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Summary

Nous présentons ici un protocole pour mesurer la force des interactions entre une surface inorganique bien définie et soit des peptides ou des acides aminés par une seule molécule des mesures de spectroscopie de force au moyen d'un microscope à force atomique (AFM). Les informations obtenues à partir de la mesure est importante pour mieux comprendre le matériau interphase peptide-inorganique.

Abstract

Les interactions entre les protéines ou peptides et des matériaux inorganiques conduisent à plusieurs procédés intéressants. Par exemple, en combinant des protéines avec des minéraux conduit à la formation de matériaux composites ayant des propriétés uniques. En outre, le procédé de l'encrassement biologique indésirable est initiée par l'adsorption des molécules biologiques, principalement des protéines, sur les surfaces. Cette couche organique est une couche d'adhérence pour les bactéries et leur permet d'interagir avec la surface. Comprendre les forces fondamentales qui régissent les interactions à l'interface organique-inorganique est donc important pour de nombreux domaines de la recherche et pourrait conduire à la conception de nouveaux matériaux pour des applications optiques, mécaniques et biomédicales. Ce document démontre une technique de spectroscopie de force une seule molécule qui utilise un AFM pour mesurer la force d'adhérence entre soit des peptides ou des acides aminés et des surfaces inorganiques bien définies. Cette technique implique un protocole de fixation de la molécule biologique à l'AFMpointe à travers une liaison flexible covalente et une seule molécule des mesures de spectroscopie de force par microscope à force atomique. En outre, une analyse de ces mesures est inclus.

Introduction

L'interaction entre les protéines et les minéraux inorganiques conduit à la construction de matériaux composites ayant des propriétés particulières. Cela comprend des matériaux à haute résistance mécanique ou des propriétés optiques uniques. ^{1, 2,} par exemple, la combinaison de la protéine de collagène avec l'hydroxyapatite minérale génère soit des os mous ou durs pour les différentes fonctionnalités. ³ peptides courts peuvent également lier des matériaux inorganiques avec une grande spécificité. ^{4, 5, 6} La spécificité de ces peptides a été utilisé pour la conception de nouveaux matériaux magnétiques et électroniques, ^{7, 8, 9} fabrication des matériaux nanostructurés, croissance de cristaux, ¹⁰ et la synthèse de nanoparticules. ¹¹ Comprendre le mécanisme sous – jacent des interactions entre des peptides ou des protéines et des matières inorganiques va donc nous permettre de concevoir de nouveaux matériaux composites avec l' amélioration des propriétés d' adsorption. En outre, depuis l'interphase des implants avec une réponse immunitaire est médiée par des protéines, une meilleure compréhension des interactions des protéines avec des matériaux inorganiques permettra d'améliorer notre capacité à concevoir des implants. Un autre domaine important qui implique des protéines interagissant avec des surfaces inorganiques est la fabrication de matériaux anti-salissures. ^{12, 13, 14, 15} encrassement biologique indésirable est un processus dans lequel les organismes se fixent sur une surface. Il a de nombreuses conséquences néfastes sur nos vies. Par exemple, l'encrassement biologique des bactéries sur les dispositifs médicaux conduit à des infections nosocomiales. Biofouling des organismes marins sur les bateaux et les grands navires augmente la consommation de carburant. ^{12, 16, 17, 18}

Simple-molécule vigueur spectroscopie (SMFS), en utilisant un AFM, peut directement mesurer les interactions entre un acide aminé ou un peptide avec un substrat. ^{19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26} D' autres méthodes telles que l' exposition sur phage, ^{27, 28} microbalance à cristal de quartz (QCM) ²⁹ ou par résonance plasmonique de surface (SPR) ^{29, 30, 31, 32,}ref "> 33 mesure les interactions des peptides et des protéines à des surfaces minérales en vrac. ^{34, 35, 36} Cela signifie que les résultats obtenus par ces procédés se rapportent à des ensembles de molécules ou d'agrégats. Dans SMFS, un ou très peu de molécules sont fixées à la pointe de l'AFM et de leurs interactions avec le substrat désiré est mesurée. Cette approche peut être étendue à l'étude du repliement des protéines en tirant sur la protéine à partir de la surface. En outre, il peut être utilisé pour mesurer les interactions entre les cellules et les protéines et la liaison des anticorps à leurs ligands. ^{37, 38, 39, 40} Le présent document décrit en détail comment attacher soit des peptides ou des acides aminés à la pointe de l' AFM en utilisant la chimie de silanol. En outre, le document explique comment effectuer les mesures de force et de la façon d'analyser larésultats.

