Utilisation de Scaffold Liposomes à Reconstituer interactions protéine-protéine Lipid-proximal In vitro

Résumé

Cet article décrit une méthode d’évaluation des interactions et des assemblages de protéines membranaires intégrales in vitro avec divers facteurs partenaires dans un environnement lipido-proximal.

Résumé

Des études sur les protéines membranaires intégrales in vitro sont souvent compliquées par la présence d'un domaine transmembranaire hydrophobe. Pour compliquer encore ces études, réincorporation des protéines membranaires détergent solubilisé dans des liposomes est un processus stochastique où la protéine topologie est impossible à appliquer. Cet article propose une méthode alternative à ces techniques difficiles qui utilise un échafaudage à base de liposomes. La solubilité des protéines est améliorée par deletion du domaine transmembranaire et les acides aminés sont remplacés par un fragment d'attache, telle qu'une étiquette His. Cette attache coopérant avec un groupe d' ancrage (Ni ²⁺ coordonné par l' acide nitrilotriacétique (NTA (Ni ²⁺⁾⁾ pour les protéines à marquage His), qui applique une topologie de protéine homogène à la surface du liposome. Un exemple est présenté dans lequel l'interaction entre la protéine apparentée à Dynamin-1 (DRP1) avec une protéine membranaire intégrale, le facteur mitochondrial Fission (MFF) est investigated utilisant cette méthode échafaudage liposome. Dans ce travail, nous avons démontré la capacité de MFF de recruter efficacement DRP1 soluble à la surface des liposomes, ce qui a stimulé son activité GTPase. En outre, DRP1 a pu tubulé le modèle lipidique MFF-décoré en présence de lipides spécifiques. Cet exemple démontre l'efficacité des liposomes d'échafaudage en utilisant des analyses structurales et fonctionnelles et met en évidence le rôle de la CFP dans la régulation de l'activité DRP1.

Introduction

L' étude des interactions protéine-protéine membrane proximal est une entreprise difficile en raison de la difficulté à récapitulant l'environnement natif des protéines membranaires intégrales impliquées ^1. Ceci est dû à la nécessité de solubilisation avec un détergent et de l'orientation non uniforme des protéines dans des protéoliposomes. Afin d'éviter ces problèmes, nous avons utilisé une stratégie selon laquelle les domaines solubles de protéines membranaires intégrales sont exprimés sous forme de protéines de fusion His-tag, et ces fragments solubles sont ancrés à des liposomes de l' échafaudage par des interactions avec le NTA (Ni....

Protocole

1. Préparation de liposomes Échafaudage

NOTE: Idéalement, les premières expériences devraient utiliser un échafaudage relativement simple et monotone (composé de DOPC (1,2-dioleoyl- sn - glycéro-3-phosphocholine ou PC) et DGS-NTA (Ni ²⁺⁾ (1,2-dioléoyl - sn - glycéro-3 - [(N - (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacétique) succinyl]. (sel de nickel)) Construction hors de ces expériences, la charge des lipides, la flexibilité et la courbure peut être introduit en tant que facteurs individuels avec la possibilité de modifier les interactions membranaires proximale. Ces modifications peuvent être obtenues en aj....

Résultats

Alors que l'interaction entre DRP1 et MFF a été démontrée comme étant important pour la fission mitochondriale, cette interaction a été difficile à récapituler in vitro. Notre objectif était de mieux émuler l'environnement cellulaire dans lequel DRP1 et MFF interagissent. A cet effet, des liposomes contenant des concentrations de limitation de NTA (Ni ²⁺⁾ , les groupes de tête ont été préparées en réhydratant un film lipidique tel que décrit ci - dessus. La solution l.......

Discussion

Ce protocole offre une méthode pour l'étude des interactions protéine-protéine impliquant des protéines membranaires intégrales. En utilisant un liposome échafaudage modulaire, les chercheurs sont capables d'évaluer l'activité d'une ou plusieurs protéines dans un environnement lipidique proximale. Des études antérieures ont démontré un procédé similaire pour les enzymes des récepteurs de la membrane plasmatique ^24-26. Nous avons élargi cette méthode pour incorporer des co.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Phosphatidylcholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375
Phosphatidylethanolamine (DOPE)	Avanti Polar Lipids	850725
DGS-NTA(Ni2+)	Avanti Polar Lipids	790404
Cardiolipine du cœur bovin (CL)	Avanti Polar Lipids	840012
Chloroform	Acros Organics
Extrudeuse de liposomes	Avanti Polar Lipids	610023
Cu/Rh Negative Stain Grids	Ted Pella	79712
Microfuge Tube	Beckman	357448
GTP	Jena Biosciences	NU-1012
GMP-PCP	Sigma Aldrich	M3509
Microtiter Plate strips	Thermo Scientific	469949
EDTA	Acros Organics	40993-0010
Instant Blue Coomassie Dye	Expedeon	ISB1L
HEPES	Fisher Scientific	BP310
BME	Sigma Aldrich	M6250
KCl	Fisher Scientific	P330
KOH	Fisher Scientific	P250
Chlorure de magnésium	Acros Organics	223211000
4 - 20 % SDS-PAGE Gel	Bio Rad	456-1096
4x Laemmli Loading Dye	Bio Rad	161-0747
HCL	Fisher Scientific	A144S
Malachite Green Carbinol	Sigma Aldrich	229105
Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Sigma Aldrich	A7302
Film de laboratoire	Parafilm	PM-996
Acétate d’uranyle	Polysciences	21447
Tecnai T12 100 keV Microscope	FEI
Optima MAX	Beckman
TLA-55 Rotor	Beckman
CentriVap Concentrateur	Labconico
Mastercycler Pro Thermocycler	Eppendorf
VersaMax Lecteur de microplaques	Dispositifs moléculaires

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