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Article de méthode

Isolement et culture des adultes cellules souches neurales de la Subcallosal Zone Souris

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DOI :

10.3791/54929

⸱

15 décembre 2016

 ,  , 
1Department of Anatomy, Korea University College of Medicine

Dans cet article

Résumé

La mise en place de systèmes de culture pour l’expansion des cellules souches neurales adultes (CSNa) permet l’examen et l’application des CSNa à des fins thérapeutiques. La zone sous-calleuse (SCZ) a récemment été reconnue comme une nouvelle région formant des neuroblastes chez les souris adultes. Ici, les méthodes d’isolement, d’expansion et de différenciation des SCZ-aNSC sont décrites.

Résumé

Les cellules souches neurales adultes (aNSCs) peuvent être utilisées pour la régénération des tissus cérébraux endommagés. Les NSC ont le potentiel de se différencier et de proliférer en trois types de cellules : les neurones, les astrocytes et les oligodendrocytes. L’identification des régions dérivées des aNSC et la caractérisation des propriétés des aNSC sont essentielles pour l’utilisation potentielle des aNSC et pour l’élucidation de leur rôle dans la régénération neuronale. La zone sous-calleuse (SCZ), située entre la substance blanche et l’hippocampe, a récemment été signalée comme contenant des aNSC et donnant continuellement naissance à des neuroblastes. Un faible pourcentage d’aNSC de la SCZ est différencié en neurones ; La plupart des cellules sont différenciées en cellules gliales, telles que les oligodendrocytes et les astrocytes. On suggère que ces cellules ont un potentiel thérapeutique pour les lésions corticales traumatiques. Ce protocole décrit en détail le processus de génération de SCZ-aNSC à partir d’un cerveau de souris adulte. Une matrice cérébrale avec des intervalles de 1 mm est utilisée pour obtenir les coupes coronales contenant la SCZ et pour disséquer précisément la SCZ de l’ensemble du cerveau. Les sections SCZ sont initialement soumises à une culture de la neurosphère. Un système d’élevage bien développé permet de vérifier leurs caractéristiques et d’accroître la recherche sur les CSN. Un système de culture de la neurosphère fournit un outil utile pour déterminer la prolifération et collecter les véritables NSC. Une culture monocouche est également un système in vitro permettant d’analyser la prolifération et la différenciation. De manière significative, ce système de culture fournit un environnement plus homogène pour les NSC que le système de culture de la neurosphère. Ainsi, en utilisant une région cérébrale discrète, ces systèmes de culture seront utiles pour élargir nos connaissances sur les aNSC et leurs applications à des fins thérapeutiques.

Introduction

NSCs présentent des caractéristiques d’auto-renouvellement et de différenciation de plusieurs lignées. Pour confirmer ces propriétés, un système de culture de la neurosphère a été largement utilisé. Le système de culture de la neurosphère a été développé au début des années 1990 et a servi de système standard de culture de cellules souches1. En fonction de la puissance d’auto-renouvellement, les NSC prolifèrent continuellement et génèrent une masse cellulaire dans une culture en suspension. Le nombre de cellules et la taille de la neurosphère sont considérés comme étroitement associés aux propriétés de prolifération des CSN. Les cultures monocouches sont également largement utilisées pour le maintien et la différenciation des CSN. Par rapport à la culture de la neurosphère, le système de culture monocouche offre une maintenance et une expansion plus homogènes des CSN2. Ces deux systèmes de culture bien développés ont contribué à la caractérisation des aNSC in vitro.

