ACT-PRESTO: Dégagement de tissus biologiques et méthodes immunomarquage pour Volume Imaging

L'un des défis en neurosciences est la visualisation de câblage du circuit neuronal et des cellules individuelles dans les tissus du cerveau intact. Jusqu'à récemment, ce qui démontre les connexions entre les neurones de cette manière nécessaire 1) tronçonnage série de tissus; 2) marquage moléculaire des cibles spécifiques, tels que des axones ou des protéines; et 3) la visualisation par reconstruction 3D de l'ensemble du cerveau par l' intermédiaire d' enregistrement de calcul ou l' alignement des images 2D série ^1. Ces étapes sont laborieux, exigent beaucoup de temps, et sont susceptibles de perdre des informations lors de la découpe et de l'étiquetage, ce qui rend la cartographie de réseau neuronal extrêmement difficile. Cependant, de nombreux procédés qui permettent la visualisation du tissu intact, sans sectionnement ont été développés. Les tissus biologiques peuvent être optiquement transparents par des techniques de dégagement du tissu ^2-10. L'une des principales méthodes consiste à réduire les différences d'indice de réfraction entre le tissu intact, et la solution d'immersion dans l'ordrepour réduire la diffusion de lumière dans le tissu intact, ce qui rend le tissu transparent et permet l'observation des structures profondes. Certains types de solutions d'immersion ont des propriétés hydrophobes, ce qui entraîne une extinction rapide de fluorescence pendant le processus de déshydratation. Par conséquent, ces procédés ne sont pas compatibles avec l' imagerie de fluorescence sur une longue période de temps ^11,12. Au lieu de réactifs hydrophobes, d' autres procédés utilisent des réactifs hydrophiles , pour la compensation des tissus, tels que SeeDB ⁴ et Sca l e ^6, qui maintiennent l'information structurale et de la fluorescence du ^4,6,8 tissu biologique. Cependant, les macromolécules, y compris les anticorps, ne peuvent pas atteindre le coeur du tissu intact par la diffusion seule. Par conséquent, le pré-marquage des molécules cibles dans les zones profondes de tissus à forte densité de remplissage est techniquement difficile.

Dans une méthode de dégagement du tissu récemment mis au point, CLARITY ^3, un biologique i tissu hydrogel incorporés formés avec l'acrylamide, et les lipides sont éliminés par électrophorèse dans du dodécylsulfate de sodium (SDS) à une solution contenant. L'échantillon est ensuite immergé dans une solution avec un indice de réfraction correspondant pour réduire la diffusion de la lumière ^3. Le système d'élimination des lipides a ensuite été modifié en CLARITY avancé ¹³ et PACT (technique de clarté passive) ^10. Après la polymérisation, les chaînes d'acrylamide réticulent avec des protéines, formant un hydrogel tissulaire. les composants lipidiques ne peuvent réticuler avec l'acrylamide; Ainsi, les lipides peuvent être éliminés par électrophorèse dans du tampon contenant du SDS. Par l'élimination active des lipides des tissus cérébraux augmente nettement la transparence ^9. Cependant, ces méthodes ne traitent pas l'impossibilité de deep-étiquetage par diffusion libre. Pour surmonter cette limitation, les techniques pour le transport actif des réactifs dans les parties les plus profondes des tissus épais sont requis.

Bien que CLARITY permet la compensation des tissus et des tissus profondsla visualisation, il est pas une procédure facile ou rapide. Il peut prendre plusieurs semaines pour effacer toute une ^7,14 du cerveau de la souris. compensation rapide des tissus est essentielle pour l'application de ces méthodes aux paramètres de laboratoire de base ou cliniques pour la recherche en sciences de la vie ou le diagnostic de volume. Le protocole actuel prévoit un processus simplifié pour le dédouanement de tissus biologiques et la détection de la protéine ultérieure par la livraison immunocoloration assisté à la pression. Il est adapté pour un volume d'imagerie à haute résolution d'un grand dépôt et 3D, des systèmes de traitement de données par combinaison avec des méthodes d'imagerie.

Les expérimentations animales doivent se conformer à toutes les réglementations gouvernementales et institutionnelles pertinentes.

