Manipulation des épileptiforme Electrocorticograms (ECoGs) et du sommeil chez les rats et les souris par Acupuncture

Résumé

Cet article démontre les performances de l’acupuncture, des modèles d’épilepsie et de l’analyse du sommeil chez les rongeurs. La procédure d’acupuncture et l’identification des points d’acupuncture sont décrites. La pilocarpine ou pentylènetétrazol (PTZ) est utilisée pour induire l’épilepsie. L’électrocorticogramme (ECoG), l’électromyogramme (EMG), la température cérébrale et les enregistrements de l’activité locomotrice sont utilisés pour l’analyse du sommeil.

Résumé

La littérature chinoise ancienne a documenté que l’acupuncture possède des effets thérapeutiques efficaces sur l’épilepsie et l’insomnie. Cependant, il existe peu de recherches pour révéler les mécanismes possibles à l’origine de ces effets. Pour étudier l’effet de l’acupuncture sur l’épilepsie et le sommeil, plusieurs questions doivent être abordées. La première consiste à identifier les points d’acupuncture, qui correspondent entre les humains, les rats et les souris. De plus, la profondeur d’insertion de l’aiguille d’acupuncture, le degré de torsion de l’aiguille dans l’acupuncture manuelle à l’aiguille et les paramètres de stimulation pour l’électroacupuncture (EA) doivent être déterminés. Pour évaluer les effets de l’acupuncture sur l’épilepsie et le sommeil, il est nécessaire de disposer d’un modèle réalisable de l’épilepsie chez les rongeurs. Nous administrons de la pilocarpine dans le noyau central gauche de l’amygdale (CeA) pour simuler l’épilepsie du lobe temporal focal (TLE) chez le rat. L’injection intrapéritonéale (IP) de pilocarpine induit une épilepsie généralisée et un état de mal épileptique (ES) chez le rat. Cinq injections IP de pentylènetétrazol (PTZ) avec un intervalle d’un jour entre chaque injection induisent avec succès une épilepsie généralisée spontanée chez la souris. Les enregistrements d’électrocorticogrammes (ECoG), d’électromyogrammes (EMG), de température cérébrale et d’activité locomotrice sont utilisés pour l’analyse du sommeil chez les rats, tandis que les ECoG, les EMG et l’activité locomotrice sont utilisés pour l’analyse du sommeil chez la souris. Des électrodes ECoG sont implantées dans les cortex occipitaux frontal, pariétal et controlatéral, et une thermistance est implantée au-dessus du cortex cérébral par chirurgie stéréotaxique. Des électrodes EMG sont implantées dans les muscles du cou et un détecteur infrarouge détermine l’activité locomotrice. Les critères de catégorisation des stades de vigilance, y compris l’éveil, le sommeil paradoxal (REM) et le sommeil non paradoxal (NREM), sont basés sur les informations provenant des ECoG, des EMG, de la température du cerveau et de l’activité locomotrice. Des critères de classification détaillés sont énoncés dans le texte.

