Un moyen simple pour mesurer Transformations en récompense le comportement de recherche Utilisation Drosophila melanogaster

Résumé

Nous décrivons un protocole pour induire enrichissante et nonrewarding expériences dans les mouches des fruits (Drosophila melanogaster) en utilisant la consommation volontaire d'éthanol en tant que mesure des changements dans les états de récompense.

Résumé

Nous décrivons un protocole de mesure de l' éthanol auto-administration dans les mouches des fruits (Drosophila melanogaster) comme un proxy pour les changements d'états de récompense. Nous démontrons une façon simple de puiser dans le système de récompense à la mouche, de modifier les expériences liées à la récompense naturelle, et utiliser la consommation volontaire d'éthanol en tant que mesure des changements dans les états de récompense. L'approche est un outil utile pour étudier les neurones et les gènes qui jouent un rôle dans les changements d'état interne expérience médiée. Le protocole est composé de deux parties distinctes: l'exposition des mouches à des expériences enrichissantes et nonrewarding, et le dosage de la consommation volontaire d'éthanol en tant que mesure de la motivation pour obtenir une récompense de drogue. Les deux parties peuvent être utilisées indépendamment pour induire la modulation de l'expérience comme une étape initiale pour d'autres essais en aval ou comme un essai d'alimentation à deux choix indépendant, respectivement. Le protocole ne nécessite pas d'installation compliquée et peut donc être appliquée dans tous les laboratory avec les outils de base de la culture à la mouche.

Introduction

Modification du comportement en réponse à l' expérience permet aux animaux d'adapter leur comportement aux changements dans leur environnement ^1. Au cours de ce processus, les animaux intègrent leur état physiologique interne avec les conditions changeantes de l'environnement extérieur et ensuite choisir une seule action sur une autre pour augmenter leurs chances de survie et de reproduction. Les systèmes de récompense ont évolué pour motiver les comportements qui sont nécessaires pour la survie des individus et des espèces en renforçant les comportements qui améliorent la survie immédiate, comme manger ou boire, ou celles qui assurent la survie à long terme, tels que le comportement sexuel ou le soin des enfants ^2. Composés artificiels tels que les médicaments d'abus affectent également les systèmes de récompense par les voies neuronales cooptant qui interviennent dans les récompenses naturelles ^2.

Au cours des deux dernières décennies, la mouche Drosophila melanogaster a été établi comme un modèle prometteur pour l' étude de la molecet parti- mécanismes neuronaux qui façonnent les effets de l' éthanol sur le comportement ^3,4.

Auparavant, nous avons identifié un sous - ensemble de neurones peptidergiques dans les mouches (récepteur FNP / FNP (R) neurones) qui récompense naturelles de couple, comme l' expérience sexuelle, à la motivation d'obtenir des récompenses de drogues ^5. expression des FNP est sensible à la fois des expériences sexuelles et à des récompenses de médicaments, tels que l'éthanol intoxication. Les changements dans les niveaux d'expression des FNP sont convertis à des altérations dans l' éthanol auto-administration ^5, où la haute NPF réduit et une faible FNP augmente la préférence à consommer de l' éthanol. L'activation de neurones FNP est gratifiant pour les mouches, car ils présentent une forte préférence pour une odeur associé à l'activation, ce qui se traduit également par la consommation d'éthanol réduite. Plus important encore, l'activation des neurones FNP interfère avec la capacité de mouches pour former une association positive entre l'intoxication à l'éthanol et une queue d'odeur. Le lien de causalité entre la FNP / Rsystème, la mémoire de récompense, et la consommation d'éthanol suggère que l' on peut utiliser de l' éthanol auto-administration en tant que mesure des changements dans les états de fidélité ^5.

Dans cette publication, nous démontrons une approche intégrée pour exploiter le système de récompense naturelle à la mouche et les changements de dosage dans les états de récompense. L'approche se compose de deux parties distinctes, un protocole de formation pour manipuler les expériences liées à la récompense-naturelles, suivi d'un deux choix dosage capillaire d'alimentation (CAFE) pour évaluer l'éthanol auto-administration comme une estimation des changements dans les états de récompense. Le dosage de CAFE est analogue aux essais de choix de deux bouteilles utilisées dans les études sur les rongeurs pour médicament auto-administration et a été montré pour refléter certaines propriétés de comportement de dépendance comme chez les mouches ^6.