1. Préparation des réactifs

1. Pour la solution de monomère d'hydrogel (A4P0): Ajouter 20 g d'acrylamide et 450 ml de 0,1 x tampon phosphate salin (PBS) et ajuster le volume à 500 ml avec 0,1 x PBS.
   ATTENTION: les monomères Acrylamide sont toxiques. Effectuer toutes les procédures dans une hotte avec un équipement de protection individuelle, y compris un écran facial, une blouse de laboratoire, des gants et des chaussures fermées.
   1. Immédiatement avant l'utilisation, ajouter 100 mg de 2,2'-azobis [2- (2-imidazoline-2-yl) propane] 40 ml d'une solution de monomères d'hydrogel (A4P0) dans un tube de 50 ml conique sous une hotte .
2. Pour la compensation des tissus électrophorétique tampon (ETC): Ajouter 40 g de dodécylsulfate de sodium (SDS) et 12,37 g d'acide borique dans 800 ml d'H ₂ O déminéralisée (dH ₂ O). Ajuster le pH à 8,5 avec NaOH et ajuster le volume à1 L avec dH supplémentaire ₂ O.
   ATTENTION: SDS est un produit chimique dangereux; donc le manipuler avec soin.
3. Pour la solution de montage CUBIQUE: ajouter 250 g de saccharose, 125 g d'urée et 125 g de N, N, N ', N' -tetrakis (2-hydroxypropyl) éthylène diamine à 150 ml de _dH2Û et amener le volume 500 mL avec dH ₂ O.

2. Préparation des échantillons et de fixation

1. Euthanasie de la souris.
   1. Préparer la alfaxalone (1 mg / kg) et de xylazine (0,5 mg / kg) dans la même seringue.
   2. Intrapéritonéale injecter le mélange de alfaxalone et de xylazine et permettent 3 min de la souris pour devenir inconscient.
   3. Attendez jusqu'à ce que la souris anesthésié ne répond plus aux stimuli douloureux, comme un pincement de la queue, avant de poursuivre.
      ATTENTION: Suivez les directives institutionnelles appropriées pour la manipulation des animaux.
2. Transcardiaque perfuser la souris avec 100 ml de NaCl à 0,9% (pH 7.4 à 7.5) Solutioncontenant de l' héparine (100 U / ml) , exsangue, suivi par 100 mL de 4% de paraformaldehyde (PFA) dans 1 x PBS (pH 7,4) ^14.
   ATTENTION: solution PFA est toxique. La préparation de la solution PFA et toutes les manipulations ultérieures doit être effectuée dans une hotte et d'un équipement de protection individuelle.
3. Coupez la tête de la souris, ouvrir la peau, et de briser le crâne entre les yeux à l'aide de petits ciseaux.
4. Retirer les morceaux du crâne à l'aide de petites pinces incurvées.
5. Sortez le cerveau ou les organes désirés.
6. Incuber le cerveau et les organes en post-fix solution à 4% PFA à 4 ° C pendant la nuit.
   NOTE: Pour spécifique à la région de compensation de tissu, disséquer la région spécifique ou couper le tissu après la fixation du tissu.
   ATTENTION: solution PFA est toxique. La perfusion transcardial et toutes les manipulations ultérieures de la souris doivent être effectuées dans une hotte et d'un équipement de protection individuelle.

3. Hydrogel Monomère Infusion et Polymerization

1. Incuber les organes fixés dans une solution de monomère d'hydrogel A4P0 à 4 ° C pendant 12 à 24 heures avec agitation douce.
2. Hydrogel monomère perfusé polymérisation tissulaire.
   1. Transférer l'échantillon dans un tube à fond rond de 10 mL avec 5 mL d'une solution de monomère d'hydrogel. Enveloppez la partie supérieure du tube à fond rond avec du Parafilm.
   2. Éliminer l'oxygène à partir du tube à fond rond contenant de l'hydrogel infusé tout le cerveau de souris échantillon en faisant barboter de l'azote à travers le liquide pendant 1 min. fermer rapidement et hermétiquement le tube contenant l'échantillon.
3. Transférer le tube à un bain d'eau (37 ° C) pendant 2 h.
4. Laver l'échantillon polymérisé brièvement avec 0,1x PBS pour éliminer l'excès d'hydrogel.
   ATTENTION: les monomères hydrogels sont toxiques. Pour éviter le contact de la peau avec un monomère d'hydrogel, effectuer toutes les procédures dans une hotte et d'un équipement de protection individuelle, y compris un écran facial, une blouse de laboratoire, et des gants.
   NOTE: polymérisé tissuspeuvent être stockés dans 0,1x PBS contenant de l'azoture de sodium pendant plus de 2 semaines à 4 ° C.
   ATTENTION: L' azoture de sodium est très et très toxique. Effectuer toutes les procédures dans une hotte et d'un équipement de protection individuelle, y compris un écran facial, une blouse de laboratoire, et des gants.