Introduction

L'épilepsie est un trouble neurologique commun dans lequel des crises récurrentes se produisent tout au long de la durée de vie d'un patient. La plupart des récurrences d'épilepsie peuvent être bien contrôlés par les médicaments anti-épileptiques (DEA). Toutefois, environ 30% des patients atteints d' épilepsie réfractaire , l' épilepsie développent ^1. causes de l'épilepsie, troubles du sommeil qui peut encore aggraver la récidive. La preuve démontre que l' épilepsie peut soit perturber le sommeil la nuit ou peut provoquer une somnolence diurne excessive ^2,3. Nos études antérieures indiquent en outre que l' épilepsie se produisant à zeitgeber temps (ZT) 0, soit le début de la période de lumière à la lumière: cycle d' obscurité, diminue le sommeil; ceci est médiée par l'hormone de libération de la corticotropine (CRH), un facteur homéostatique. L'épilepsie chez ZT13 (le début de la période d'obscurité) augmente l'expression d'un autre facteur homéostatique, l'interleukine-1 (IL-1), ce qui augmente le sommeil. Sommeil rythmes circadiens sont modifiés lorsque l'épilepsie survient à ZT6, au milieu de lapériode de lumière ^4,5. D'autre part, les problèmes de sommeil aggravent encore la progression et la récurrence de l' épilepsie ^6. Sur la base des éléments de preuve ci-dessus, nous essayons de révéler une méthode thérapeutique optimale pour contrôler simultanément l'épilepsie et prévenir les perturbations du sommeil chez les patients épileptiques. Nous avons déjà constaté que électroacupuncture (EA) avec une fréquence de stimulation de 10 Hz, dans lequel une certaine quantité de courant est délivré dans le acupoint à travers une aiguille en acier inoxydable, électrocorticogramme supprime avec succès (EcoG) activités d' épilepsie et des troubles du sommeil induit par l' ^épilepsie-7 . EA avec une fréquence de stimulation de 100 Hz se détériore davantage les activités d' épilepsie et les troubles du sommeil chez le rat ^8,9. Cette expérience réussie dépend de trois facteurs: d'une part, un modèle animal d'épilepsie possible; en second lieu, un procédé d'enregistrement et d'analyse du sommeil chez les rongeurs; et troisièmement, la performance exacte de l'acupuncture et la précision de la locati acupointons.

L'épilepsie a été classé en deux grands types: épilepsie focale et l'épilepsie généralisée. Nous sommes intéressés à focale épilepsie temporale de lobe (TLE), épilepsie généralisée, état de mal épileptique (SE), et la récurrence de l'épilepsie généralisée spontanée. Par conséquent, les différentes manipulations sont appliquées pour créer des modèles d'épilepsie appropriés pour nos expériences. Pour établir TLE focale, une faible dose de pilocarpine est administré dans le noyau central de l'amygdale gauche (ACÉ). Pour vérifier ce modèle, six électrodes ECoG sont implantées sur le frontal (F1 et F2), pariétal (P1 et P2), et occipital (O1 et O2) lobes dans les deux hémisphères gauche et droit, et deux électrodes de référence (R1 & R2) sont placés sur le cervelet, dans les deux hémisphères. Un montant supplémentaire de guide de microinjection canule est implanté chirurgicalement dans le aCÉ gauche (AP, 2,8 mm de bregma; ML, 4.2 mm, DV, 7,8 mm par rapport à bregma). Les coordonnées sont adaptées de la Paxinos et Watson atlas de rat ^10. Si le TLE focal est induite avec succès, seul l'enregistrement à partir de l'électrode à gauche cortex pariétal (P1), qui est près de la aCÉ gauche, devrait acquérir les ECoGs épileptiformes dominantes, sans ECoGs épileptiformes significatives enregistrées à partir des autres électrodes ECoG. Intrapéritonéale (IP) des injections de pilocarpine dans les rats induisent l'épilepsie et SE généralisés, mais cela peut être fatal. Cinq injections IP de pentylenetetrazol (PTZ) avec un intervalle d'une journée entre chaque injection induisent avec succès l'épilepsie généralisée spontanée chez la souris et assurent également la survie des souris. Deux électrodes de fil ECoG sont implantés dans les frontales et pariétales corticales chez les souris pour recevoir des signaux ECoG et de vérifier l'épilepsie spontanément récurrente.