Protocol

1. Astuce Modification Achat de nitrure de silicium (Si 3 N 4) Les cantilevers AFM avec des pointes de silicium (Rayon cantilever nominal de ~ 2 nm). Nettoyez chaque cantilever AFM par trempage dans de l'éthanol anhydre pendant 20 min. Sec à température ambiante. Traiter ensuite les cantilevers en les exposant à plasma O 2 pendant 5 min. Suspendre les pointes propres ci-dessus (3 cm) un contenant méthyltriéthoxysilane de la solution et l'acide 3- (aminopropyl) triéthoxysilane dans un rapport de 15: 1 (v / v) dans un dessiccateur sous une atmosphère inerte (azote ou argon) et connecter le dessicateur une pompe à vide. Sous vide pendant 2 h pour former une monocouche de ces deux types de silanes mixtes. Utilisez un support de pointe métallique (fabriqué pour ce processus) pour placer les conseils sur une plaque chauffante. Puis sécher les conseils pendant 10 minutes à 70 ° C dans des conditions atmosphériques. Avant utilisation, nettoyer la plaque chauffante, support métallique et des pinces en utilisant l'éthanol. Refroidir les conseils de chambre température, puis immerger la pointe dans une solution de fluorénylméthyloxycarbonyle-PEG-N-hydroxysuccinimide (Fmoc-PEG-NHS, poids moléculaire 5000 Da) à une concentration de 5 mM dans du chloroforme contenant 0,5% (v / v) de triéthylamine pendant 1 h à température ambiante. Tremper les conseils dans le chloroforme pendant 5 min, puis le tremper dans du diméthylformamide (DMF) pendant 5 min supplémentaires. Afin de déprotéger le groupe Fmoc des molécules de PEG fixées, tremper les pointes de pipéridine à 20% (v / v) dans du DMF pendant 30 minutes. Tremper les conseils dans le DMF pendant 4 min, puis dans la N-méthyl-2-pyrrolidone (NMP) pour plus de 4 min. Répétez la séquence plongeant trois fois. Pour le couplage d'acides aminés, immerger la pointe dans une solution contenant de l'extrémité N-terminale de l'acide aminé protégé (AA) / diisopropyléthylamine (DIPEA) / 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tétraméthyluronium hexafluophosphate (HBTU), dans un rapport molaire de 1: 1: 1 à une concentration totale de 30 mM dans 5 ml de NMP pendant 1,5 h. Pour le couplage peptidique, tremper les conseils dans une solution suite 5 mlaining 40 mg du peptide protégé (N terminales et des chaînes latérales, par exemple Fmoc-Gln (Trt) -Pro-Ala-Ser (tBu) -Ser (tBu) -Arg (PBF) -Tyr (tBu) -COOH). , 15 mg d'acide 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tétraméthyluronium (HBTU) et 5 ml de DIPEA dans de la NMP pendant 2 h. Tremper les conseils en NMP pendant 4 min. Ensuite, pour protéger l'alésage libre / inaltéré NH 2 par le groupe acétyle, tremper les pointes pendant 30 minutes dans un mélange d'anhydride acétique / DIPEA dans un rapport molaire 4: 1 et une concentration totale de 0,65 M dans de la NMP. Pour le couplage peptidique, effectuer deux étapes supplémentaires. Afin de déprotéger les chaînes latérales du peptide, plonger les conseils dans une solution contenant 95% de TFA, 2,5% triisopropylsilane, et 2,5% d'eau pendant 1 h, puis laver avec du chloroforme et du DMF. Afin d'éliminer le groupe Fmoc du peptide, immerger les pointes dans 20% de pipéridine (v / v) dans du DMF pendant 30 minutes. trempez Séquentiellement le peptide / acide aminé-fonctionnaliserd conseils pour quatre minutes chacun dans du DMF (pour les peptides) ou NMP (pour les acides aminés), le chloroforme, 50% d'éthanol et de l'eau. Enfin sécher la pointe dans l'air. 2. Préparation de la surface Préparer le mica. Cliver les substrats (diamètre 9,9 mm) avant chaque utilisation en utilisant du ruban adhésif. Ensuite, laver les surfaces avec de l'eau distillée triple (TDW). Préparer TiO 2 revêtu de silicone. Découper la plaquette de silicium (100) en carrés de 2 cm à l'aide d'un stylo de diamant. Placer le substrat dans un tube à essai de 15 ml rempli avec de l'acétone et sonication pendant cinq minutes dans un bain à ultrasons. Ensuite, placer cette surface dans un tube à essai de 15 ml rempli avec de l'isopropanol et sonication pendant 5 min. Sécher le substrat en utilisant l'azote. Dissoudre l'agent tensio – actif (par exemple, Byk-348) dans de l' éthanol pour préparer une 5% (poids / volume). Ensuite, ajouter 0,02 ml de la solution d'agent tensio – actif à 2 mL de 30% de TiO 2 la dispersion. De la solution résultante, goutte-cast 0.2 mL sur un substrat Si propre. Recuire ces surfaces d'abandon coulé à 250 ° C pendant 2 h dans l'air. 41 3. molécule unique force Spectroscopie Mesures Fixer la surface souhaitée sur un support métallique de l'AFM disponible dans le commerce avec de la colle à deux composants. Placer le support métallique dans le support en verre de l'AFM, qui est façonnée comme une petite boîte de Pétri. Remplissez ce support avec un tampon Tris (50 mM pH = 7,4) ou tout support souhaité. Ensuite, placez le support sur la scène AFM au-dessous du support de pointe. Calibrer les cantilevers AFM avec des constantes de ressort variant entre 10 et 30 pN / nm , en utilisant la méthode de fluctuation thermique 26 (compris dans le logiciel de l' AFM) avec une incertitude absolue d'environ 10%. Mesurer la force de l'interaction en se rapprochant de l'acide aminé ou le bout peptidique fonctionnalisée sur le substrat jusqu'à ce qu'il soit en contact avec le substrat avec une compressionla force de ~ 200 pN puis rétracter immédiatement la pointe à des vitesses différentes, de 0,1 à 0,8 um / s, pour une distance de ~ 200 nm. Analyse 4. Données Convertir les valeurs de déviation (V) à une force en multipliant la sensibilité de la photodiode (V / m) et en utilisant la constante de ressort déterminée expérimentalement. 42 Ceci est réalisé automatiquement par le logiciel de l' AFM. Pour obtenir des courbes FD avec un des événements de molécule unique, enregistrer plusieurs centaines de courbes (800-1,500). Obtenir deux pics dans une courbe de molécule unique: le premier pic indique que les interactions non spécifiques entre la pointe et la surface, et la deuxième correspond au pic de l'interaction spécifique de la molécule à la surface. Lorsque la courbe FD contiennent plus de ces deux pics, les jeter dans le calcul de la force la plus probable. REMARQUE: les événements d'adhésion Seulement simples sont pris en compte (de 10 à 30% des courbes). 43 <li> Pour calculer le taux de chargement apparent, l' ajustement d' au moins 50 force en fonction des courbes de distance avec la chaîne de ver (WLC) modèle 44 juste avant la rupture pour obtenir un ensemble de taux de charge, qui sont ensuite utilisés pour la préparation d' histogrammes les taux de chargement apparents. Déduire les forces déliaison entre les peptides / acides aminés et de la surface du saut en vigueur après la séparation de la porte à faux à partir du substrat.

