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Summary

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Abstract

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Introduction

Les mitochondries sont classiquement décrites comme la centrale cellulaire, car ils sont les principaux sièges de la production d'énergie dans les cellules différenciées. En outre, les mitochondries jouent un rôle essentiel dans le métabolisme, la génération de chaleur, une modification lipidique, le calcium et l' homéostasie redox, l'orchestration des processus de signalisation cellulaire, etc. ^1. Les mitochondries jouent également un rôle actif dans l'induction de la mort cellulaire ^2, ainsi que dans la régulation du cycle cellulaire ^3. Cette multi-fonctionnalité soulève les questions fondamentales suivantes: a) comment les mitochondries remplissent toutes ces fonctions simultanément et b) sont là piscines mitochondriaux spécifiques ou sous-zones qui sont spécialisés pour des fonctions distinctes? Dans ce contexte, il est important de noter que les mitochondries multifonctionnels sont dynamiques dans leur forme, la taille et la structure au sein des cellules individuelles et que la forme à l'état stable des mitochondries peuvent varier entre les types de cellules. Des décennies de recherche de divers laboratoirepatronages suggèrent que la modification de la forme mitochondriale, la taille et la structure, la dynamique collectivement appelées mitochondries, est crucial pour le maintien de diverses fonctions mitochondriales _^4,5,6. Ces résultats soulèvent la possibilité que les mitochondries peuvent accomplir leur multi-fonctionnalité en raison de leur dynamisme structurel.

Des efforts considérables sont en cours pour comprendre la relation structure-fonction mitochondriale. Le dynamisme de la structure mitochondriale est principalement maintenu par leur aptitude à subir une fission et de fusion des événements les uns avec les autres. Fission de grandes mitochondries les convertit en éléments mitochondriales plus petits, tandis que la fusion entre deux mitochondries plus petites les fusionne en un élément mitochondrial plus grande ^7. En outre, la fusion transitoire de deux mitochondries peut se produire pour permettre le mélange de leur contenu. La fission et de fusion événements des membranes mitochondriales interne et externe sont soigneusement régies par les spécificationstib ensembles de protéines. Le mécanisme de base de fission se compose de protéine apparentée à la dynamine-1 (DRP1), qui est recruté dans le cytosol vers la mitochondrie par son interaction avec certains de bonne protéines mitochondriales bonne (par exemple Fis1 ou Mff1), tandis que la fonction DRP1 peut également être régulée par d' autres protéines sur la surface mitochondriale ^4. Bien que DRP1 agit sur la membrane externe, ses capacités de fission impact sur la membrane interne aussi bien. L'orchestration de la fission des membranes mitochondriales externes et internes ne sont pas bien compris. D'un autre côté, la fusion de la membrane interne est régie au coeur par les activités de Opa1, tandis que mitofusins régissent la fusion de la membrane externe ^5. Le solde des produits de fission et fusion contrecarrant événements de mitochondries dicter la forme mitochondriale à l'état stable dans une cellule. Par exemple, la répression de la fission mitochondriale se traduirait par une fusion complète et sans opposition, alors que la sur-activité des mitochondriesl fission se traduirait par une fragmentation des mitochondries ^3.

L'étude de la relation structure-fonction mitochondriale implique principalement deux approches complémentaires: a) l'analyse des phénotypes cellulaires et organismales après la manipulation génétique des protéines fission / fusion mitochondriales et b) des évaluations directes de la structure et la fonction mitochondriale. Il est à noter que les analyses génétiques ne peuvent pas toujours révéler la fonctionnalité directe de la molécule à portée de main (dans ce cas, les protéines fission / fusion mitochondriales), que les phénotypes peuvent survenir en raison d'effets secondaires. Par conséquent, il est de la plus haute importance pour développer et utiliser des outils pour étudier la structure et la fonction mitochondriale directement. Toute évaluation de la structure mitochondriale implique divers outils de microscopie. L'utilisation de la microscopie à fluorescence de cellules vivantes a considérablement avancé les études de la dynamique mitochondriale, car le dynamisme mitochondrial peut être contrôlé à la fois qualitativement et quantitativement en utilisant les outils et techniques ⁸ de microscopie par fluorescence appropriés. Outils de microscopie par fluorescence ont été développées pour étudier la structure et la fonction mitochondriale dans les tissus vivants et fixes Drosophila melanogaster, élucidant l'importance du dynamisme mitochondriale in vivo ^9. Ceux – ci et des procédés associés sont décrits ici, dans le but d'étudier la structure et la fonction mitochondriale dans l'ovaire chez la drosophile.