Polysomnographie (PSG) est une méthode complète pour enregistrer les changements physiologiques qui se produisent pendant le sommeil, et il peut objectivement classer le sommeil en différentes étapes du mouvement non-rapide oeil (NREM) et rmouvements oculaires apid (REM) du sommeil. PSG enregistre les paramètres de fonctionnement de l'organisme, y compris les ondes cérébrales (électroencéphalogramme, EEG), les mouvements oculaires (de électrooculogramme, EOG), des tons de muscle squelettique (de électromyogramme, EMG), les rythmes cardiaques (électrocardiogramme, ECG), et les niveaux d'oxygène dans le sang et les paramètres respiratoires. Chez les rats, nous enregistrons ECoGs, EMGs, température corticale, et l'activité locomotrice de classer les états de vigilance en éveil, le sommeil lent et le sommeil paradoxal. analyse du sommeil chez la souris est effectuée en utilisant ECoGs, EMGs, et les résultats de l'activité locomotrice. Les rats sont implantés chirurgicalement avec trois EcoG vis électrodes au frontal, pariétal et corticales cérébelleux controlatéral par la chirurgie stéréotaxique. détermination post-acquisition des états de vigilance (de l'éveil, le sommeil lent et le sommeil paradoxal) est conduite selon les paramètres acquis des ECoGs, EMG, la température du cerveau, et l'activité locomotrice. Les critères détaillés pour catégoriser le comportement de l'animal chez les rats et les souris sont décrites dans til protocole.

Les rats et les souris ont besoin d'être anesthésiés avec une faible dose de Zoletil (25 mg / kg), soit la moitié de la dose d'anesthésique normalement administrés pendant la chirurgie stéréotaxique, avant d'effectuer l'acupuncture manuelle ou EA. Ce dosage permet aux animaux de se réveiller 30 à 35 minutes après l'injection. Soit l'acupuncture manuelle ou EA est effectuée au début de la période d'obscurité, avec un intervalle de temps constant de 30 minutes, et chaque animal est consécutivement traités pendant deux à trois jours. Stimuler les courants EA sont livrés dans un acupoint particulier à travers une aiguille en acier inoxydable qui est inséré dans l'acupoint. Le courant de stimulus est un train d'impulsions carrées biphasique, dans lequel la durée d'impulsion est de 150 ms et l'intensité de stimulation est de 1 mA. Si une aiguille sèche est utilisée pour l'acupuncture manuelle, l'aiguille insérée dans les acupoints est crispa 10 fois toutes les 5 min. La partie difficile de l'acupuncture manuelle ou EA est de localiser les points d'acuponcture chez les rongeurs. Le location des acupoints chez des rats ou des souris est similaire à leur localisation anatomique chez les humains. Par exemple, les acupoints bilatéraux Fengchi sont situés 3 mm de la ligne médiane postérieure sur le cou, entre les deux oreilles, ce qui est similaire à son emplacement anatomique chez les humains ^11. En outre, les points d'acupuncture avec une faible impédance sur la peau peuvent être confirmées. la manipulation de l'acupuncture ou fictive EA Sham est nécessaire pour l'acupuncture ou des expériences EA. Acupuncture Sham ou fictive EA doivent être effectuées à un non-acupoint situé à proximité du acupoint, comme près de l'aisselle ^12.

Pour étudier avec succès les effets de l'acupuncture ou EA sur l'épilepsie et les troubles du sommeil induit par l'épilepsie, les facteurs suivants doivent être en place: un modèle possible épileptique animal, l'analyse précise de ECoGs épileptiformes et la récurrence de l'épilepsie, une méthode pour classer les états de vigilance et la performance précise de l'acupuncture ou EA chez les rongeurs.

Protocole

Tous les protocoles expérimentaux sont approuvés par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) de l'Université nationale de Taiwan.

1. stéréotaxique chirurgie pour Implanter EcoG Electrodes, EMG Electrodes, Brain thermistance et Guide Injection Cannula

