit être rempli avec un court segment de 1/16 "tube d'identification, connecté à deux autres segments de tubes de diamètre moyen et obturé à l'extrémité distale (tube 2 / 2.1 sur la figure 6). Cela sera connecté une pompe à vide et ensuite à une pompe d'aquarium.
    NOTE: Si le tuyau ne rentre pas facilement à travers les trous dans le bouchon en caoutchouc, couper les extrémités du tube en biais. Ensuite, l'extrémité inclinée qui est poussé à travers le trou peut être utilisé pour tirer le reste à travers.

  1. Insérez un verrou de luer mâle dans un segment de 1/16 "tube de silicone d'identité, puis insérez fermement 0,022" ID polytétrafluoroéthylène (PTFE) tube. Séparément, joindre un luer lock femelle à un 1/16 "tube d'identité. Ensuite, le fil d' une extrémité le long du tube de PTFE pour relier les serrures et l'autre à un port d'aluminium court (tube 5 sur la figure 6).
  2. Connectez le "tube de silicone d'identification au 1/50" 1/50 exposés tube et connecteurs péristaltique ID. Pour cela, connectez trois segments de 1/50 "tube ID et deux segments de 0,022" tube ID de PTFE, en les alternant. Connectez - le à la fiole d' effluent via 1/16 "tube ID (tube 5 dans la figure 6).
  3. Relier une extrémité d'un tube 16/1 "de silicone d'identification au deuxième tube le plus long de l'orifice d'aluminium et l'autre extrémité dans le ballon de l'effluent. Ce tube d'aluminium définit le volume de la culture et de la culture en excès se déverse dans le réservoir d'effluents (tube 8
  4. Autoclave l'ensemble de la culture à 121 ° C et 15 psi (stérilisation générale) pendant 30 min.
    Remarque: Les tubes à travers lesquels le flacon de support est rempli, à travers lequel le flacon de média est aspiré et à travers laquelle le récipient de culture est inoculé avoir de multiples segments de tube de sorte que si le segment distal est contaminé, il peut être enlevé pour révéler une stérile segment.

9. Préparer le canal microfluidique

  1. Mélanger les huiles polydiméthylsiloxanes (PDMS) et un agent de durcissement dans un rapport de 9 à 1. Degas et versez sur le moule maître de silicium.
  2. Cure PDMS pendant 2 heures à 65 ° C, puis le couper du masque avec une lame de rasoir. Couper autour des PDMS jusqu'à ce qu'elle se détache du moule. Évitez de pousser vers le bas et briser la plaquette fragile.
  3. Utilisez un 1,2 mm ID trou biopsie perforateur pour percer des trous aux deux extrémités de la chaîne.
  4. Liaison Plasma les PDMS à la vitre de couverture 24.
  5. Tape le temps les extrémités de la lamelle couvre-objet sur le châssis de support en aluminium de telle sorte que le canal de PDMS est centrée sur le châssis en aluminium, et puis cuire le PDMS à nouveau pendant 2 h à 65 ° C.