Representative Results

Figure 1 présente la procédure de modification de la pointe. Dans la première étape, un traitement au plasma modifie la surface de la pointe de nitrure de silicium. La pointe présente des groupes OH. Ces groupes seront ensuite réagir avec les silanes. A la fin de cette étape, la surface de la pointe sera couverte par les groupes -NH 2 libre. Ces amines libres vont alors réagir avec Fmoc-NHS -PEG, une liaison covalente. Le groupe Fmoc de l'agent de …

Discussion

Les étapes 1.3, 1.4 et 1.7 dans le protocole devrait être effectué avec soin complet et d'une manière très douce. A l'étape 1.3, l'embout ne doit pas être en contact avec le mélange à base de silane et le procédé de silanisation doit être effectuée dans une atmosphère inerte (eau libre). ⁴⁵ Ceci est fait dans le but d'empêcher la formation multicouche et parce que les molécules de silane subissent facilement l' hydrolyse en présence d'humidité. <sup class…

Materials

Silicon nitride (Si3N4) AFM cantilevers with silicon tips	Bruker (Camarilo, CA, USA)		MSNL10, nominal cantilevers radius ~2 nm
Methyltriethoxysilane	Acros Organics (New Jersey, USA)		For Silaylation of the AFM tip
3-(Aminopropyl) triethoxysilane	Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)		Used for tip modification
Triisopropylsilane	Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)		Used for tip modification
N-Ethyldiisopropylamine	Alfa-Aesar (Lancashire, UK)		Used for tip modification
Triethylamine	Alfa-Aesar (Lancashire, UK)		Used for tip modification
Piperidine	Alfa-Aesar (Lancashire, UK)		Used for tip modification
Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide  (Fmoc-PEG-NHS)	Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany)		Used as the covalent flexible linker  (MW = 5000 Da)
2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)	Alfa Aser (Heysham, England)		Used as a coupling reagent.
N-methyl-2-pyrrolidone (NMP)	Acros Organics (New Jersey, USA)		Used as Solvent in Tip modification procedure
DMF (dimethylformamide)	Merck (Darmstadt, Germany)		Used as Solvent in Tip modification procedure
Trifluoro acetic acid (TFA)	Merck (Darmstadt, Germany)
Acetic anhydride	Merck (Darmstadt, Germany)
Peptides	GL Biochem (Shanghai, China).
Phenylalanine and Tyrosine	Biochem (Darmstadt, Germany)
30% TiO2 dispersion in the mixture of solvent 2-(2-Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP)	Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel)		(30%) in the mixture of solvent 2-(2 Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP)
Mica substrates	TED PELLA, INC. (Redding, California, USA)		9.9 mm diameter