NSCs résident dans différentes régions du cerveau, telles que la zone sous-ventriculaire (SVZ) du ventricule latéral et la zone sous-granulaire (SGZ) de l’hippocampe3-5. La zone sous-calleuse (SCZ) de la substance blanche sous-corticale caudale est reconnue comme une nouvelle région neurogène6-8. Il a récemment été rapporté que les SCZ-aNSCs ont un potentiel thérapeutique dans les lésions cérébrales traumatiques9. Par rapport à d’autres régions neurogènes, la SCZ réside le long de la substance blanche sous-corticale. Dans le cerveau humain, la substance blanche sous-corticale occupe une région plus grande que dans le cerveau de la souris10. Par conséquent, il est important de comprendre les caractéristiques des SCZ-aNSC à l’aide d’un système de culture in vitro afin de promouvoir l’utilisation potentielle de ces cellules pour la régénération neurale. Une dissection précise de la région cérébrale souhaitée est nécessaire pour exclure une éventuelle contamination par des régions indésirables contenant des CSN actives ou quiescentes. Par exemple, les aNSC dans les régions non neurogènes peuvent être activées et produire de nouvelles cellules neurales dans les cerveaux lésés ou lors de la culture in vitro 11. Pour obtenir des CSN à partir de la SCZ, des cellules ont été prélevées à partir de tranches de cerveau contenant la SCZ. Ensuite, une micro-dissection minutieuse de la région SCZ a été réalisée à l’aide d’une aiguille fine. Pour générer la neurosphère à partir de la SCZ, des morceaux de tissu SCZ micro-disséqués ont été dissociés en cellules uniques, puis cultivés en suspension en présence du facteur de croissance épidermique (EGF) et du facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF). Une fois que les SCZ-aNSC ont formé des neurosphères, ils peuvent également être maintenus sous forme de neurosphères ou de monocouches pour l’expansion. Cette procédure met également en évidence des processus d’immunomarquage avec divers marqueurs pour la détection des NSC et de leur descendance après leur expansion et leur différenciation dans une culture monocouche. Ici, un protocole visuel du système de culture SCZ-aNSC est présenté. Ce protocole contient des instructions détaillées pour la micro-dissection de la région SCZ et pour l’entretien et le passage des cellules.

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Protocole

1. Préparation des matériaux et de la culture moyenne

  1. Pour la dissection et la dissociation du SCZ, envelopper la matrice du cerveau, à double tranchant lame de rasoir, et une pince avec une feuille d'aluminium, puis les stériliser par autoclavage.
  2. Préparer 50 ml de tampon PBS froid pour laver l'ensemble du cerveau de souris.
  3. Mettre en place un microscope de dissection et préparer les outils chirurgicaux nécessaires à la dissection du cerveau (ciseaux et des pinces autoclavés) et l'isolement de la SCZ (seringue de 1 ml, 30 aiguille G, matrice de cerveau, et une pince fine).
  4. Préparation de N2 moyen:
    1. Préparer F-12 / DMEM (+ L-glutamine + bicarbonate de sodium) milieu avec 2% de B27, 1% de suppléments N2, et 1% de pénicilline- streptomycine.
      Remarque: Le milieu de culture se compose de milieu de croissance et les facteurs N2 (20 ng / ml épidermique purifiée du facteur de croissance (EGF) et 20 ng / ml de facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF2)).
  5. Préparer un tampon de digestion (40 unités / ml papaïne, 2,4 unité / ml DISPASe II, et 2% de pénicilline-streptomycine dans du PBS) pour la digestion des tissus.
  6. Préparation de la plaque de revêtement et Coverslip:
    1. Préparer la poly-L-ornithine (OLP; 0,01%) et de laminine (10 pg / ml dissous dans DH 2 O). Pour enrober des plaques 6 puits pour le maintien de la SCZ-aNSCs en monocouche ou 18 lamelles mm pour immunocoloration, les incuber avec l'OLP nuit à 4 ° C. Ensuite , lavez - les 3 fois avec DH 2 O. Laisser les plaques et lamelles sécher après le dernier lavage.
    2. Ensuite, incuber les plaques avec la laminine nuit à 4 ° C. Ensuite, lavez - les 3 fois avec DH 2 O.
      Attention: Ne pas sécher la laminine, qui aura une incidence sur la fixation des cellules.
      Remarque: Les solutions de revêtement peuvent être réutilisés 3 fois.