L'ovaire chez la drosophile est constituée de lignées germinales et somatiques, qui résultent de leurs cellules souches adultes respectives qui se trouvent dans le germarium ^10,11. Seize cellules germinales syncytial (GCS) s'encapsulées par les cellules folliculaires somatiques (FC) pour former des chambres d'œufs individuels qui émergent de l'germarium (Figure 1). L'un des 16 glucocorticoïdes get engagé à devenir un ovocyte, et les 15 restants GCS développent dans les cellules nourricières qui soutiennent la croissance de la chambre de l'ovocyte, Ce qui facilite la maturation de l'œuf avant qu'elle ne soit déposée. La majorité des FC subissent 9 séries de divisions mitotiques avant qu'ils ne quittent le cycle cellulaire mitotique pour différencier terminale dans une couche de cellules épithéliales motif constitué par des cellules antérieure du follicule (AFC), les cellules du follicule postérieur (PFC) et principales cellules du corps (CBM) . Les chambres d'œufs consécutives sont reliées par des cellules de tige, qui sont des cellules qui sont également dérivées des FC au début du développement différenciés. Forme mitochondriale régulée par mitochondrial DRP1 protéine de fission est activement impliquée dans le processus de différenciation au cours du développement normal de la FC couche ovarienne Drosophila ^9,12. Les méthodes utilisées dans ces études pour déterminer l'implication de la drosophile DRP1 développement de la couche de cellules folliculaires sont décrites ici.