1. Pour les rats (250-350 g, de 6 à 8 semaines d'âge des rats Sprague-Dawley)
   1. Anesthetize les rats par injection IP avec 50 mg / kg Zoletil. Confirmer la bonne profondeur de l'anesthésie en observant l'absence de réponse après pincement de la patte arrière. Appliquer une pommade oculaire, de se raser la fourrure, et stériliser la peau avec une solution de povidone-iode et 75% d'éthanol. Injecter un antibiotique (pénicilline G) pour prévenir l'infection.
   2. Préparer scalpels, ciseaux, pinces hémostatiques, gazes, et la machine de cautérisation pour la chirurgie. Stériliser vitesse et gazes chirurgicale par un autoclave et le cautère de 75% d'éthanol.
   3. Placer une barre d'oreille dans le conduit auditif et monter le rat à la stéréotaxie.
   4. En utilisantun scalpel, faire une approximative de 2 cm incision médiane sur le crâne le long d'une ligne entre deux oreilles, se déplaçant caudale. Coupez les lambeaux de peau avec des pinces hémostatiques pour exposer le crâne et enlever le tissu sur le crâne à l'aide d'un scalpel.
   5. Forage huit trous (F1, F2, P1, P2, O1, O2, R1 et R2), chacun d'environ 0,7 mm de diamètre, sur le crâne avec un outil rotatif. Vissez huit électrodes ECoG sur les frontaux, pariétaux et lobes occipitaux et le cervelet dans les deux hémisphères gauche et droit. Ces électrodes sont utilisées pour la détection épilepsie focale.
      1. Utilisez les coordonnées suivantes pour les électrodes d'enregistrement: frontal (F1 et F2): +2,0 mm antérieur à bregma et +2,5 mm de la ligne médiane, pariétal (P1 et P2): -2.0 mm antérieures à bregma et +3,0 mm de la ligne médiane et occipital (O1 et O2): -5.5 mm antérieur à bregma et +3,0 mm de la ligne médiane.
      2. Placer deux électrodes de référence (R1 et R2) sur le cervelet (-11,0 mm en avant de bregma et à 4,0 mm de la midline).
   6. Dans des groupes séparés de rats, percer trois trous et placer deux électrodes EEG vis sur le frontal droit (F2) et lobes pariétaux (P2) des corticales avec les mêmes coordonnées que décrit à l'étape 1.1.5.1. Placer une troisième électrode EEG sur le cervelet gauche (R1), qui sert à la masse de l'animal et de réduire les artefacts de signal. Ces électrodes sont utilisées pour confirmer l'épilepsie généralisée et d'analyser les étapes de vigilance.
   7. Séparer la peau du cou et des muscles et insérez deux électrodes EMG dans le muscle du cou.
   8. Percez un autre trou sur le crâne et placer une canule de guidage de microinjection dans le aCÉ gauche (AP, 2,8 mm de bregma; ML, 4,2 mm; DV, 7,8 mm par rapport à bregma) chez le rat. Les coordonnées sont adaptés à partir de l'atlas de Paxinos et Watson rat ^10.
   9. Forer un trou plus grand (d'un diamètre de 1,6 mm) sur le crâne et insérer une thermistance étalonnée 30 kV sur la surface du cortex pariétal, qui sera cimentée plus tard, Monitor la température corticale chez le rat.
   10. Utilisez gaze et cautérisation pour arrêter le saignement quand il se produit.
   11. Acheminer les fils isolés des électrodes ECoG et des électrodes EMG à un piédestal et connecter la thermistance à la longe. Ciment du piédestal et de guider la canule sur le crâne avec de l'acrylique dentaire.
   12. Traiter l'incision par voie topique avec Polysporin (bacitracine de sulfate de zinc / polymyxine B) pour prévenir l'infection. Donnez aux animaux à la fois l'ibuprofène et de la pénicilline G dans l'eau pendant une semaine après la chirurgie.
2. Pour les souris (20 - 30 g, de 6 à 8 semaines d'âge des souris C57BL / C)
   1. Anesthésier la souris par injection IP avec 50 mg / kg Zoletil et confirmer la bonne profondeur de l'anesthésie en observant l'absence de réponse après pincement de la patte arrière. Appliquer une pommade oculaire. Après le rasage, stériliser la peau avec une solution de povidone-iode et 75% d'éthanol. Injecter un antibiotique (pénicilline G) pour prévenir l'infection.
   2. Placer une barre d'oreille dans le conduit auditif etmonter la souris vers la stéréotaxie.
   3. L'utilisation d'un scalpel, faire une approximative de 1,5 cm incision médiane sur le crâne le long d'une ligne entre les deux oreilles, se déplaçant caudale. Coupez les lambeaux de peau avec des pinces hémostatiques pour exposer le crâne et enlever le tissu sur le crâne avec un scalpel.
   4. Poke deux trous sur le crâne avec des ciseaux chirurgicaux et placer deux électrodes de fil ECoG sur le lobe frontal droit (F2: +2,0 mm à bregma et +1,5 à la ligne médiane) et gauche lobe pariétal (P1: -3.0 mm à bregma et -2,5 mm à la ligne médiane).
   5. Séparer la peau du cou et des muscles et insérez deux électrodes EMG dans le muscle du cou.
   6. Connecter les câbles isolés à partir des électrodes de électrocochléographie des fils et des électrodes électromyographiques aux bornes femelles et à un connecteur de 2,54 mm, puis du ciment pour le crâne avec de l'acrylique dentaire.
   7. Traiter l'incision par voie topique avec Polysporin (bacitracine de sulfate de zinc / polymyxine B) pour prévenir l'infection. Donnez aux animaux deux ibuprofène et de la pénicilline G dans de l'eau pour un week après la chirurgie.
3. Permettre à tous les animaux de récupérer pendant sept jours avant le début des expériences.
4. Maison rats ou les souris séparément dans des cages individuelles d'enregistrement, dans la pièce isolée, où la température est maintenue à 23 ± 1 ° C et à la lumière: obscurité (L: D), le rythme est commandé 12: 12 h cycles (40 W x 4 tubes d'éclairage). Fournir de la nourriture et de l' eau ad libitum.
5. Branchez le EcoG, EMG et thermistance à travers une attache aux amplificateurs une semaine après la chirurgie pour commencer les enregistrements.