2. Isolement et Dissociation du SCZ Adult

  1. Avant la préparation de la culture, placer la matrice du cerveau et le rasoir à double tranchant sur la glace.
    Note: Ne pas congeler la matrice du cerveau, parce que le brain pourrait attacher.
  2. Sacrifiez une souris (8 semaines) par le CO 2 asphyxie ou la dislocation cervicale.
    1. Coupez la tête avec des ciseaux pointus après la pulvérisation de 70% d'éthanol. Pour immobiliser la tête, tenez les deux côtés de la tête fermement. Couper la peau avec des ciseaux à la ligne médiane dans une direction caudale-rostrale. Ceci favorise l'élimination complète de la peau du crâne.
    2. Retirer la partie caudale du crâne (postérieur lambda) d'abord, puis insérez la pince entre le crâne et le cerveau à la position dorsale médiane. Prenez la gauche (ou à droite) os pariétal et éplucher soigneusement hors tension. Répétez cette procédure pour le retrait de l'autre os pariétal.
      Note: Disconnection du nerf optique et le retrait des méninges du cerveau rendre plus facile à détacher le cerveau du crâne.
    3. Transférer le cerveau à un tampon PBS froid (25 ml) et le rincer deux fois pour éliminer l'excès de sang.
  3. Placer le cerveau dans la matrice de cerveau sur de la glace et de macoupes coronales ke pour obtenir 1 mm tranches épaisses. Transférer les tranches de cerveau (1 mm) contenant les régions SCZ qui sont situées dans la partie postérieure du cerveau à un PBS froid dans une boîte de Petri en plastique de 35 mm.
    Attention: Afin d'obtenir un plan parallèle de coupes coronales, veiller à ce que la fissure du cerveau est placé dans la ligne médiane de la matrice du cerveau; il est essentiel d'éviter des variations inutiles dans les sections.
    Remarque: Obtenir des tranches de cerveau à 2-3 mm en arrière bregma; ce qui permet la séparation de la SCZ de la SVZ.
  4. Sous le microscope de dissection avec un faible grossissement, les micro-disséquer la SCZ de la zone de la matière blanche du cortex et de l' hippocampe avec une aiguille de 6,9 30G pliée. Ensuite, retirez les régions du cortex au-dessus du SCZ. Placez la région SCZ disséqués à partir des tranches dans un plat en plastique de Pétri de 35 mm sur la glace sans PBS froid.
    Remarque: La contamination des régions supplémentaires contenant des neurones matures pourrait affecter la viabilité des aNSCs et Neurosphère formation barce qu'ils subissent la mort cellulaire dans des conditions de culture ANSC.
  5. En utilisant une aiguille 30 G plié, hacher immédiatement les tissus disséqués en petits morceaux.
    Remarque: Si un temps plus long est nécessaire pour disséquer le tissu SCZ, plonger les tissus disséqués dans du PBS froid avant de les hacher.
  6. Remettre en suspension du tissu haché avec 1 ml de tampon de digestion, le transfert du tissu dans un tube de 15 ml contenant 2 ml de tampon de digestion, et on incube pendant 30 min dans un bain d'eau à 37 ° C.
    Remarque: Agiter le tube toutes les 10 minutes pour bien mélanger.

3. Subcallosal Zone dérivée Culture Adulte Neural Stem Cell

  1. Appuyez sur le tube légèrement à dissocier le tissu digéré, puis centrifuger le tube à 145 g pendant 5 min. Jeter le surnageant, remis en suspension le tissu digéré avec 1 ml de milieu N2 préchauffé pour laver le tampon de digestion, et pipeter doucement la solution d'échantillon d'un maximum de 5 fois à l'aide d'une pipette P1000.
    Note: Over-triturant avec une étroiteembout pipette peut diminuer la viabilité cellulaire et la croissance ultérieure.
  2. Centrifuger le tube à 145 g pendant 5 min. Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de milieu N2.
  3. Préparer 1 ml de milieu N2 dans une plaque non revêtue de 6 puits et ajouter 1 ml de cellules en suspension pour obtenir un volume final de 2 ml.
  4. Ajouter de l'EGF (20 ng / ml), et bFGF (20 ng / ml) dans chaque puits. Secouer doucement la boîte de culture de 6 puits à la main pour mélanger les facteurs de croissance ajoutés avec les cellules étalées. Gardez la plaque de 6 puits dans un incubateur à CO2 à 37 ° C et 5%.
  5. Ajouter de l'EGF (20 ng / ml), et bFGF (20 ng / ml) à chaque puits tous les jours pendant 8 jours. Le troisième jour, ajouter 200 ul de milieu N2 pour maintenir le volume de 2 ml environ du milieu.