10. Remplissez la Flasque Médias

figure-protocol-6
Figure 7: Ajout de médias. Ce diagramme montre comment les médias doivent être filtrés sous vide dans le ballon de médias. Il veille à ce que les médias reste stérile. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Faire les médias appropriés. Si le système de culture en continu sera exploité comme un chemostat, utiliser les médias limitées pour un nutriment spécifique.
    NOTE: Des exemples de composition de support standard pour les études avec S. cerevisiae ont été publiées précédemment 25,= "xref"> 26, 27, 28, 29.
  2. Fixer le filtre à vide à une bouteille de 100 ml, retirez le couvercle du mamelon, puis retirez la fiche blanche du mamelon du filtre à vide avec des pincettes stériles.
  3. Connectez le tube de silicone 3/16 "ID du mamelon, un autre tuyau libre du flacon de médias à une pompe à vide (tubes 1 et 2 de la figure 7, respectivement), et veiller à ce que le tube reliant le ballon de support au récipient de culture est serré fermer (tube 3 sur la figure 7).
  4. Remplissez le filtre avec les médias, tourner sur la pompe à vide, puis filtrer le reste des médias. Fixer le tube de silicone 1/16 "ID relié au vide (tube 2 dans la figure 7) et éteindre la pompe à vide.
  5. Retirer les their du segment intermédiaire de 1/16 "ID tube relié à la pompe à vide de sorte qu'une extrémité non contaminée du tube est accessible. Insérez ee extrémité bleue d'un filtre à air de la seringue stérile dans ce tube.
  6. Fixer le tube 3/16 "de silicone ID (tube 1 dans la figure 7) et débranchez le luer mâle de celui - ci. Débranchez la fiche de la luer femelle du tube d'entrée des médias du récipient de culture. Reliez ces mâles et femelles Luer pour permettre aux médias d'être pompé dans le récipient de culture.
  7. Retirez le filtre à vide et plafonner le ml bouteille de médias qui a été attaché au filtre à vide 100.
  8. Un jour avant le récipient de culture sera inoculé, inoculer une seule colonie du microbe optogenetic dans un tube à essai avec 4 ml de médias recueillies à l'étape précédente, et le laisser grandir pendant une nuit à température optimale de croissance de la température de la culture à 30 ° C ou avec agitation.

11. Assembler l'appareil autour du Microscope

  1. Fixer l'assemblage de culture en continu à proximité du microscope avec le support flacon supérieur à celui du récipient de culture et effluent flacon inférieur à celui du récipient de culture, de telle sorte que le tube constitué de segments de 0,022 "tube en PTFE ID (tube 5 sur la figure 6) peut atteindre la platine du microscope. fermement bande vers le bas le bouchon en caoutchouc du flacon de support et du récipient l' effluent.
  2. Déconnecter les extrémités du "tube en PTFE d'identification de l'1/50" 0,022 tube de silicone d'identification qui les relient (tube 5 sur la figure 6), et de brancher ces extrémités dans l'entrée et la sortie du dispositif microfluidique.
  3. Connectez l'extrémité blanche du filtre à air de la seringue à la pompe d'aquarium. La pression d'air va pousser les médias dans le récipient de culture.
  4. Lorsque les médias atteint le niveau de l'orifice d' effluent, envelopper le "tube de support d'ID d'entrée et connecteurs autour de la pompe péristaltique lente (tube 4 sur la figure 6) et le 1/50" 1/16 ID échantillon tubulure de sortie et des connecteurs autour du rapide pompe péristaltique (tube 5 sur la figure 6).
  5. Aérer les médias par débridage l'air tuêtre entre le ballon des médias et la culture de navire.
  6. Tape le coussin chauffant et d'un thermomètre dans le récipient de culture de telle sorte que sa température peut être contrôlée. Enrouler le tube de support autour du récipient de culture de sorte que les supports entrant seront à la même température que celle du récipient.
    NOTE: Le courant PWM pour le coussin chauffant est régulé par le microcontrôleur qui utilise des entrées du thermomètre pour maintenir le récipient de culture à sa température de consigne.
  7. Insérez le récipient de culture dans l'enceinte de mousse noire sur la matrice LED, et veiller à ce que les tubes ne sont pas coincés.
  8. Dans Micro-Manager, accédez à Plugins> bioréacteur Controller. Réglez le "ratio de médias de la pompe sur" champ à 0,1 et le «ratio de la pompe de l'échantillon sur" champ à 0. Le débit sera très faible, mais supérieure à la vitesse d'évaporation.
  9. Fixer le tube d'air entrant entre le ballon des médias et la culture de navire. Retirez le bouchon du tube d'inoculation (tube 7 dans la figure
  10. Couvrir l'enceinte de sorte qu'aucune lumière pénètre, et que la culture se développer pendant la nuit.