Protocol

1. Préparation de la drosophile (les outils nécessaires sont représentés sur la figure 2A) Pour toutes les expériences décrites, recueillir la drosophile (maintenue à la température ambiante, soit 25 ° C) dans les 5 jours de l' éclosion et les placer dans un flacon rempli de 5-7 ml de Drosophila alimentaire (voir tableau des matériaux), avec pas plus de 25 mouches dans chaque flacon; maintenir un sex-ratio de 2: 1. Saupoudrer une petite quantité de levure granulé pour stimuler la production d'œufs de Drosophila. Effectuez la manipulation expérimentale dans les 2 – 4 jours. 2. Dissection de Drosophila Ovaires (les outils nécessaires sont représentés sur la figure 2A) Moyen d'insectes disséquant chaud (voir tableau des matériaux) à la température ambiante, 25 ° C. Remplissez trois puits d'un plat de dissection de verre de huit puits, avec 200 pi de dans chaque milieu ainsi. Anesthetize Drosophila avec CO <sub> 2 en plaçant l'aiguille du pistolet à air sous le bouchon du flacon. Placez-les sur un tapis de mouche. En utilisant un microscope à dissection, sort sur 5 femelles et les placer dans le premier puits de la boîte de dissection. Manipuler une drosophile à un moment où effectuer la microscopie en direct. Tout en regardant à travers l'oculaire du microscope de dissection, séparer le thorax de l'abdomen en utilisant deux paires de pinces. Utilisation de la pince, transférer soigneusement les abdomens dans le deuxième puits du plat. Utilisez une paire de pinces pour maintenir l'abdomen à l'extrémité postérieure, et lentement pousser les ovaires out (ainsi que les autres contenus abdominaux) avec l'autre paire de pinces. Si cette tentative échoue, retirez avec précaution l'exosquelette abdominale en insérant la pince dans l'extrémité antérieure pour libérer les ovaires. Utilisation de la pince, tenir un ovaire individu par l'extrémité postérieure opaque (ie, les oeufs jaune-rempli, stade avancé) et déplacez – le soigneusement à la troisième puits du platpour les taquineries de la traiter pour la microscopie en direct (étape 3) ou pour la fixation d'effectuer immunocoloration (étape 7). taquiner avec précaution la gaine de protection autour des ovaires en balayant une aiguille de taquineries légèrement de la partie postérieure de l'extrémité antérieure de chaque ovaire tout en le tenant par l'extrémité postérieure avec une paire de pinces. REMARQUE: Pour minimiser les dommages pendant les taquineries, pliez la pointe de l' aiguille et de zoomer sur chaque ovaire en augmentant le grossissement du microscope (figure 2A). Teasing devrait être suffisant pour briser la gaine efficace, mais elle doit également être fait avec soin pour préserver l'intégrité des ovarioles. 3. Préparation de Microscopie en direct des tissus REMARQUE: Les outils nécessaires sont représentés sur la figure 2A. Avant Drosophila dissection, préparer polyl-Lysine chambres revêtues. A cette fin, placer deux gouttes de 20 pi de polyl-Lysine (0,1 mg / ml) sur la coverglass (14 mm, n ° 0) d'une boîte de Pétri à fond de verre (35 mm) à une distance raisonnable les uns des autres afin d'éviter la fusion des gouttes. Sécher à l'air les plaques pendant 1 h à 37 ° C et marquer les bords du film polyl-Lysine blanc sur la face inférieure de la plaque avec un marqueur effaçable. NOTE: Le polyl-Lysine revêtu chambres peuvent être conservés à 4 ° C pendant une semaine. Si l'on utilise une chambre revêtue au préalable, amener à la température ambiante avant de commencer la dissection drosophile. Définissez les paramètres de numérisation sur le microscope confocal à faire en sorte que l'échantillon peut être reproduite immédiatement après l'achèvement de la dissection et de montage, comme ci-dessous. Placer un disséqués et taquiné ovaire (étape 2 ci-dessous et colorées, le cas échéant, après l'étape 5) sur une région polyl-Lysine revêtu marqué et la propagation de l'ovaire avec l'aiguille de teasing pour séparer les ovarioles. Déposer une goutte de 10 pi de milieu de dissection des insectes au-dessus de l'ovaire, en veillant à couvrir til zone entière polyl-Lysine-enduit. Couvrir le plat de Pétri. exécuter immédiatement la microscopie confocale de l'échantillon monté à température ambiante. NOTE: Une seule drosophile doit être disséqué, traité et imagée à la fois. En outre, la microscopie ne doit pas être réalisée à 37 ° C, ce qui imitent un environnement de choc thermique pour les tissus de Drosophila. 