4. Le repiquage de NNC comme neurosphères et aux cultures monocouches

  1. Rassemblez les neurosphères et les transférer dans un nouveau tube conique de 15 ml.
    Note: Le nombre de neurosphères (> 50 um de diamètre) per et de la SCZ d'un cerveau de souris seul était de 64,3 ± 7,31, ce qui était inférieur à celui de la SVZ (190,5 ± 6,33) 9.
  2. Incuber les neurosphères avec 0,5 ml de tampon de dissociation pendant 5 min dans un bain-marie à 37 ° par rapport à dissocier les neurosphères dans des cellules individuelles. neurosphères primaires peuvent être dissociées en cellules individuelles et maintenues sur plusieurs passages comme neurosphères ou monocouche cultures.
    Remarque: Le développement SCZ-aNSCs en monocouche est supérieure à celle neurosphères parce SCZ-aNSCs peuvent être repiquées> 10 fois dans un format de culture en monocouche, mais <5 fois dans un format de culture de neurosphères.
    Attention: SCZ-aNSCs présentent une forte agrégation, et il est difficile de les dissocier en cellules individuelles. Ainsi, le format de la culture de neurosphères est pas recommandé pour l'expansion cellulaire de routine.
  3. pipeter doucement la solution d'échantillon de haut en bas avec une pipette P1000 moins de 5 fois et centrifuger le tube à 145 g pendant 5 min. Jeter le surnageant et re-supasser les neurosphères avec 1 ml de milieu N2.
    Note: Plus triturant avec une pointe de pipette étroite peut diminuer la viabilité cellulaire et la croissance ultérieure.
  4. Pour compter les cellules, faire un mélange 1: 1 de la suspension cellulaire (10 pi) et la solution de bleu de trypan 0,4%, puis compter le nombre de cellules vivantes sur un hémocytomètre. Après le revêtement d' une plaque à 6 puits avec l' OLP / laminine, plaque les cellules à 2,5 x 10 5 cellules / ml avec 2 ml de milieu N2 pour chaque puits.
    Remarque: Les modifications de la densité cellulaire peuvent influer sur leur état et le potentiel de différenciation.
  5. Maintenir les SCZ-aNSCs avec un traitement quotidien des facteurs de croissance (2 ml, 20 ng / ml) pendant 5 jours, et leur passage entre eux.

5. Différenciation des Subcallosal Zone dérivées des cellules souches adultes de neurones

  1. Plaque aNSCs sur une PLO / laminine revêtu 18 mm lamelle couvre -objet avec 1 x 10 5 cellules / ml dans 1 ml de N2 avec des facteurs de croissance (20 ng / ml) pour la différenciation des SCZ-aNSCs.
  2. Le jour suivant,lorsque les cellules sont fermement attachés à la lamelle, échanger le milieu de croissance avec N2 pour éliminer les facteurs de croissance.
  3. Après 6 jours, laver les cellules différenciées avec 1 ml de PBS pour éliminer les débris cellulaires et les fixer pour immunocoloration.
    Remarque: BrdU peut être incorporé dans l'ADN nouvellement synthétisé de cellules proliférantes. Par conséquent, si on le souhaite, la BrdU (10 ug / ml) peut être ajouté aux cellules vivantes avant la fixation des cellules.

6. immunocoloration adulte cellules souches neurales et Differentiated progéniteurs

  1. Pour immunocoloration, laver les cellules avec du PBS et les fixer avec 4% de PFA pendant 20 min à température ambiante.
    Attention: PFA est très toxique; éviter tout contact avec la peau et les yeux.
  2. Retirer les 4% PFA, rincer les cellules fixées avec du PBS 3 fois, puis les stocker à 4 ° Cuntil ils sont nécessaires pour immunocoloration.
  3. Incuber les cellules sur la lamelle couvre-objet avec une solution de blocage (3% de sérum albumine bovine et 0,1% de Triton X-100 dans 1 x PBS) pendant au moins 30 min à température ambiante.
  4. Préparer les anticorps primaires dans une solution de blocage frais et incuber les échantillons pendant une nuit à 4 ° C.
    1. Immunocoloration les aNSCs
      1. Colorer les aNSCs utilisant anti-nestine et des anticorps anti-BrdU. Avant la fixation, ajouter 20 pg de BrdU aux aNSCs et incuber pendant 2 h. Effectuer l'étape de dénaturation à l'aide du HCl 2 N pendant 20 min à 37 ° CAvant effectuer l'étape de blocage.
    2. Immunocoloration les progéniteurs différenciés:
      1. Utiliser l'anti-protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), les anticorps anti-O4, anti-bIII-tubuline, et d'étiqueter les progéniteurs différenciés.
  5. Laver les échantillons avec du PBS 3 fois et de les laisser incuber avec des anticorps secondaires conjugués à des colorants fluorescents (1: 500) dans une solution de blocage pendant 30 min à température ambiante. Ensuite, les échantillons de lavage 3 fois avec du PBS.
    Remarque: Utilisez des anticorps secondaires qui correspondent aux hôtes du primairedes anticorps. Hoechest33343 (1: 2000) est utilisé pour la coloration nucléaire.
  6. Ajouter une solution de montage à une lame de verre et procéder au montage. Observer et l'image de l'échantillon sur un microscope confocal à de multiples longueurs d'onde: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm), et Hoechest33343 (405 nm).