Protocole

Note: aperçu général de la conception expérimentale: Le dispositif expérimental comprend un protocole adapté pour la parade nuptiale suppression ^7-9 dans laquelle les mouches mâles sont exposés à des expériences enrichissantes et nonrewarding en 3 sessions de formation consécutives au cours de 4 d. A la fin de la phase de l'expérience, les mouches sont testés dans un dosage volontaire de la consommation d'éthanol à deux choix pour les 3 - 4 d. Le protocole ici comprend plusieurs étapes préparatoires, dont certaines peuvent être faites à l' avance pour être utilisé dans plus d'une expérience, tandis que d' autres devraient avoir lieu en temps opportun avant le début de l'expérience (tableau 1).

1. Les étapes préparatoires

1. Préparation du système capillaire d'alimentation
   1. Chauffer une aiguille 27 G et l' utiliser pour percer de petits trous le long d' un flacon (Figure 1).
   2. Couper le bouchon du flacon à moitié (en croix) en utilisant une lame de rasoir. Mark quatre points sur la surface du bouchon, créant un square forme pour positionner les supports capillaires en. Utiliser une aiguille de 18 G pour faire 4 trous à travers le bouchon (figure 1b).
   3. Utilisez une lame de rasoir pour couper Micropipettes afin qu'ils puissent tenir fermement 5 capillaires en verre uL, qui servent d'adaptateurs.
   4. Insérez 4 adaptateurs capillaires dans les fiches préparées.
   5. Marquer la position des 2 éthanol- et deux capillaires contenant nonethanol-sur la fiche.
      Note: Il est recommandé de conserver les positions des 2 types de capillaires cohérents dans tous les flacons. Faites attention à la taille des trous, comme de grands trous permettent l'évasion de mouches sur les flacons. En outre, il est recommandé d'utiliser le côté lisse du bouchon (généralement opposée à la face de coupe) que le côté qui fait face vers le bas lorsqu'il est inséré dans le flacon, en coupant le bouchon crée quelques petites fibres lâches que les mouches peuvent s'enchevêtrées .
   6. Préparer un grand nombre de flacons et d'adaptateurs à utiliser pour le système capillaire d'alimentation (CAFE)expériences décrites à l'étape 2.3.
2. Préparer des flacons d'alimentation faible en verre
   1. Un jour avant la collecte des mouches (étape 1.4), disposer de 200 flacons de verre sur des supports de tubes à centrifuger. Melt voler la nourriture ( en fonction de la mélasse de semoule de maïs recette, voir le tableau des matériaux) à l' aide d' un micro - ondes. Verser 2 ml de nourriture à la mouche dans les flacons de verre (essayez de ne pas salir la nourriture sur les murs du flacon). Laisser durcir la nourriture, et de couvrir les flacons avec une pellicule de plastique.
      REMARQUE: Les flacons en verre contenant les aliments peuvent être conservés à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
   2. Le jour de la collecte à la mouche, prendre les flacons du réfrigérateur et laissez-les atteindre RT avant de les utiliser à la maison de mouches.
      NOTE: Si les flacons de nourriture sont vieux de plusieurs semaines, assurez-vous que la nourriture est toujours intacte et non détachée de la fiole, que les mouches peuvent être piégés dans les fissures entre la nourriture et le verre.
3. Faire solution stock alimentaire pour le dosage capillaire d'alimentation
   1. Pour prépare la solution stock alimentaire (5% de saccharose et 5% d'extrait de levure), dissoudre 5,88 g d'extrait de levure et 5,88 g de saccharose dans 100 ml d'eau distillée.
      REMARQUE: La solution mère est très sujette à la contamination. Par conséquent, il est recommandé de l'autoclave, il (121 ° C, 30 min, et sans un cycle de séchage) et aliquote dans 850 ul aliquotes de travail pour être conservé à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure. La concentration des ingrédients dans la solution mère est de 5,88% et atteindra la concentration finale de 5% après l'addition de 15% d'éthanol ou de l'eau (150 pi dans 850 pi de solution alimentaire premade) juste avant son utilisation dans l'étape 2.3.
4. La collecte des mouches expérimentales
   1. Collecter 200 mouches mâles naïfs en utilisant un tampon de CO _2.
      Remarque: Utilisez toute souche de laboratoire pertinent pour la question expérimentale. 250 mouches peuvent être facilement collectées à partir de cinq bouteilles de mouches à leur phase eclosion de sélection. Lors de la collecte des mouches, faites attention au colmouches Lect qui ont récemment éclos (les mouches vierges prospectifs: les mouches lumineuses avec une tache de méconium sur leur abdomen). mouches expérimentales devraient être hébergés individuellement dans de petites fioles de verre contenant de la nourriture et vieilli à 3 - 4 d vieille avant d'être utilisé dans l'expérience.
   2. Utilisez des bouchons souples pour fermer les flacons.
      REMARQUE: Les mêmes bouchons mous seront très utiles pour la phase de formation lors de l'utilisation la bouche d'aspiration pour insérer les femmes dans et hors des flacons pendant la phase de l'expérience.
5. Collecte formateur mouches
   NOTE: Toutes les mouches recueillies doivent être conservés dans un 12 h / 12 h de lumière / incubateur obscurité à 25 ° C et 70% d'humidité relative (HR). Le 12 h / 12 h cycle lumière / obscurité peut être changé pour un temps de départ commode.
   1. Virgin femmes mouches entraîneur
      1. Prélever 500 trainer femme vierge vole d'un stock WT ou un stock de virginator pour une utilisation comme femelles réceptives vierges. Gardez les mouches femelles en groupes de 25 par la nourriture régulière taille du flacon, et toutow leur âge à 3 - 4 d ancienne avant de les utiliser dans l'expérience.
   2. Accouplées mouches formateur féminins
      1. Collecter 300 mouches femelles vierges d'un stock WT ou virginator stocks de subir l'accouplement avant la phase de formation (étape 1.6.1).
         NOTE: Les mouches femelles sont conservées dans des groupes de 10 femelles par des aliments de taille normale flacon et vieilli à 3 - 4 d vieille avant d'être utilisé dans l'expérience.
   3. Les mâles utilisés pour générer accouplés femelles mouches formateur
      1. Collecter 150 mouches mâles (pas nécessairement vierge).
         NOTE: Les mouches sont conservés dans des groupes de 15 hommes pour la nourriture régulière taille du flacon et vieilli à 3 - 4 d vieux avant d'être jumelé avec vierge mouches femelles pour créer les femelles fécondées formateur.
6. Génération accouplées mouches formateur féminin
   1. Pour générer accouplée mouches femelles à être utilisé en tant que formateurs, des groupes de 10 femelles vierges paire mouches avec 15 mâle vole en retournant un flacon contenant mâle dans une femelle-contaIning flacon 16 - 18 h avant la phase de formation (étape 2.1) ^10.
      NOTE: Cela devrait normalement avoir lieu la veille de la session de formation. Le 1,5: 1 ratio entre le mâle vole à mouches femelles assure que toutes les femelles seront accouplés.
   2. Le jour de l'expérience, séparer les femelles fécondées des mâles en aspirant les mâles de la fiole à l'aide d'un aspirateur à bouche. Effectuer ce droit avant le début de chaque journée de formation.