4. Fluorescence Perte Dans Photoblanchiment (FLIP) Dosage pour évaluer mitochondrial Matrice de continuité REMARQUE: la continuité de la matrice mitochondriale dans une structure mitochondriale fusionnée est créée après la fusion complète des membranes mitochondriales interne et externe suivant une progression à travers les étapes intermédiaires. Fission des mitochondries peut suivre les mêmes étapes , mais dans le sens inverse (figure 3A). FLIP est une méthode semi-quantitative time-lapse en fonction microscopie qui peut être utilisé pour évaluer la continuité de la matrice mitochondriale dans laétat final fusionné ex vivo mitochondries (étapes 3 et 4 sur la figure 3A) dans les ovaires de Drosophila vivantes 9. Le dosage de FLIP est réalisée comme une petite région d'intérêt (ROI) des mitochondries exprimant une molécule fluorescente dans la matrice mitochondriale qui est décolorées à intervalles réguliers (FLIP ROI sur la figure 3A). En conséquence, toute région mitochondrial environnante qui est continue avec le ROI FLIP (ROI expérimentale sur la figure 3A) va perdre le signal en raison de l'échange de molécules dans la matrice mitochondriale continue. Les expériences ont démontré ici FLIP sont réalisées sur la drosophile transgénique exprimant mitoYFP, qui contient la séquence d'adressage mitochondrial de la sous – unité VIII de la cytochrome oxydase humaine marqués avec YFP pour cibler à la matrice mitochondriale sous une forme librement diffusible. Une expérience similaire peut également être réalisée avec le transgène mito-UPAEP mito-GFP, comme indiqué précédemment <sup> 9. Un protocole FLIP similaire peut être utilisé avec une sonde ciblée vers l'espace inter-membrane mitochondriale pour être en mesure de détecter la continuité résultant de la fusion de l'extérieur , mais pas la membrane mitochondriale interne (étape 2 sur la figure 3A). Ouvrez le logiciel d'acquisition d'image sur le microscope confocal et définir les paramètres de numérisation appropriés dans l'onglet "Acquisition" (tableau 1). Cochez la case "séries temporelles", "blanchissement" et "Régions" boîtes pour ouvrir les différents onglets. Mettez les valeurs des paramètres d'acquisition appropriées dans chaque onglet (tableau 1). NOTE: Le sténopé devrait être laissée ouverte, car cette expérience est conçue pour surveiller le signal global de l' ensemble de la population mitochondriale dans des cellules individuelles. Utilisez l'oculaire pour localiser rapidement le champ d'intérêt dans le tissu vivant monté. REMARQUE: Sélectionnez les ovarioles qui sont bien réparties sur le verre-bottomed plat, car la microscopie confocale ne peut pas être effectuée sur ovarioles flottantes. Cliquez sur "live" pour acquérir une image en direct du champ d'intérêt choisi. Cliquez sur "stop" pour arrêter le balayage en direct. Si nécessaire, ajuster les paramètres d'acquisition de telle sorte que le signal fluorescent détecté est en dessous des niveaux de saturation (indiquées par l'absence de pixels rouges lorsque l'option «indicateur de gamme" est cochée), avec l'arrière-plan défini comme indiqué en ajustant les valeurs de décalage. Dessinez un petit retour sur investissement en utilisant l'outil de dessin de Bézier de l'onglet «Régions» pour délimiter la zone de photoblanchiment sur l'image acquise par balayage en direct. NOTE: La taille du ROI devrait être d' environ 20-50% du signal mitochondrial fluorescente totale dans la cellule. Effectuer l'acquisition de l'image en cliquant sur "commencer l'expérience." Quantifier l'intensité de fluorescence en utilisant le propriétaire ou le logiciel open-source (voir MatériauxTableau). Notez le signal moyen du retour sur investissement lorsque le blanchiment répétitif est ciblé (FLIP); ROIs où le blanchiment n'a pas été effectuée dans la même cellule (expérimental); le retour sur investissement d'une autre cellule écrus dans le même champ de vision, pour l'évaluation de blanchiment globale pendant la période expérimentale (blanchissement); et le retour sur investissement sur la zone de fond (arrière-plan). Soustraire le signal d'arrière-plan moyenne obtenue à partir du signal moyen dans les autres régions d'intérêt. Normaliser le signal fluorescent avec le signal initial pré-blanchiment pour la cellule respective. Tracer les données normalisées en utilisant un logiciel de traçage standard. 5. Coloration en direct avec Fluorescent mitochondrial Colorants NOTE: L'état d' équilibre structure et potentiel mitochondrial peuvent être évalués en utilisant des colorants qui intègrent spécifiquement dans les mitochondries dans les cellules vivantes et de tissus. Ovaires vivants Drosophila peuvent être colorées ex vivo avec mitochondrial fluorescenttaches de visualiser les mitochondries, pour évaluer les espèces réactives de l'oxygène mitochondriales (mito-ROS), et d'évaluer le potentiel mitochondrial par unité de masse. Ceci peut être accompli par co-coloration avec l'ester mitochondriale potentiométrique colorant tétraméthylrhodamine d'éthyle (TMRE) et un colorant direct mitochondriale compatible représentant la masse mitochondriale (voir le tableau des matériaux pour les colorants spécifiques). Diluer le stock des taches d'insectes chaud dissection moyen des