4. électrophorétique Clearing tissulaire (ETC)

1. Transférer l'échantillon polymérisé dans un récipient de tissu et placer le récipient de serviettes dans la chambre du CTE.
2. Remplir la chambre d'ETC avec un tampon d'ETC en utilisant une pompe péristaltique.
3. Définissez les conditions de l'ETC et exécuter le ETC. Utilisez les paramètres suivants.
   1. Pour les réglages de l'ETC pour des organes entiers, utilisez les paramètres suivants: (1,5 ampères), la température (37 ° C), le temps (6,0 h), la vitesse de la pompe (30 rpm) en cours d'exécution.
   2. Pour les réglages de l'ETC pour 1 à 2 mm d'épaisseur des tranches de cerveau de la souris, utilisez les paramètres suivants: courant (1,5 amp), la température (37 ° C), le temps (2,0 h), la vitesse de la pompe (30 rpm) en cours d'exécution.
4. Transfert til a autorisé l'échantillon à un tube conique de 50 ml avec 45 ml de 0,1x PBS. Laver l'échantillon plusieurs fois défrichées avec 0,1x PBS jusqu'à ce qu'aucune bulle sont visibles lorsque le tube est brièvement secoué (pour confirmer la suppression complète de la SDD).

5. immunomarquage des tissus ACT-traitées

1. Pour l'ensemble de cerveau de souris: Incuber l'échantillon dans un volume de 3 ml d'une solution d'anticorps contenant 1 x PBS, 6% d'albumine de sérum bovin (BSA), 0,1% de Triton X-100 et d'azoture de sodium à 0,01% (solution de dilution d'anticorps) avec une dilution facteur de 1/500 pour la tyrosine hydroxylase (TH) anticorps pendant 4 jours à 37 ° C avec agitation douce. Remplacer la solution d'anticorps à la fin du jour 2.
   1. Laver l'échantillon dans un tube conique de 50 ml avec 45 ml de 0,1x PBS pendant 3 - 5 h et changer le tampon toutes les heures.
   2. Incuber l'échantillon dans un volume de 3 ml d'une solution de dilution d'anticorps avec un facteur de dilution de 1/500 à dos d'âne anti-lapin de 488 anticorps secondaire pendant 4 jours à 37 ° C avec agitation douce. Replace les solutions d'anticorps dilué au jour 2.
2. Pour 1 à 2 mm d'épaisseur du tissu cérébral tranché: Incuber l'échantillon pendant une nuit ou jusqu'à 1 jour en 0,5 à 1 ml de volume de solution de dilution d'anticorps avec un facteur de dilution de 1/500 pour les anticorps de type IV de collagène à 37 ° C avec une agitation légère.
   1. Laver l'échantillon dans un tube conique de 15 ml avec un volume de 12 ml de 0,1x PBS pendant 1-2 heures. Changer le tampon toutes les heures.
   2. Incuber l'échantillon dans un 0.5- à 1 ml de volume d'une solution de dilution d'anticorps avec un facteur de dilution de 1/500 pour Cy3 anti-lapin conjugué anticorps secondaire pendant la nuit ou jusqu'à 1 jour à 37 ° C avec une agitation douce.
3. Laver l'échantillon dans 0,1x PBS pendant 3 - 5 h; changer le tampon toutes les heures.
4. Avant imagerie, incuber l'échantillon dans une quantité appropriée de solution CUBIC-mount pendant 1 h à température ambiante sous agitation douce. Remplacer par une solution fraîche CUBIC-mount et incuber pendant 1 h.
   REMARQUE: 14. Préétiqueté tissu peut être combiné avec l'immunomarquage de deux fluorochromes dans les tissus ACT-traitées.