12. Calibrer les taux de pompage

  1. Dans Micro-Manager, accédez à Plugins> bioréacteur Controller. Réglez le "rapport de la pompe des médias sur« champ à 0,5 et le «ratio de la pompe de l'échantillon sur" champ à 0.
  2. Déconnecter le tuyau de trop - plein d' effluent du ballon (tube 8 sur la figure 6) et le tube de prélèvement du flacon effluent (tube 8 sur la figure 6) et recueillir l' effluent dans des récipients séparés. Recueillir les effluents pendant 1 heure, en commençant après les pompes ont été pendant 15 min.
  3. Calculer le taux d'écoulement de milieu dans le récipient de culture à partir du volume collecté dans le récipient en tant que:
    figure-protocol-7
  4. Réglez la valeur du "rapport de la pompe des médias sur" terrain par cette estimation linéaire:
    figure-protocol-8
    où
    figure-protocol-9
  5. Effectuer une itération dans cette procédure d'étalonnage jusqu'à ce que la différence entre le débit souhaité et le débit mesuré est <0,2 ml / h, où le débit est moyennée sur une période de 1 h.
  6. Augmenter la valeur du "rapport d'échantillonnage sur" le terrain et calibrer de manière similaire jusqu'à approximativement 4/5 ème du volume sortant du récipient de culture est pompée par la pompe d'échantillonnage et environ 1/5 du volume quitte par l'orifice de trop-plein.
  7. Laisser la densité de la culture dans le dispositif de culture continue équilibrer dans ces conditions pendant une nuit.
    NOTE: Si les débits cible ne peut pas être atteint, le changementle tuyau de la pompe péristaltique. Le liquide est pompé à un débit plus élevé lorsque les tubes de plus grand diamètre est utilisé. Suivez l'étape 14, puis revenir à l'étape 8.4.

13. Collectionnez Microscope Images de Microbes Cultured

  1. Remplir la scène Position Liste de Micro-Manager avec un ensemble de positions qui ne se chevauchent à laquelle les images de cellules injectées dans le canal microfluidique seront dans le plan focal.
  2. Ouvrez le plug-in "bioréacteur Controller". Sélectionnez le cours désiré de temps de matrice de LED, les canaux d'imagerie, et d'autres paramètres expérimentaux à partir des invites. Recueillir et analyser les images.
  3. Bien que l'expérience fonctionne, veiller à ce que les médias dans le ballon des médias reste claire. Si elle est trouble, il a été contaminé.

14. Post-expérience

  1. Jeter les médias, la culture de cellules en excès et des effluents.
  2. Remplir le flacon de support avec 200 ml de 20% d'EtOH mélangé avec de l'eau déminéralisée. Exécutez le chemostat comme il l'avait précédemmentété exécuté pendant l'expérience pour laver les débris cellulaires et les médias.
  3. Lorsque la solution d'alcool a drainé du ballon de médias, démonter le chemostat pleinement.
  4. Laver la verrerie et les tubes avec de l'eau chaude et un détergent doux et rincer abondamment avec de l'eau déminéralisée. Laisser sécher.
  5. Ouvrez le fichier "microcontrollerRecords.csv" pour examiner la température et l'état de la matrice LED au cours de l'expérience, le fichier "Summary.csv" pour examiner les données sommaires de chaque ensemble d'images et les "Résultats .csv" fichiers pour examiner les données résumant chaque ROI de chaque période de temps, où n est le n - ième jeu de données.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet appareil a été utilisé pour stimuler une culture de S. cerevisiae exprimant la protéine fluorescente jaune (YFP) en réponse à la lumière bleue par l' intermédiaire d' un système de transcription optogenetic inductible basé sur la protéine paire 30 CRY2 / de CIB1. Les cellules ont été cultivées en chemostat dans des milieux de phosphate limité à un taux de dilution de 0,2 ± moyenne de 0,008. Limitation de phosphate est couramment utilisé dans S.

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons conçu cet appareil avec une flexibilité à l'esprit. Tout le code utilisé est gratuit et open-source. Le processus d'analyse d'image par défaut pour les cellules de segment est simple et fonctionne rapidement. Analyse personnalisée pourrait être mis en œuvre par l'enregistrement d'entrée de l'utilisateur lors de l'analyse d'une image représentative de l'interface utilisateur graphique FIDJI, convertir l'entrée d'un script beanshell, puis définir le plugin pour appele...