concentrations de travail finales: tache mitochondrial, 250 nM; TMRE, 50 nM; et mito-ROS tache, 5 uM. Après dissection et taquiner les ovaires après l'étape 2, placer les ovaires dans 200 ul d'une solution de coloration particulière dans un puits d'une plaque de dissection. Incuber pendant 10 min avec le plat couvert par un emballage approprié enveloppé avec du papier d'aluminium pour le protéger de la lumière. Laver les ovaires colorés en les déplaçant soigneusement avec une pince en 3 puits consécutifs containing milieu sans tache. Pour la co-coloration avec TMRE et la tache mitochondriale globale compatible, suivre le protocole ci-dessus pour tacher d'abord avec TMRE puis immédiatement avec la tache mitochondriale globale (sans étapes de lavage entre les deux). Monter les ovaires sur un plat à fond de verre enduit polyl-Lysine suite à l' étape 3 et se préparer pour la microscopie confocale avec les paramètres de numérisation appropriés (tableau 1), en suivant les étapes 4,2-4,4. NOTE: Le signal des colorants incorporés n'a pas duré lors d'une tentative de monter les échantillons colorés dans un milieu de montage. Cochez la case Z-sectionnant pour ouvrir l'onglet. Tournez la molette de mise au point vers le bas de l'échantillon pendant qu'il est en direct numérisé et cliquez sur "définir d'abord» pour définir la Z-partie la plus basse. Faites la même chose tout en déplaçant la roue de mise au point vers l'autre direction pour définir la section supérieure. Effectuer l'acquisition de l'image en cliquant sur "commencer l'expérience." Quantifier l'intensité de fluorescence de fond corrigée des ROIs pour le signal d'arrière-plan et les cellules individuelles (comme dans l'étape 4.7) et tracer les données en utilisant un logiciel de traçage. 6. Génération de DRP1 Null Mosaïques NOTE: La stratégie clonal utilisé ici introduit la protéine fluorescente verte (GFP) séronégatifs clones nuls DRP1 en arrière – plan d'un, phénotypiquement de type sauvage fond GFP-positive qui est hétérozygote génotypique pour la mutation nulle DRP1 9. Choc induite par la cible de reconnaissance de flippase-flippase (FLP-FRT) médiée mitotique recombinaison site-spécifique de chaleur crée des clones homozygotes de l'allèle drpKG03815 fonctionnellement nul. Le génotype de la drosophile portant le mutant DRP1 est drpKG03815 FRT40A / CYO, alors que le génotype portant le FLP choc thermique induite (hsFLP) et le marqueur clonal UbiGFP est hsflp; nls-GFP ubiquitine (UbiGFP) FRT 40A / CYO. Le génotype de la SEprogéniture tionné de la croix entre les génotypes ci-dessus est hsFLP / +; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A. Synchroniser la drosophile pour la collecte vierge en les déplaçant dans de nouveaux flacons de nourriture fraîche tous les 2 à 3 jours. Surveiller les flacons de pupariating quotidiennement afin de recueillir des nouvelles femelles vierges. Collecter, curly-aile femelles vierges rouges aux yeux du génotype mutant DRP1 chaque jour, une fois le matin et une fois le soir, et les placer dans un flacon séparé. En parallèle, la collecte des hommes Drosophila avec des yeux rouges foncés et ailes droites portant hsflp et UbiGFP dans les 5 jours de l' éclosion. Mettre en place une croix en ajoutant les mâles aux femelles vierges avec un sex-ratio de 2: 1. Saupoudrer une petite quantité de levure granulé pour stimuler la production d'œufs. REMARQUE: déplacer avec précaution la drosophile à un nouveau flacon de médias tous les 2 à 3 jours pour augmenter la quantité de descendants et de réduire l' encombrement du flacon. Unesthetize, trier et collecter directement à ailes, progéniture femelle aux yeux rouges dans les 5 jours de l'éclosion. Pour le choc thermique, placez le Drosophila collecté dans des flacons vides avec une petite quantité de levure granulé et un petit, doux essuyez (pour absorber l'humidité pendant le choc thermique). Placer le flacon avec la drosophile dans un bain-marie à 38 ° C pendant 1 h, pour générer des clones de cellules principalement folliculaires et à 37 ° C pendant 1 heure , deux fois par jour (permettant au moins 5 h entre les chocs 2 de la chaleur) pendant 2 jours consécutifs , pour générer à la fois de la lignée germinale et les clones de cellules des follicules. REMARQUE: Assurez – vous que le flacon est complètement immergé dans l'eau jusqu'au niveau du bouchon. Le choc thermique peut rendre immobile la drosophile. Laisser la drosophile de choc thermique pour récupérer pendant 1 h à température ambiante quand ils deviennent mobiles à nouveau. Ajouter les mâles vers les femelles dans la même proportion que dans la croix, et les déplacer vers des flacons frais avec medium saupoudrée avec une petite quantité de levure granulée. Maintenir la drosophile pendant au moins 5 jours. Disséquer les ovaires comme nécessaire pour une expérience en direct ou fixe. NOTE: Ovaires isolés de la drosophile parentale exprimant UbiGFP devraient être utilisés comme témoins négatifs pour confirmer l'induction efficace des clones GFP-négative par le choc thermique. 