6. immunomarquage de denses Tissues (PRESTO)

1. c-PRESTO
   NOTE: c-PRESTO est adapté pour les petites dimensions des échantillons, tels que testis ensemble, le rein entier, ou de petites sections de grands organes.
   1. Transférer l'échantillon dans un tube de 1,5 ml, ajouter 500 pi de solution de dilution d'anticorps avec un facteur de dilution de 1/500 pour l'anticorps du collagène de type IV, et centrifuger le tube à 600 x g pendant 2 h.
   2. Laver l'échantillon coloré avec 0,1x PBS par centrifugation à 600 g pendant 30 min.
   3. Ajouter 500 pi de solution de dilution d'anticorps avec un facteur de dilution de 1/500 pour l'anticorps secondaire anti-lapin conjugué à Cy3 et centrifuger à 600 x g pendant 2 h.
   4. Laver l'échantillon coloré avec 0.1 x PBS par centrifugation à 600 xg pendant 30 min.
2. s-PRESTO
   NOTE: s-PRESTO est adapté pour les grands tissus.
   1. Préparer une seringue (volume 30 ml) et le connecter à une vanne 3 voies (figure 1A). Collez la valve avec un pistolet à colle pour les conditions de haute pression (figure 1B).
   2. Transférer l'échantillon dans la seringue de la valve connectée à 3 voies en position de fermeture anti-retour.
   3. Ajouter 5 - 7 ml de solution de dilution d'anticorps avec un facteur de dilution de 1/500 pour l'anticorps de type IV de collagène. Libérer la solution d'anticorps dans l'échantillon par l'ouverture de la vanne.
   4. Réglez le piston de la seringue à la position de 17 mL de fournir suffisamment d'espace pour le mouvement perfusion / retrait. Ceci peut être effectué en position ouverte la vanne. Fermez la vanne 3 voies après le réglage de la seringue est terminée.
   5. Placer la seringue contenant l'échantillon sur une pompe à seringue. Fixer les conditions de la pompe à seringue à un volume d'infusion / retrait de 10 mL / min et un groupe 4-min temps de pause en mode à cycle continu (figure 1C).
      NOTE: La pompe infuse jusqu'à ce qu'il atteigne le volume cible (10 ml), puis la direction des changements de débit après une brève pause (4 min).
   6. Faire fonctionner la pompe de la seringue pendant 3 - 24 h à température ambiante (figure 1F).
   7. Ouvrez la vanne 3 voies et remplacer la solution avec 0,1x PBS.
   8. Laver l'échantillon coloré deux fois avec 0,1x PBS pendant 1 h à chaque fois à l'aide de la pompe seringue.
   9. Changer avec une solution de dilution d'anticorps contenant un anticorps conjugué à Cy3 anti-lapin secondaire (facteur de dilution de 1/500) et faire fonctionner la pompe de la seringue pour les 3 - 24 h.
   10. Ouvrez la vanne 3 voies et remplacer la solution avec 0,1x PBS.
3. Avant imagerie, incuber l'échantillon coloré dans une quantité appropriée de solution CUBIC-mount pendant 1 h à température ambiante sous agitation douce. Remplacer par une solution fraîche CUBIC-mount et incuber pendant 1 h.

7. Jeforgemagie

1. Placez le tissu marqué dans un plat confocale et ajouter CUBIC-mount solution jusqu'à ce que le tissu est couvert. Placez une lamelle sur le tissu. Utilisez un microscope confocal à l' image du tissu ¹⁴ sous l'objectif 10X.

Clearing ACT-tissus

Un facteur important affectant la compensation des tissus est la fixation des tissus. PFA fixation et perfusion d'acrylamide sont des étapes distinctes dans ce protocole. Après l'étape de polymérisation du tissu hydrogel, la solution de A4P0 libre est non polymérisé, bien que les hydrogels de tissu infusé sont réticulées avec des macromolécules endogènes. Par conséquent, aucun gel doit former à l' extérieur du tissu (figure 2A). Les résultats de la procédure d'ACT en moins de réticulation entre protéines et acrylamide par rapport au protocole de CLARITY. Par conséquent, l'échantillon de tissu hydrogel est plus poreux. Cette fonction permet l'extraction rapide des lipides et la diffusion de macromolécules. Les sections du cerveau de souris de 1 à 2 mm d' épaisseur ont été suffisamment dégagé dans les 1 - 2 h (figure 2B), et 5-6 h de ETC était suffisante pour clearance de cerveaux entiers de souris (figure 2C). la compensation des tissus à médiation hydrogels induit l'expansion du tissu après l'étape de CTE, mais le tissu est retourné à sa taille d'origine dans la solution d'index apparié réfléchissant. L'échantillon de tissu hydrogel formé dans la procédure d'ACT est très poreux et, par conséquent, de petits composés et les macromolécules peut pénétrer efficacement et facilement diffuser (figure 3). Après 2 h d' incubation de 1 mm de tranches de cerveau avec la tyrosine hydroxylase (TH) et de l' anticorps de type IV de collagène, un subséquente 2 h d' incubation avec un anticorps secondaire était suffisant pour marquer les neurones dopaminergiques à une profondeur de 500 um (figure 3) .