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Disclosures

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Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier Molly Lazar et Verónica Delgado aide pour tester le protocole, Kieran Sweeney pour des discussions utiles et l'édition, et Taylor Scott, My An-adirekkun, et Stephanie Geller pour la lecture critique du manuscrit. Megan Nicole McClean, Ph.D. est titulaire d'une bourse de carrière à l'interface scientifique du Burroughs Wellcome Fund.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Manuel de labo completGitHubNAUn manuel de labo complet, régulièrement mis à jour, est disponible dans le " Limes de chimiostat optogénétique" Référentiel GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). Cela comprend également une description du moule microfluidique utilisé pour générer les résultats représentatifs.
Fritzing Design ViewerFritzingNALe logiciel gratuit et open source permettant de visualiser et d’éditer les conceptions de circuits imprimés de type .fzz est disponible chez « http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assemblé)Adafruit50. 1 requis.
Arduino Stackable Header KitSparkFun Electronics10007Embases à broches femelles pour la connexion du PCB au microcontrôleur. 1 requis.
Fer à souder réglable 30W 110V - XY-258 110VAdafruit180Pour effectuer des connexions électriques au circuit imprimé. 1 requis.
Support de fer à souderAdafruit150Pour effectuer des raccordements électriques au circuit imprimé. 1 nécessaire.
Mini bobine de soudure - 60/40 soudure à noyau de colophane au plomb 0,031" de diamètre - 100gAdafruit145Pour effectuer les connexions électriques au circuit imprimé. 1 requis.
0,1 &mu ; Condensateur FSparkFun ElectronicsCOM-08375Stabilise la tension dans le circuit imprimé. 1 requis.
10 &mu ; F condensateurSparkFun ElectronicsCOM-00523Stabilise la tension dans le circuit imprimé. 1 requis.
MAX7219CNG Pilote d’affichage LED matriciel/numérique - MAX7219MaximMAX7219CNGPilote LED. 1 requis.
IC 8 broches SocketMouser Electronics575-14430816 requis. Ceux-ci seront empilés les uns sur les autres pour soutenir le récipient de culture au-dessus de la matrice LED.
Prise IC 24 brochesMouser Electronics535-24-3518-10en option. Utilisez-le pour fixer de manière réversible le pilote MAXIM 7219CNG au circuit imprimé.
Multimètre numériqueAdafruit2034Pour le dépannage électronique. 1 requis.
Embases Break Away - 40 broches mâles (longues, PTH, 0,1")SparkFun ElectronicsPRT-12693Embases à broches mâles pour matrice LED connectée à la carte de circuit imprimé. Les extrémités peuvent être coupées avec des pinces coupantes. 1 jeu requis.  ;
Coupe-fil diagonal affleurantAdafruit152Pour couper les en-têtes à broches longues et couper les câbles d’alimentation. 1 nécessaire.
Fils de liaison femelle/femelle de qualité supérieure - 40 x 12" (300mm)Adafruit793Ruban de fil pour connecter la plaque d’essai à la matrice LED. Peut être connecté de bout en bout avec des embases mâles pour être plus long. 1 obligatoire.
Planche d’essai demi-tailleAdafruit64La matrice LED se connectera à celle-ci et le récipient de culture reposera au-dessus.
Miniature 8x8 Bleu LED MatriceAdafruit956Source de lumière. La longueur d’onde dominante est de 470 nm (bleu). 1 obligatoire. D’autres matrices de LED miniatures du même fournisseur sont disponibles avec des longueurs d’onde dominantes : 624 nm (rouge), 588 nm (jaune), 525 nm (vert), 572 nm (jaune-vert) et blanc.
Embase empilable-3 brochesSparkFun Electronics138758 requise.