2. Mise en place de Focal TLE Epilepsy, SE et Spontanément récurrente épilepsie

1. Pour les rats
   1. Administrer 0,5 pi de pilocarpine (2,4 mg / ul) dans la LEC gauche à travers la canule de guidage d'injection à l'aide d'une pompe à micro-injection. Le taux d'injection doit être fixé à 0,2 ul / min pour induire focale TLE.
   2. IP injecter 300 mg / kg de pilocarpine pour induire epi généraliséeLepsy avec récurrente SE.
2. Pour les souris
   1. IP administrer PTZ (0,035 mg / g de poids corporel de la souris) à un point ZT particulier tous les autres jours. Cinq injections consécutives provoqueront l'apparition de l'épilepsie généralisée spontanément et de façon récurrente.
3. Pour les rats et les souris
   1. Amplifier les signaux ECoG par 5000 et le filtre passe-bande analogique entre 0,1 et 40 Hz.
   2. Utilisez une carte / D conversion A pour convertir les signaux de ECoGs analogiques en signaux numériques avec un taux d'échantillonnage de 128 Hz.
   3. Utiliser un logiciel de notation visuelle et d'analyser l'apparition et la durée de l'épilepsie. Mesurer l'échelle de temps afin de représenter la durée.
   4. Définir EcoG épilepsie par l'apparition de pics épileptiques avec des amplitudes supérieures à 2 mV et avec des durées de plus de 30 s ^13.