7. Co-immunocoloration pour la cycline E et mitochondries NOTE: Pour détecter la drosophile cycline E (dCyclinE), nous avons utilisé un anticorps obtenu dans le commerce soulevé spécifiquement contre dCyclinE 9 (voir tableau des matériaux). En tant que marqueur mitochondrial, nous avons utilisé un anticorps dirigé contre l' ATP-B (une sous – unité du complexe ATP synthase mitochondriale) 9. Chaud 4% de paraformaldehyde (PFA) à la température ambiante, 25 ° C. Prudence! Paraformaldéhyde est toxique. NOTE: Après ouverturel'ampoule, PFA doit être conservé à 4 ° C et utilisée dans les 7 jours. En effet, le stockage de PFA peut permettre l'oxydation du methanol, ce qui modifie considérablement les membranes mitochondriales lors de la fixation, même si elles sont présentes en quantités infimes. Immédiatement après la dissection, fixer les ovaires disséqués en les plaçant dans 200 ul de frais PFA dans un puits d'un plat de dissection de verre (sans les taquineries). Gardez le plat dans une hotte pendant 15 min. Laver les ovaires fixes en les déplaçant soigneusement avec la pince dans 3 puits successifs, chacun contenant 200 pi de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). NOTE: L'expérience peut être arrêté ici et les échantillons peuvent être laissés à 4 ° C pendant 1 jour. Tease les ovaires de manière plus approfondie dans du PBS (similaire à l'étape 2.6) Retirez délicatement la gaine fibreuse de protection qui peuvent entraver l'accès de l'antigène par l'anticorps. Perméabiliser les ovaires taquiné en les plaçant dans un tube microfuge de 500 ul de 0 fraîchement préparés.5% de PBS-Triton-X100 (PBS-TX) et incuber pendant 30 min tout en l'agitant à 25 tours par minute. NOTE: Au cours de la bascule, placez les tubes parallèles au mouvement de bascule; les placer perpendiculairement peut permettre au tissu à coller sur le bouchon des tubes, ce qui entraîne une perte tissulaire. Pour retirer le PBS-TX, placer les tubes à centrifuger dans un rack pour permettre au tissu de s'installer au fond des tubes. Inspecter visuellement et appuyez sur les tubes, si nécessaire, d'apporter tous les tissus flottants vers le bas. Aspirer soigneusement la solution à partir du haut, en veillant à ce que le tissu au niveau du fond des tubes reste intacte. Bloquer les ovaires par addition de 200 ul de 2% de sérum-albumine bovine (BSA) à 0,5% dissous dans du PBS-TX, et laisser incuber sur la bascule à la température ambiante pendant 1 h. Retirer l'agent de blocage en suivant l'étape 7.5. Ajouter des anticorps primaires dans 200 ul d'agent de blocage frais: anti-anticorps de lapin dCyclinE (1: 100) et anti-souris de l'ATP-B anticorps(1: 100). Incuber les tissus sur le basculeur pendant 2 h à température ambiante. Laver les ovaires avec du PBS-TX 3 fois pendant 15 min chacun, après l'étape 7.5. Ajouter 200 ul d'anticorps secondaires appropriés dans du PBS frais TX: anti-souris-Cy3 (1: 1000) et anti-lapin-CY5 (1: 500). Incuber sur le basculeur pendant 1 h à température ambiante. Laver les ovaires avec du PBS-TX 3 fois pendant 15 min chacun, après l'étape 7.5. Pour colorer l'ADN, ajouter Hoechst (1: 1000 dilution) pour le lavage final PBS-TX. Enfin, laissez le tissu dans 500 ul de PBS 1x. En utilisant une micropipette de 1 ml, enlever les ovaires immunocolorées du tube microfuge dans un nouveau puits d'un plat de dissection de verre contenant 200 pi de PBS. Ajouter une goutte de milieu de montage à base de glycérol sur une lame de verre et ajouter les ovaires immunocolorée un par un au support de montage. REMARQUE: Assurez – vous que les ovaires sont en effet transférés vers le milieu de montage. A défaut de le faire so mènera à la perte de tissu. Tout en regardant à travers le microscope de dissection, arrache délicatement les ovarioles transparents (jeunes stades) des chambres d'oeufs matures opaques à l'aide de l'aiguille taquin tout en maintenant la partie opaque de l'ovaire avec la pince. Retirez les chambres d'oeufs matures à partir du support de montage. Placer une lamelle (22 mm, n ° 1) sur la diapositive et appuyez légèrement pour faire en sorte que le moyen de montage est répartie uniformément en dessous. NOTE: En appuyant sur la lamelle assure également l'alignement correct du tissu le long de la lamelle. A défaut de le faire de façon optimale peut permettre aux petites étapes de flotter dans le milieu de montage, ce qui empêche la microscopie optimale de ces tissus. Air-sécher les échantillons pendant 15 minutes et sceller les bords de la lamelle soigneusement avec du vernis à ongles. Effectuer la microscopie confocale selon le besoin expérimental (tableau 1).