2. Les étapes expérimentales

1. Mise en place de la phase de l'expérience
   1. Démarrer l'expérience aussi proche que possible du début de la phase légère dans l'incubateur. Placez les femelles d'entraîneur (à la fois vierges et accouplées) dans la chambre de comportement.
      NOTE: Il est recommandé de réaliser l'expérience dans une chambre de comportement, ou tout autre environnement isolé qui est calme et réglé à 25 ° C et 60-65% d'humidité relative. Maintenir l'humidité de plus de 50% est très important, étant donné que le comportement de cour et l'accouplements dépendent de la phéromone de détection, qui est connu pour être sensible à l'humidité.
2. Exposer mouches mâles à des expériences enrichissantes et nonrewarding
   1. Disposer les flacons de verre contenant les mouches mâles simples sur des supports de microtubes, le positionnement des flacons le long des marges de la crémaillère.
      NOTE: Cette disposition permet à l'expérimentateur d'observer facilement les paires de mouches qui subissent la copulation sans prendre les flacons hors du rack.
   2. Préparer (tel que décrit à l' étape 2.2.1) 2 groupes de 100 flacons de verre contenant seul mâle vole sur des supports séparés pour les hommes subissant des expériences d'accouplement enrichissantes et nonrewarding (ie rejetées et accouplées).
   3. Aspirer formateurs femelles et les ajouter à chaque flacon contenant les mouches mâles. Réglez la minuterie pour 1 h. En commençant par le groupe rejeté, ajouter une femelle accouplée à chaque flacon. Ensuite, passez aux mâles d'être accouplées et ajoutez une femelle vierge à chaque flacon.
   4. Regardez les rencontres d'accouplement étroitementfaire en sorte que les mâles qui interagissent avec des femelles vierges accouplent avec succès dans la première heure et que les hommes qui interagissent avec les femelles précédemment accouplés ne s'accouplent pas. Pour surveiller la cohorte rejetée au cours de 1 h, régler une deuxième minuterie pour 15 minutes et regarder les hommes toutes les 15 min.
   5. Décharge les hommes de la cohorte rejetée qui a réussi à accoupler et les hommes de la cohorte accouplés qui ne finissent par l'accouplement à la fin de la première session de formation.
   6. Terminer la première session de formation en aspirant les formatrices précédemment accouplés dans un flacon alimentaire mouche régulière, et les garder pour la prochaine session de conditionnement. Suivez cette étape en aspirant doucement les femelles du groupe masculin accouplés.
   7. Laissez les mouches se reposer pendant 1 h.
   8. Répétez les étapes 2.2.3 - 2.2.7 deux fois.
   9. Répétez la session de formation dans les étapes 2.2.3 - 2.2.8 chaque jour pendant 3 plus d.
3. Consommation d'enregistrement (CAFE)
   1. A la fin de la dernière conditioning session (quatrième jour), aspirer les hommes et les groupes individuels dans les flacons capillaire d'alimentation. Utilisez un bouchon souple pour couvrir le flacon capillaire d'alimentation tout en insérant les mouches, et le remplacer rapidement avec le bouchon ready-made alimentation capillaire après toutes les mouches ont été insérées. Groupe 6 - 8 vol de chacun des groupes expérimentaux dans un flacon, en créant pas moins de 8 flacons par condition.
   2. Mouiller les bouchons en ajoutant doucement 5 ml d'eau en haut de la fiche. Soyez prudent tout en ajoutant de l'eau pour éviter le déversement dans les flacons. Ajouter quantité égale d'eau dans chaque flacon.
      REMARQUE: Cette étape est fait pour réduire l'évaporation des capillaires. Par conséquent, il est répété tous les jours pendant le reste de l'expérience. En fonction de l'humidité relative, les jours suivants peuvent nécessiter moins d'eau à ajouter aux bouchons.
   3. Préparer deux solutions alimentaires séparées par addition d'éthanol ou d'eau pour les aliquotes stocks alimentaires pour créer une concentration finale de 15%.