Immunomarquage PRESTO-tissu

les organes denses ont généralement des concentrations élevées de fibres de l'ECM, ce qui affecte la pénétration des anticorps dans les tissus. Ainsi, les anticorps Penetassignée à une profondeur de seulement 20 à 30 pm dans les tissus denses, comme un tissu rénal, après 12 heures d'incubation. Pour contourner cette limitation, nous avons conçu des méthodes de pénétration des macromolécules actives qui permettent la livraison de réactifs dans les tissus profonds, à savoir PRESTO (pression liée transfert efficace et stable de macromolécules dans les organes) (Figure 4). Par rapport à l'incubation statique du tissu rénal ACT-traitées avec des solutions d' anticorps, l'application des forces centrifuges (600 xg) avec une centrifugeuse de table (PRESTO centrifuge, c-PRESTO) grandement amélioré la livraison d'anticorps dans les tissus profonds (figure 5). Lorsque nous avons appliqué la procédure c-PRESTO aux tissus denses, 3 h d'incubation était suffisante pour étiqueter 250- aux structures profondes de 300 um. Afin d'améliorer la distorsion des tissus sans dommage tissulaire important, nous avons conçu une machine qui fournit des flux de convection avec une pompe à seringue (seringue PRESTO, s-PRESTO). Ce processus amélioré de façon similaire pe d'anticorpsnetration par rapport à la diffusion passive (figure 5).

Figure 1. Préparation de l'appareil PRESTO-s. A. Une seringue (30 ml) et robinet à trois voies. B. Le robinet d' arrêt à trois voies connectée et collée à la seringue. C. La seringue contenant la solution d'échantillon et de l' anticorps, et la seringue placée sur la pompe à seringue. D. La pompe seringue et la configuration de travail de condition. E. La pompe insuffle une solution contenant les réactifs de marquage dans l'échantillon. Lorsque le volume désigné est atteint, les changements de direction de pompage et retire la solution après une période de temps. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. immunomarquage avec le tissu du cerveau de la souris ACT-autorisé. Des images de 1 mm de tranches de cerveau de souris traitées ACT montrant le cerveau de la souris cortex colorées avec un anticorps dirigé contre le collagène de type IV, et une partie du tronc cérébral colorées avec un anticorps dirigé contre la tyrosine hydroxylase (TH). Barre d'échelle, 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. PRESTO méthodes d'immunomarquage. Les anticorps ne peuvent pas pénétrer dans les tissus denses par diffusion. méthodes PRESTO de immunomarquage ont été conçus pour infuser activement macromolécules et de livrer des réactifs dansdes tissus denses. L'application de forces centrifuges à l'aide d'une centrifugeuse de table standard (PRESTO centrifuge, c-PRESTO) nettement facilité la fourniture d'anticorps. Appling flux de convection avec une pompe à seringue (seringue PRESTO, s-PRESTO) l'amélioration de la pénétration de l'anticorps. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. PRESTO immunomarquage de tissu dense ACT-autorisé. Pour c-PRESTO, les tissus ont été centrifugés à 600 g pendant 3 h à l'aide d'une centrifugeuse de table standard afin d'accélérer la pénétration des anticorps primaires et secondaires. S-PRESTO, une pompe de seringue a été utilisé pour délivrer des anticorps. des organes tels que les souris, les reins et le foie, ont été marquées avec du collagène de type IV. Par rapport aux procédés classiques, 3 h deC ou S PRESTO améliore notablement la profondeur de marquage. Dans le rein et le foie, la profondeur de l'axe Z atteint 300-350 um ou plus profondément dans les échantillons PRESTO (à droite), alors que des échantillons témoins sont marqués à une profondeur de seulement 40 - 50 um (à gauche). Une image reconstruite en 3D a été obtenue avec un microscope confocal. Barre d'échelle, 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.