Kit de résistance - 1/4W (500 au total)SparkFun Electronics10969Pour l’électronique. 1 requis.
  ; IRL520N MOSFETInternational RectifierIRL520NInterrupteur de régulation de tension pour le contrôle du courant continu. 4 requis.
Fil de raccordement - Assortiment (Solid Core, 22 AWG)SparkFun ElectronicsPRT 11367Fil pour l’électronique. 1 requis.
Alimentation à découpage 5V 2A (2000mA) - Homologué ULAdafruit276Alimentation pour le coussin chauffant et Arduino. 2 requis.
Adaptateur d’alimentation à découpage régulé 12 VDC 1000mA - homologué ULAdafruit798Pour pompes péristaltiques. 2 requis.
Coussin chauffant électrique - 10cm x 5cmAdafruit1481Pour chauffer le bioréacteur. 1 nécessaire.
Pompe péristaltique à faible débit et à débit variableFisher Scientific13-876-1Pour le pompage de fluides. 1 requis
Pompe péristaltique à débit variable à débit moyenFisher Scientific13-876-2Pour le pompage de la culture. 1 nécessaire.
Adaptateur d’alimentation à découpage régulé 9 VDC 1000mA - Homologué ULAdafruit63Pour l’alimentation du microcontrôleur. Ordonnance 1.
High Temp Étanche DS18B20 Capteur de température numérique + extrasAdafruit642Thermomètre pour le bioréacteur. 1 requis.
MicromanagerMicromanager NALe logiciel de contrôle de microscope gratuit et open source est disponible à l’adresse « https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJIImageJNALe logiciel d’analyse d’images gratuit et open source est disponible à l’adresse « http://fiji.sc/"
Environnement de développement intégré ArduinoArduinoNAL’IDE gratuit et open-source est disponible à l’adresse « https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
Code personnaliséGitHubNALe code de microcontrôleur personnalisé et le plugin « Bioreactor Controller » sont disponibles dans le » Limes de chimiostat optogénétique" Référentiel GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Câble USB A à B - 6 pieds SparkFunElectronicsCAB-00512Utilisé pour télécharger des données sur le microcontrôleur. 1 requis.
bioreactorTimecourse_example.csvGitHubNAL’avantage de charger les valeurs de matrice de LED à partir d’un fichier CSV est qu’un programme peut être appelé par le plug-in pour mettre à jour ces valeurs en fonction des résultats de l’analyse d’image, et ces valeurs peuvent être rechargées sur le microcontrôleur, ce qui permet le contrôle par rétroaction. Il est disponible auprès du " Limes de chimiostat optogénétique" Référentiel GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Gels Tota-frost (papier de diffusion)B& HB& H # LOFSFTL
MFR # T1-72		Pour matrice LED. 1 Requis.
Feuille de kit Crosslink 1/4x12x24inGrainger, inc20JL37Mousse noire pour l’enceinte de la cuve de culture. 4 requis.
Capteur de puissance à photodiode standard, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW  ;ThorlabsS120VCPour mesurer l’intensité lumineuse. 1 nécessaire.
Ruban d’étiquetageFisher Scientific159015NPour l’étiquetage et la sécurisation des composants en vrac. 1 nécessaire.
Console compacte de mesure de puissance et d’énergie, numérique LCD 4"ThorlabsPM100DPour la mesure de l’intensité lumineuse. 1 requis.
Bouteille en verre d’hybridation GL45 de 100 mlBellco Glass, Inc.(7910-40150)Cuve du bioréacteur. 1 requise.
Assemblage à six portsBellco Glass, Inc.Personnalisé  ;Pour la cuve du bioréacteur. Spécifications du tube : .125 « OD x .055 » ID. Port A : 1,0 « de long au-dessus de la limace du capuchon et au bas du tube. Orifices B, C, E, F : 1,0 po de long au-dessus de la limace du capuchon, 33 mm de long en dessous. Orifice D : 1,0" de long au-dessus de la limace du capuchon, 65 mm ; long en dessous. 1 obligatoire. Comprend un bouchon à vis en polypropylène de 45 mm de diamètre et un joint en silicone blanc pour assurer une étanchéité parfaite entre le bouchon et le récipient.
Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 pouces, paquet de 3B0009F3P3Uruban écossais transparent. Ceci est disponible auprès de nombreux autres fournisseurs. Il est utilisé pour couvrir les marquages sur la cuve d’élevage et pour fixer le verre de protection avec le canal PDMS au cadre de support en aluminium.
1/16 « ID x 3/16 » OD x 1/16 » Wall Tygon Sanitary Silicone TubingÉtats-Unis Plastic Corp.57288Tube. ~25' requis.
Cole-Parmer Twistit bouchon en caoutchouc blanc, taille 10Cole-ParmerEW-62992-32Bouchon de flacon de média et bouchon de flacon d’effluent. 2 requis.
Fiole de laboratoire 2LPyrex4980Fiole de milieu et fiole d’effluent. 2 nécessaires.
Robinet de jourFisher Scientific5867Pour pincer les tubes, fermer. 3 requis.
Ensemble de tubulure de remplacement 1/16" IDTraceable Products3372Les pompes péristaltiques sont livrées avec un ensemble de tubes, mais ils s’usent après des semaines d’utilisation.
Ensemble de tubulure de remplacement 1/50" IDTraceable Products3371Les pompes péristaltiques sont livrées avec un ensemble de tubes, mais ils s’usent après des semaines d’utilisation.
Luer mâle avec anneau de verrouillage x 1/16" cannelé de tuyau, Nylon, 25/pqtCole-ParmerEW-45505-00Connecteurs. ~10 luers sont nécessaires.
Luer mâle avec anneau de verrouillage x cannelé de tuyau 1/8", Nylon, 25/pqtCole-ParmerEW-45505-04Connecteurs. 5 requis, un pour chaque trou de bouchon en caoutchouc à remplir avec le tube.
Luer femelle x 1/16" adaptateur de tuyau cannelé, Nylon, 25/pqtCole-ParmerEW-45502-00Connecteurs. ~10 luers requis.
Luer femelle x 3/16" adaptateur de tuyau canneléCole-ParmerEW-45502-08Connecteurs. ~10 luers requis.
Cole-Parmer Luer Accessoire, Capuchon Luer femelle, Nylon, 25/pqtCole-ParmerSC-45502-28
Cole-Parmer Luer Accessoire, Mâle Luer Lock, Nylon, 25/pqtCole-ParmerEW-45505-56
Tube en PTFE microbore, 0,022 po ID x 0,042 po OD, 100 pi/rouleauCole-ParmerEW-06417-21Tube. 1 rouleau requis.
Tube en silicone durci au platine Masterflex, L/S 13, 25 ftCole-ParmerEW-96410-13Tube. ~25' requis.
3/16 « ID x 1/4 » OD x 1/32 » Wall Tygon Sanitary Silicone TubingÉtats-Unis Plastic Corp.57293Tube. ~1' requis.
Filtre à videFisher Scientific974107 Filtre àvide Nalgene pour média filtrant stérile.
Aquel Oxy-Boost 200Rena Aquatic SupplyAP200Pompe à air à débit réglable à double diaphram pour l’aération et le mélange de fluides. 1 requis.  ;
0,2 &mu ; Filtre à seringue CorningInternational431229Cela garantit que l’air de la pompe d’aquarium ne contamine pas l’appareil. 1 Nécessaire.
Slygard 184 Kit d’élastomère de siliconeDow CorningSlygard 184Pour dispositif microfluidique. 1 requis.
Rasoir de sécurité américain GEM Scientific Lames de rasoir à un seul tranchantFisher Scientific17989000Pour couper des tubes et des PDMS. 1 lame requise.
Perforateur Harris Uni-Core 1.2mm IDSigma-AldrichWHAWB100028 ALDRICHPour l’entrée/sortie de poinçonnage dans un dispositif microfluidique. 1 requis.
Verre de protection de microscope 22x60-1.5Fisher Scientific12-544-GPour dispositif microfluidique. 1 nécessaire.
Cadre rectangulaire en aluminium avec une fenêtre carréePersonnaliséSur mesurePour soutenir le canal microfluidique. Dimensions extérieures : 3 pouces x 1,25 pouces.
Dimensions intérieures (partie découpée) : 7/8 pouces x 7/8 pouces
Épaisseur : ~1/32 pouces
Microcontrôleur

References

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