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Résultats

Définition du système de culture pour aNSCs de la région neurogène inconnue est essentielle pour la compréhension de ces cellules et pour le développement de leur utilisation potentielle dans la réparation du cerveau 12. Il est connu que NNC à différents stades de développement ou dans des régions différentes se comportent différemment 3,4. Récemment, il a été rapporté que des cellules dérivées SCZ présentent des potentiels différentiels pour la différenciation neur...

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Discussion

Ce document décrit un protocole détaillé pour générer NNC de la SCZ de souris adulte et de les maintenir pour diverses applications. Il y a trois étapes essentielles pour établir le système in vitro de culture nécessaire pour purifier et développer SCZ-NNC. Tout d' abord, il est important de veiller à ce que la région SCZ est précisément disséqué à partir d' autres régions neurogènes potentiels (figure 1B). Sections épaisses et précises contenant les régions SCZ ont été obtenus avec une...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Programme de recherche sur le cerveau par l’intermédiaire de la Fondation nationale de la recherche (NRF), financé par le ministère coréen des Sciences, des TIC et de la Planification future (subventions NRF-2015M3C7A1028790) ; et par une subvention du Projet coréen de R&D en technologie de la santé par l’intermédiaire de l’Institut coréen de développement de l’industrie de la santé (KHIDI), financé par le ministère de la Santé et du Bien-être, République de Corée (HI14C3347).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
moyens
DMEM/F12  ;Gibco11320-033+L-glutamine, +Bicarbonate de sodium
Pen/StrepInvitrogen15140-122
Supplément N2Gibco17502-048
Supplément B27Gibco17504-044
Facteur de croissance
bFGFR& D233-FB
EGFGibcoPHG0313
Tampon
PBS (10x)BIOSOLUTIONBP007a1x dilution
HBSSGibco14175-095
Tampon de dissociation
Dispase IIRoche04-942-078-001
PapainWorthington3126
AccutaseICTAT-104
Tool
Pince fineWPI555229F
CiseauxStorzE3321-C
Matrice cérébrale (1 mm)RWD68707
Rasoir à double tranchantDORCOST-300
Aiguille 30 GSUNGSHIMN1300
Matériaux
Tubes de 15 mlSPL50015
Tubes de 50 mlSPL50050
Plat de 35 mmSPL10035Boîte de Pétri
Plat de 100 mmSPL10090Boîte de Pétri
Housse (18 mm)Deckglaser111580
Plat 12 puitsSPL32012non revêtement
Plat 6 puitsSPL32006non revêtement
< résistant>Matériaux de revêtement
PLOSigmaP49570.01 %
LamininGibco23017-01510 mg/ml
Anticorps primaires  ;
NestinMilliporeMAB353souris (1:1 000)
EGFRAbcamab2430lapin (1:1 000)
DCXSanta CruzSC8066chèvre (1:500)
Tuj1SigmaT2200lapin (1:2 000)
GFAPInvitrogen13-0300rat (1:1 000)
O4Souris MilliporeMAB345(1:500)
BrdUAbcamab6326Rat (1:500)
Anticorps secondaires
anti-souris 488InvitrogenA212021:500
anti-souris cy3Jackson715-165-151
anti-souris 647Jackson715-606-150
anti-lapin 488AlexaA21206
anti-lapin cy3Jackson711-165-152
anti-lapin 647Jackson711-605-152
anti-chèvre 488AlexaA11055
anti-chèvre cy3Jackson705-165-147
anti-chèvre 647InvitrogenA21447
anti-rat 488InvitrogenA21208
anti-rat cy3Jackson712-166-150
anti-rat 647Jackson712-605-153
Immunostaining materials
BSAMillipore82-100-63 % BSA avec 0.1 % Triton X-100 en PBS
Triton X-100usb22686
4 % PFABiosesangP2031
Hoechest33342Life TechnologyH3570Colorant pour la coloration des noyaux

Références

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