3. Classification des Vigilance États

1. Pour les rats
   1. Déterminer les états de vigilance en utilisant les paramètres acquis de ECoGs, EMG, les températures du cerveau, et la locomotion dans un 12 s épisode de l'enregistrement. Branchez le EcoG, EMG et thermistance à travers une attache aux amplificateurs une semaine après la chirurgie pour commencer l'enregistrement. Note les états avec un logiciel sur mesure selon les étapes 3.1.5 - 3.1.7.
   2. Mesurer les activités locomotrices à l'aide d'un détecteur de mouvement infrarouge, intégrer les signaux tous les 1 s, et stocker les signaux.
   3. Mesurer la température corticale et stocker les signaux.
   4. Classez états de vigilance selon nos critères préalablement définis ^14.
   5. Note eveil en utilisant les caractéristiques suivantes: ECoGs de faible amplitude avec des spectres à haute fréquence, une puissance de delta (0,5 à 4,0 Hz), et la puissance de thêta inférieur (6,0 à 9,0 Hz); activité dominante locomoteur; forte activité EMG; et en augmentant progressivement la température corticale.
   6. Score sommeil lent en utilisant le following caractéristiques: delta-ondes ECoGs dominantes avec de grandes amplitudes, a diminué l'activité EMG, la température corticale réduite, et aucune activité locomotrice.
   7. Score sommeil paradoxal en utilisant les caractéristiques suivantes: une diminution de l'amplitude ECoGs avec la fréquence dominante thêta, soudain augmentation de la température corticale, l'activité EMG minimale et une faible activité locomotrice avec tressaillements du corps.
2. Pour les souris
   1. Répétez la classification des états de vigilance chez les souris que chez les rats menée, sauf qu'il n'y a pas de température corticale enregistrée à partir de la thermistance.

4. Performance de l'acupuncture manuelle et EA chez le rat

1. Le rat est anesthésié pour le protocole EA.
2. Localisez le acupoint par l'anatomie et de confirmer une faible impédance de la peau à l'acupoint. La lumière clignote quand détecter la faible impédance de la peau. Remarque: acupoints Fengchi sont situés à 3 mm de la ligne médiane postérieure soitentre les deux oreilles, sur le cou.
3. Insérez des aiguilles en acier inoxydable dans les acupoints à une profondeur de 2 mm.
4. Twitch les aiguilles insérées 10 fois toutes les 5 min.
5. L'utilisation d'un stimulateur électrique fonctionnelle, délivrer un train d'impulsions biphasiques (durée 150-ms chacune) avec une intensité de 1 mA aux acupoints à travers l'aiguille.
6. Effectuer une acupuncture factice ou fictive EA en tant que témoin.

Résultats

Il existe différents modèles de rats et de souris pour satisfaire les besoins des types d'épilepsie différents. Pour induire focale TLE, 0,5 pi de pilocarpine (2,4 mg / ul) est administré dans le aCÉ gauche. Les ECoGs épileptiformes prédominantes sont acquises à partir de l'électrode EcoG sur le lobe pariétal de l'hémisphère gauche (Figure 1A: b), et les activités épileptiques rares sont ramassés du reste des électrodes ECoG (Figure 1A: a,

Discussion

Le choix d'un modèle animal d'épilepsie possible est essentiel pour chaque but expérimental. L'un de nos objectifs est d'élucider les effets de EA sur la suppression de l'épilepsie. EA est une médecine alternative qui peut présenter un effet thérapeutique dans l'épilepsie et a été documentée dans la littérature chinoise ancienne. Cependant, il y a un manque de preuves scientifiques pour le prouver. Pour déterminer les effets de l'évaluation environnementale sur l'épilepsie, nous principal...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Médicaments
Zoletil	Virbac		50 mg/kg i.p.
pilocarpine	Sigma-Aldrich	P6503	300 mg/kg i.p. ; 1,2 mg microinjection
PTZ	Sigma-Aldrich	P6500	0,035 mg/souris
polysporin	Pfizer
Surgery
ECoG	électrode Plastiques Une	électrode à vis	E363/20
Piédestal	Plastiques One	MS363
Canule	Plastiques One	C315G/spc
Thermistance	Omega Engineering	44008
Acrylique dentaire	Tempron
Stereotaxic Instrument	Stoelting		Dural arms
Matériel d’enregistrement
ECoG amplificateur	Colbourn Instruments	V75-01
A/D Board	National Instruments	NI PCI-6033E
Détecteurs de mouvement à infrarouge	Biobserve GmbH	sur
ICELUS	G-System
AxoScope 10 Logiciel	Dispositifs
Acupuncture needs
Aiguilles en acier inoxydable	Shanghai Yanglong Medical Articles Co.	Calibre 32 x 1
Fonctions Stimulateur électrique	I.T.O., Japon	Trio 300
AcuPen	Lhasa OMS	pointeur Excel II