   4. Pour remplir le capillaries avec les deux solutions alimentaires, créer 5 pi aliment liquide gouttes sur une bande de film de laboratoire et permettent la solution pour remplir le capillaire jusqu'à ce qu'il atteigne la marque de 5 pi. Assurez-vous d'utiliser l'extrémité claire du capillaire, qui est proche de la ligne de marque noire de 5 pi.
      NOTE: Pour remplir plusieurs capillaires à la fois, il est possible de connecter 6 - 8 adaptateurs capillaires ensemble et les utiliser comme un insert pour maintenir les capillaires.
   5. Appuyez sur les capillaires doucement sur la bande de paraffine pour positionner la solution alimentaire exactement à la marque noire. Sceller les capillaires en plongeant l'extrémité de chaque capillaire dans les petites gouttes d'huile minérale. Cette étape minimise l'évaporation potentielle de la solution alimentaire.
   6. Insérer deux capillaires contenant de l'éthanol et deux capillaires de nonethanol contenant à travers les 4 adaptateurs / porte dans le bouchon jusqu'à ce que les côtés exposés des capillaires PEEK à peine de l'intérieur du flacon (1 mm ou moins de la surface du bouchon).
      REMARQUE:Garder l'ouverture des capillaires à proximité de la prise humide réduit l'évaporation et permet un accès facile à la nourriture, les mouches sont assis normalement sur les bouchons et grimpent sur le capillaire exposé à nourrir.
   7. En plus des flacons contenant des mouches expérimentales, préparer un flacon maquette sans mouches. Ce contrôle sert à évaluer l'évaporation naturelle.
      REMARQUE: Essayez de maintenir le positionnement relativement égale de l'ouverture capillaire par rapport aux bouchons, car les différences peuvent conduire à une évaporation variable et à induire en erreur les données de consommation. Maintenir une humidité adéquate pendant l'expérience et la position des ouvertures capillaires aussi près que possible de la prise humide, comme une faible humidité et une grande distance de la fiche humide peut donner lieu à l'évaporation incontrôlée.
   8. Notez la position relative du liquide dans chacun des capillaires par rapport à la ligne de marque noire en mm en utilisant une règle, et d'écrire ces valeurs vers le bas.
      NOTE: Si la solution est positionné exactement au noir line, la valeur doit être égale à zéro, et si elle est au-dessus ou au-dessous, il devrait être des valeurs positives ou négatives, respectivement. Les premiers niveaux du liquide fixent les points de référence pour les / N valeurs de consommation de O final.
   9. Mettre les flacons dans l'incubateur pendant 24 h. Remplacer les capillaires à un moment constant pendant toute l'expérience.
   10. Retirer les capillaires doucement des flacons et de mesurer les niveaux de liquide par rapport à la ligne de marquage noir.
   11. Vérifiez soigneusement le niveau de liquide dans le flacon maquette.
       NOTE: Si les niveaux ont chuté de plus de 2 mm, il indique que l'évaporation est élevée et les niveaux de consommation ne sont pas fiables.
   12. Humidifiez les bouchons en douceur avec 2 ml d'eau et insérer un nouvel ensemble de capillaires, comme indiqué dans les étapes 2.3.3 - 2.3.10. Mettre les flacons dans l'incubateur pendant 24 h.
4. Détermination de préférence
   1. Calculer la consommation totale de chaque capillaire en soustrayant le niveau final de l'iniveau au point préside d'abord de départ.
   2. Combiner les valeurs des deux capillaires avec le même aliment (c. -à- nonethanol capillaires séparément des capillaires contenant de l' éthanol).
   3. Calculer la préférence de l'éthanol en soustrayant la quantité consommée à partir des capillaires non-éthanol à partir de la quantité consommée à partir des capillaires contenant de l'éthanol et diviser la valeur par les valeurs de la consommation totale de tous les capillaires du même flacon.
   4. La moyenne des indices de préférence de tous les flacons du même groupe expérimental.
      