Representative Results

Les procédés décrits peuvent être utilisés pour étudier la structure et la fonction mitochondriale dans les ovaires vivants et fixes de Drosophila (figure 2B). Pourvu quelques exemples de résultats escomptés obtenus avec les méthodes décrites. Dissection de l'ovaire chez la drosophile: Lorsque disséqué en outre, les abdomens sectionnés (figure 3…

Discussion

Étapes critiques dans le Protocole

Photobleaching: Prévention photoblanchiment excessive des échantillons fluorescents est absolument nécessaire à l'exécution efficace de la microscopie confocale. Par conséquent, le temps utilisé pour localiser des échantillons à travers l'oculaire ou pour définir les paramètres d'acquisition d'image à travers le mode de balayage en direct devrait être réduit au minimum afin de minimiser photoblanchiment.

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Materials

Grace's Media (Insect Dissecting Medium)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ	Electronic Microscopy Sciences	50-259-99
Mitotracker Green (overall mitochondrial stain)	Life Technologies	m7514	Reconstitute and Aliquot
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate	Sigma Aldrich	87917-25MG	Reconstitute and Aliquot
MitoSox (Mito-Ros stain)	Life Technologies	m36008	Reconstitute and Aliquot
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
Fly Vials	Fisher Scientific	AS-515
Fly Conicals	Fisher Scientific	AS-355
Fly Vial Flugs	Fisher Scientific	AS273
Fly Conical Flugs	Fisher Scientific	AS 277
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)	Fisher Scientific	AS153
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9647-50G
Cyclin E Antibody (d-300)	Santa Cruz	sc- 33748
ATPB antibody [3D5] – Mitochondrial Marker	AbCam	ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-175-144
Hoechst	Fisher Scientific	H3570
VectaShield	Fisher Scientific	H100
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides	Fisher Scientific	22-026-252
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-B
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
Active Dried Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Confocal Microscope	Carl Zeiss	LSM 700
Dumont #5 Forceps	Fine Science Technologies	11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Technologies	26016-12
Minutien Pins	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly Pad	Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Blowgun needle	Flystuff	54-119
Dissecting Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000
Analyses software	Carl Zeiss	Zen
Analyses software	Open source	Image J
Research Macro Zoom Microscope	Olympus	MVX10
QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono	QImaging	QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1	QImaging