      NOTE: Nonethanol 1 (NE1), Nonethanol 2 (NE2), Ethanol 1 (E1), Ethanol 2 (E2), nonethanol total (NE Total) = NE1 + NE2, éthanol total (Total E) = E1 + E2, Total somme consommation (total Somme) = total NE + total E, et l'éthanol préférence Index (PI)

Résultats

FPreviously, Devineni et al. ont montré que lorsque les mouches des fruits ont le choix de consommer des aliments contenant de l' éthanol, ils affichent une forte préférence pour les aliments contenant de l' éthanol sur nonethanol contenant de la nourriture ^6. Montré voici quelques résultats représentatifs que nous avons obtenus lors du dosage de la préférence de l'éthanol inné de naïfs mouches mâles qui n'a pas subi le protocole de formation.

Discussion

Ici, nous illustrons les détails d’une approche intégrée pour mesurer les altérations du comportement de recherche de récompense, basée sur des travaux antérieurs décrits par Devineni et al.⁶ et Shohat-Ophir et al⁵. La première section du protocole utilise différents types d’interactions sexuelles comme entrée d’expérience, et la deuxième section utilise un test d’alimentation à deux choix pour évaluer l’effet de l’expérience sur la préférence pour la consommation d’éthanol.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Polystyrène 25 x 95 mm Flacons	FlyStuff	32-109
flacons étroits en plastique	FlyStuff	42-102
Aiguille stérile jetable 18 G et 27 G  ;	peut être acquis par n’importe quelle entreprise		1,20 X 38 mm (18 G x 1 1/2 ») , 0,40 X 13 mm (27 G x 1/2 »)
10 x 75 mm Tubes de culture jetables en verre borosilicaté	kimble chase	73500-1075
Pipettes calibrées 5 μ ; L	VWR	53432-706	codé en couleur blanc pour contenir 5 μ ; L
Huile minérale  ;	Sigma-Aldrich  ;	M5904
Saccharose, biologie moléculaire Qualité	CALBIOCHEM	573113
Extrait de levure La poudre pour la microbiologie	peut être achetée par n’importe quelle entreprise
Éthanol	Sigma-Aldrich  ;	32221
Pointes de pipette standard (micro-pipettes)	ThermScientific	T114R-Q	volume : 0,1 - 20 μ ; L (ultramicro)
IDENTI-PLUGS (Bouchons pour tubes en mousse)	Jaece	L800-A	pour les ouvertures de 6 à 13 mm
IDENTI-PLUGS (Bouchons pour tubes en mousse)	Jaece	L800-D	pour les ouvertures de 35 à 45 mm
Porte-mouches virginator  ;	Bloomington Drosophila Stock Center	#24638
Flacons étroits, Tray Pack (PS)	Genesee Scientific Corporation	;# 32-109BR
Drosophila Media Recettes et méthodes	Bloomington Drosophila Stock Center	http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.htm
propionic acid	Sigma-Aldrich  ;	P5561
acide phosphorique	Sigma-Aldrich  ;
4-hydroxybenzoate de méthamphle	sigma-aldrich  ;	H3647
Agar Agar	peut être acquis par n’importe quelle entreprise
semoule de maïs	peut être acquise par n’importe quelle entreprise
Mälasses de grand-mère	B& G Foods, Inc	non indiqué
levure sèche instantanée	peut être acquise par n’importe quelle entreprise